Abstract
Hier tonen we een eenvoudige werkwijze voor de snelle productie van grootte regelbaar, monodisperse, W / O microdruppels met een capillair-gebaseerde centrifugale microfluïdische apparaat. W / O microdruppeltjes zijn onlangs gebruikt krachtige methoden die het mogelijk maken geminiaturiseerde chemische experimenten. Daarmee wordt de ontwikkeling van een veelzijdige werkwijze ter verkrijging monodisperse W / O microdruppels nodig. We hebben een werkwijze voor het monodisperse W / O microdruppels op basis van een capillair gebaseerde centrifugaal assymmetrische co-flowing microfluïdische apparaat ontwikkeld. Gelukt het regelen van de omvang van de microdruppeltjes door aanpassing van de capillaire opening. Onze methode vereist apparatuur die gemakkelijker te gebruiken dan bij andere microfluïdische technieken, vereist slechts een klein volume (0,1-1 ul) van de monsteroplossing voor inkapseling, en maakt de productie van honderdduizenden aantal W / O microdruppeltjes per seconde . Wij verwachten dat deze methode zal biologische studies dat kostbare biologische s nodig te helpenamples door behoud van de volume van de monsters voor snelle kwantitatieve analyse biochemische en biologische studies.
Introduction
W / O microdruppeltjes 1-5 hebben vele belangrijke toepassingen voor de studie van de biochemie en biotechnologie, waaronder eiwitsynthese 6, 7 eiwitkristallisatie, emulsie PCR 8,9, celinkapselende 10 en constructie van kunstmatige celachtige systemen 5,6. W / O microdruppeltjes voor deze toepassingen produceren belangrijke criteria zijn controle grootte en monodispersibility van het W / O microdruppels. Microfluïdische inrichtingen voor het maken monodisperse, grootte regelbaar W / O microdruppeltjes 11 zijn gebaseerd op de co-stromende 12,13 methode, flow scherpstelmethode 14,15, en de T-splitsing werkwijze 16 in microkanalen. Hoewel deze werkwijzen produceren sterk monodisperse W / O microdruppeltjes, de microfabrication proces vereist ingewikkelde hantering en gespecialiseerde technieken voor de bereiding van microkanalen en vereist ook een grote hoeveelheid monsteroplossing (ten minste enkele honderden81; l) vanwege de onvermijdelijke dode volume in de spuit pompen en buizen die de monsteroplossing om de microkanalen te voeren. Aldus wordt een eenvoudig te gebruiken en laag dood volume methode om monodisperse genereren W / O microdruppels nodig.
Dit document, samen met video experimentele procedures, beschrijft een centrifugale capillair-gebaseerde co-assymmetrische flowing microfluïdische apparaat 17 voor het genereren van cel-sized, monodisperse W / O microdruppels (figuur 1). Deze eenvoudige methode realiseert grootte monodispersiteit en grootte beheersbaarheid. Het vereist slechts een tabletop mini-centrifuge en een capillair basis assymmetrische-co stroomt microfluïdische apparaat in een sampling microbuis vast. Onze methode heeft slechts een zeer klein volume (0,1 ui) en geen significante volume van het monster afval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van een capillair-gebaseerde microfluïdische apparaat
- Opzetten van de houders
Opmerking: De houder ontwerp is weergegeven in figuur 2A.- Knip elk van de vier schijven van de houders (Figuur 2A (i) - (iv)) van 2 mm dikke polyacetaal kunststof plaat met een freesmachine. Gebruik de volgende afmetingen voor elk van de vier schijven van de houder: (i) disc 1 8,5 mm diameter, capillaire opening (CH) diameter 1,3 mm, schroefgat (SH) diameter 1,8 mm; (Ii) 2 disc diameter 8,7 mm, 2,0 mm diameter CH, SH diameter 1,8 mm; (Iii) 3 disc diameter 8,7 mm, diameter 0,5 mm CH, SH diameter 1,8 mm; en (iv) 4 disc diameter 9,1 mm, diameter 1,0 mm CH, SH diameter van 1,8 mm.
- Monteer de houders met behulp van M2 × 40 schroeven (Figuur 2B). Een onderste gedeelte van de houder (figuur 2B) uit de schijf 1 en de schijf 2 in figuur 2A (i), (ii) en een bovenste gedeelte (Figure 2B) van de houder uit de schijf 3 en de schijf 4 in Figuur 2A (iii), (iv).
- Om het onderste deel van de houder te construeren, steek de schroef in drie SH van elke schijf 1 en 2. Kort de schroeven door knijpen een stuk van de draad gedeelte. Houd de lengte van schroef 0,9 cm (dezelfde lengte als het bodemdeel van de houder).
- Om het bovenste deel van de houder te bouwen, plaatst u schroeven in de twee SH van elke schijf 3 en 4. Verkort de schroeven door knijpen een stuk van de draad gedeelte. Houd de lengte van schroef 0,7 cm (dezelfde lengte als het bovenste gedeelte van de houder).
- Om de houder te monteren, lid worden van de bodem en de bovenste delen van de houder met behulp van een lange schroef.
Opmerking: Bewaar de lengte van elk deel van de houder exact: het onderste deel is 0,9 cm; het bovenste deel is 0,7 cm (figuur 2B).
- Fabricage van de glazen capillairen
- Gebruik twee soorten glas capillairen: een binnenste glazen capillair (buitendiameter (OD) / binnendiameter (ID): 1,0 / 0,6 mm) en een buitenste glazen capillair (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
- Gebruik een glassnijder naar de buitenste glas capillaire verdelen in drie gelijke delen, en gebruik vervolgens de glassnijder aan de binnenste glazen capillair verdelen in twee gelijke stukken.
- Verscherpen elk verdeeld binnenste en buitenste glas haarvaten met behulp van een glazen capillair trekker (figuur 3A). Stel het gewicht van de trekker bij max. Stel de hitte niveau van de trekker op 60 graden voor de buitenste glazen capillair en 70 graden voor de binnenste capillair. verscherpen de glazen capillair zorgvuldig.
- Houd de lengte van de punt binnen het versmalde gedeelte van de glazen capillair de binnenste capillair 1,5-1,8 cm; de buitenste capillair 0,8-1,0 cm (figuur 3C). Als deze lengte korter of langer is dan de beschreven lengte, past u de warmte niveau van de trekker.
- Fix de binnenste of buitenste glas haarvaten van de microforge staan met tape (Figuur 3B).
- Snij het uiteinde van de glazen capillair met de microforge in drie stappen (Figuur 3B): (i) raakt de punt van de glascapillair om de glasparels op een platinadraad, (ii) verwarm het platinadraad van stappen op een voet schakelaar voor 1-2 seconden, en (iii) na 1-2 sec, afgesneden uiteinde van de glazen capillair door koelen de platinadraad.
- Stel de diameters van de binnenste (d i) en buitenste (d o) capillaire openingen, respectievelijk. De openingsdiameter van de binnenruit capillair 5, 10 en 20 pm (d = i 5,10, 20 pm) en de buitenste glazen capillair (d o) is 60 urn (d o = 60 pm) in dit experiment.
Opmerking: Het glas capillair is voor eenmalig gebruik. Herhaal de vervaardiging van de glazen capillaireies.
- Stel de diameters van de binnenste (d i) en buitenste (d o) capillaire openingen, respectievelijk. De openingsdiameter van de binnenruit capillair 5, 10 en 20 pm (d = i 5,10, 20 pm) en de buitenste glazen capillair (d o) is 60 urn (d o = 60 pm) in dit experiment.
2. Procedure voor het genereren W / O microdruppeltjes
- Vul een buitenste glas capillair met oliehoudend surfactant. Het mengsel van olie en oppervlakteactieve hexadecaan bevattende 2% (w / w) sorbitanmonooleaat in dit experiment (figuur 4A).
Opmerking: Er zijn vele combinaties van oliën en oppervlakteactieve stoffen (bijvoorbeeld oliën kunnen gefluoreerd of koolzuurhoudend zijn, ionische surfactanten, niet-ionische of fluorchemische zijn).- Pipetteer 10 gl bevattende hexadecaan sorbitanmonooleaat in een buitenste glazen capillair. In figuur 4A is de openingsdiameter van de buitenste glazen capillair (d o) is 60 urn (d o = 60 pm). Om de opening van het glazen capillair aan te passen, terug te stappen 1.2.4-1.2.5.
- Stel de buitenste capillair in het onderste deel van de houder (figuur 4B).
- Draw ongeveer 0,1 gl van een waterige oplossing in een binnenste glazen capillair (figuur 4C) door capillaire werking. In figuur 4C, de openingsdiameter van binnenruit capillair (d i) 10 urn (d i = 10 pm). Om de opening van het glazen capillair aan te passen, terug te stappen 1.2.4-1.2.5.
- Stel de binnenste capillair in het bovenste deel van de houder (figuur 4D-a). Plaats de binnenste capillair in de buitenste capillair (Figuur 4D-a). Kijkend naar de witte stip cirkel zoals in figuur 4D-een, op de positie van de binnenste capillair in de buitenste capillair (inwendige diameter van de buitenste capillair (w) = 130 urn) (Figuur 4D-b, c) met een digitale microscoop . De positie van de binnenste capillair in de buitenste capillair moet op w = 100-150 urn.
Opmerking: Om de positie van de innerlijke veranderingcapillaire in de buitenste capillaire, schakel dan de schroef in het bovenste deel van de houder. Daardoor kan de afstand w nauwkeurig worden geregeld. - Introduceren 100 gl bevattende hexadecaan sorbitanmonooleaat (2% w / w) in de bodem van een 1,5 ml monster microbuis. Installeer de houder met de binnenste en buitenste capillairen in het monster microbuis (Figuur 4E-a). Zorg ervoor dat de buitenste capillaire controleren om het weg te houden van de lucht-olie-interface (Figuur 4E-b).
- Centrifuge het monster microbuisjes met een tabletop swingende-out-type mini-centrifuge bij een gewicht van 1.600 g gedurende 1-2 sec om microdruppels te genereren (Figuur 4F). Voer alle experimenten bij RT.
Opmerking: Gebruik een swingende-out-type centrifuge. Een druppel kan botsen met een zijwand van het monster microbuis en desintegreren wanneer vaste-hoek-centrifuge wordt gebruikt. - trekken langzaam de W / O druppeltjes met een pipet, en dan, leg ze op een glazen slide.
- Maak foto's van de microdruppels gegenereerd met behulp van een digitale microscoop (vergroting, 200X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie presenteren we een eenvoudige methode voor het genereren van cel-sized W / O microdruppels met een capillaire gebaseerde centrifugale microfluïdische inrichting (figuur 1). Het microfluïdische apparaat bestond uit een capillaire houder (figuur 2B), twee glazen capillairen (binnenste en buitenste glazen capillairen in figuur 3C), en een microbuis met een olie zoals surfactant. We ingespoten 0,1 ul van het monster oplossing in de binnenste glazen capillair en plaatste de binnenste glazen capillaire in de buitenste glas capillair (figuur 4D). Cel-sized W / O microdruppels werden gegenereerd door Plateau-Rayleigh instabiliteit van een jetting-stroom monsteroplossing 17 (Figuur 1B) en was stabiel gedurende tenminste 2 uur 17.
Typische voorbeelden van de verschillende groottes van W / O microdruppels gegenereerd uit de capillaire-based centrifugale microfluïdische apparaat worden getoond in figuur 5. Figuur 5A-C toont het digitale microscopiebeelden en grootteverdeling histogrammen (n = 200) van de W / O microdruppels. De W / O microdruppels werden gegenereerd met een inwendige capillair met een d i = 5 (A, B), 10 (C, D) of 20 urn (E, F) openingsdiameter terwijl d o en w constant op 60 urn en 115 um respectievelijk. De metingen van de grootte van de gegenereerde W / O microdruppels werden verkregen door analyse van de microscoop beeld verkregen van. Voor de d i = 5, 10, en 20 urn openingen, de gemiddelde diameter van de microdruppels was 8,3 urn (standaarddeviatie (SD) 0,9 pm, de variatiecoëfficiënt (CV) 10,8%), 12,7 urn (SD 1,1 urn, CV 8,6%) en 17,9 urn (SD 1,4 urn, CV 7,8%) respectievelijk. Deze resultaten geven aan dat we met succes verkregen monodisperse W / O microdroplets door de voorgestelde methode. Bovendien is de W / O microdruppels diameters waren bijna hetzelfde als de inwendige capillaire opening (Figuur 5G). Zo is de gemiddelde grootte van de W / O microdruppels kan eenvoudig worden afgestemd over een breed bereik, typisch 5 tot 20 urn, met de micro-inrichting.
Figuur 1. Overzicht van centrifugaal-capillaire gebaseerde assymmetrische co-flowing microfluïdische apparaat en de vorming van W / O microdruppeltjes met het apparaat. (A) Illustratie van de centrifugaal-capillaire gebaseerde assymmetrische co-flowing microfluïdische apparaat en werkwijze genereren W / O microdruppels ( binnen cirkel), (B) w / O microdruppeltjes gegenereerd door Plateau-Rayleigh instabiliteit van een stroming jetting waterige oplossing 17, d i openingsdiameter van binnenruit capillair d ois de opening diameter van innerlijke glazen capillaire, w inwendige diameter van de buitenste capillair, (C) foto gefabriceerde apparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Instellen van de capillaire houder (A) Ontwerp van de capillaire houder gemaakt van polyacetaal kunststof. De eenheid van diameters in de houder is mm. (B) Foto's van de houder bestaan uit een bovenste deel en een onderste deel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Stroomschema van de microfluïdische apparaat set-up en het genereren van W / O microdruppels. (A) Bereiding van de buitenste capillair. Olie met oppervlakteactieve ingebracht in de buitenste capillair, (B) Buitenste capillair geplaatst in het onderste gedeelte van de houder (C) Bereiding van de binnenste capillair Waterige oplossing Dr.baard in een binnenste capillair van capillariteit, (D) Inner capillair geplaatst in het bovenste deel van de houder (a). Controleren of de binnenste capillair was in de buitenste capillair met een digitale microscoop (b, c), (E) Houder met binnenste en buitenste capillairen in de monsterbuis (a) geïnstalleerd. Controleren of de buitenste capillair uit de buurt van de lucht-olie-interface werd gehouden, (F) Tenslotte werd het monster microbuis gecentrifugeerd door een tabletop swingende-out-type mini-centrifuge. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Vorming van monodisperse cel-sized W / O microdruppels. Digitale microscoop beelden en grootteverdeling histogrammen (n = 200) van de gegenereerde microdruppels gebruik haarvaten van verschillende diameter, d i = 5 (A, B), 10 (C, D) en 20 urn (E, F), (G) Correlatie tussen de openingsdiameter van het glazen capillair en de diameter van de gegenereerde W / O microdruppeltjes . Fout balken geven de standaarddeviatie van de diameter van de gegenereerde W / O microdruppels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gebruik van dit apparaat de monodisperse W / O microdruppels werden gegenereerd door Plateau-Rayleigh instabiliteit van een jet-stroom 17. Microscopisch onderzoek niet de aanwezigheid van volgdruppels niet onthullen. Bij de vervaardiging van de inrichting, drie kritische stappen zijn essentieel voor succesvol genereren monodisperse W / O microdruppels. Enerzijds een rechte oliestroom die oppervlakteactieve stof en een waterige oplossing te leveren, moet de capillaire openingen van vier schijven aangebracht in een concentrisch patroon. Ten tweede, werd de binnenste capillair voorzichtig ingebracht in de buitenste capillaire vanwege de punt van de capillaire makkelijk breekt indien deze de bovenste houder. Deze operatie kan moeilijk zijn, dus we raden het gebruik van een vergrootglas. Tenslotte, teneinde een jetting stroming waterige oplossing 17 maakt de positie van de binnenste capillair in de buitenste capillair moet op w = 100-150 urn. Als de grootteverdeling van W / O microdruppeltjes gegenereerd door centrifugale microfluidic apparaat is niet monodispers, controleer dan de positie van de binnenste capillair in de buitenste capillair. Om de positie van de binnenste capillair in de buitenste capillaire te wijzigen, schakelt u de schroef in het bovenste deel van de houder. Daardoor kan de afstand w nauwkeurig worden geregeld.
Om monodisperse W / O microdruppels maken, zijn er huidige beperkingen. Er is moeite zou kosten de centrifugale waarde (indien nodig), omdat alle experimenten in de studie werden bij de maximale centrifugale snelheid van de desktop centrifuge. Bovendien druppeltje generatie moeilijk uit verschillende monsteroplossingen, de beperking afhankelijk is van de centrifuge ontwerp. Multi-barrelled capillairen de binnenste capillair kan de ingekapselde microdruppels verschaffen van verschillende combinaties van materialen en oplossingen 18.
De microfluïdische apparaat heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van conventionele microkanaal methoden: i) easy en robuuste fabricage, en ii) de in slechts een klein volume (0,1 pl) van de monsteroplossing. Ten eerste, de vervaardiging van de capillaire gebaseerde centrifugaal assymmetrische co-flowing microfluïdische inrichting is eenvoudig en robuust. Alleen dunne haarvaten, een capillair houder, en een monster microbuisjes zijn verplicht. De fabricage is 5-10 minuten voor het apparaat. Fabricage van de inrichting neemt minder tijd in vergelijking met de vervaardiging van andere microfluïdische apparaat. Bovendien is de capillaire houder is robuust en kan worden hergebruikt. Daarom is de enige verbruiksgoederen de glazen capillairen en microbuis monster in de inrichting, waardoor het minder duur dan andere microfluïdische systemen maakt. Tenslotte, aangezien de olie en waterige stromen geproduceerd door centrifugaalkracht, was er geen verspilde volume. 1-2 sec, genereert de inrichting een groot aantal microdruppels.
Microdruppels zijn ideale kandidaten om high-throughput experimenten met kleine hoeveelheden van het monster solutio uit te voerenn. Met dit apparaat is het theoretisch mogelijk om honderdduizenden 10-um-sized microdruppeltjes per seconde van 0,1 ul van de monsteroplossing genereren. Dus het apparaat voorziet met waardevolle biologische monsters door het minimaliseren van het volume van de voor snelle kwantitatieve analyse monsters. Dit apparaat kan gebruikt worden om biochemische reacties 6-9 en eencellige enzymatische reacties 10 analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
- Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F.
- Huebner, A., et al.
- Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
- Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
- Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
- Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
- Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
- He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R.
- Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502 (2007).
- Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
- Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
- Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
- Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
- Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).
