Abstract
Qui, dimostriamo un metodo semplice per la produzione rapida di, monodisperse, W microgocce / O size-controllabile mediante un dispositivo di microfluidica centrifuga capillare-based. microgocce W / O sono stati recentemente utilizzati in potenti metodi che consentono miniaturizzazione esperimenti chimici. Pertanto, lo sviluppo di un metodo versatile per cedere monodisperse W è necessario / O microgocce. Abbiamo sviluppato un metodo per generare monodisperse W microgocce / O basato su un dispositivo assialsimmetrici centrifuga capillare basata co-scorre microfluidica. Siamo riusciti a controllare la dimensione delle microgoccioline regolando l'orifizio capillare. Il nostro metodo richiede un'attrezzatura che è più facile da usare rispetto ad altre tecniche di microfluidica, richiede solo una piccola quantità (0,1-1 ml) di soluzione campione per incapsulamento, e consente la produzione di centinaia di migliaia numero di microgocce / O W al secondo . Ci aspettiamo che questo metodo vi aiuterà studi biologici che richiedono prezioso s biologicoamples conservando il volume dei campioni per una rapida biochimica analisi quantitativa e studi biologici.
Introduction
W / O microgocce 1-5 avere molte applicazioni importanti per lo studio della biochimica e bioingegneria, tra cui la sintesi proteica 6, proteine cristallizzazione 7, emulsione PCR 8,9, incapsulamento della pila 10, e la costruzione di sistemi simili alle cellule artificiali 5,6. Per produrre microgocce W / O per queste applicazioni, criteri importanti sono il controllo della dimensione e monodispersibility delle microgocce W / O. Dispositivi microfluidici per fare monodisperse, dimensioni controllabili W / O microgocce 11 sono basati sul metodo di co-flowing 12,13, metodo flow-focalizzazione 14,15, e il metodo T-svincolo 16 in microcanali. Sebbene questi metodi producono altamente monodisperse microgocce / O W, il processo di microfabbricazione richiede una gestione complicata e tecniche specializzate per la preparazione di microcanali, e richiede anche una grande quantità di soluzione campione (almeno diverse centinaia81; l) a causa del volume morto inevitabili nelle pompe a siringa e tubi che conducono la soluzione campione microcanali. Così, un metodo di facile utilizzo e basso volume morto per generare monodisperse W è necessario / O microgocce.
Questo documento, insieme a video di procedure sperimentali, descrive un dispositivo di centrifuga capillare basata assialsimmetrici co-scorre microfluidica 17 per la generazione di cellule di dimensioni, monodisperse W / O microgocce (Figura 1). Questo semplice metodo raggiunge monodispersity dimensioni e controllabilità dimensioni. Si richiede solo un mini-centrifuga da tavolo e un dispositivo di co-scorre assialsimmetrici capillare basata microfluidica fissa in un microtubo di campionamento. Il nostro metodo necessita solo un volume molto piccolo (0,1 mL), e non perde volume significativo del campione.
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Protocol
1. Realizzazione di un dispositivo a microfluidi capillare basata
- Impostare dei titolari
Nota: Il disegno del supporto è presentato in Figura 2A.- Tagliare ciascuno dei quattro dischi dei titolari (Figura 2A (i) - (iv)) da 2 mm di spessore piatto di plastica poliacetale utilizzando una fresatrice. Utilizzare le seguenti dimensioni per ciascuna delle quattro dischi del titolare: (i) il disco 1 di diametro 8,5 millimetri, foro capillare (CH) di diametro 1.3 mm, quindi foro vite (SH) di diametro 1,8 millimetri; (Ii) il disco 2 di diametro 8,7 millimetri, diametro CH 2,0 millimetri, diametro SH 1,8 millimetri; (Iii) il disco 3 di diametro 8,7 millimetri, diametro CH 0,5 mm di diametro SH 1,8 millimetri; e (iv) disco 4 di diametro 9,1 millimetri, CH diametro di 1,0 mm, diametro SH 1,8 millimetri.
- Montare i supporti utilizzando M2 × 40 viti (Figura 2b). Una parte inferiore del supporto (Figura 2B) consiste del disco 1 e il disco 2 nella Figura 2A (i), (ii) e una parte superiore (Figure 2B) del titolare consiste del disco 3 e il disco 4 nella Figura 2A (iii), (iv).
- Per costruire la parte inferiore del supporto, inserire la vite in tre SH di ciascun disco 1 e 2. accorciare le viti nipping un pezzo della porzione di filo. Mantenere la lunghezza della vite a 0.9 cm (la stessa lunghezza della parte inferiore del supporto).
- Per costruire la parte superiore del supporto, inserire le viti nelle due SH di ciascun disco 3 e 4. accorciare le viti nipping un pezzo della porzione di filo. Mantenere la lunghezza della vite a 0.7 cm (la stessa lunghezza della parte superiore del supporto).
- Per assemblare il supporto, unire le parti inferiore e superiore del supporto con una lunga vite.
Nota: Mantenere la lunghezza del ogni parte del titolare esatta: la parte inferiore è 0,9 cm; la parte superiore è di 0,7 cm (Figura 2B).
- Fabbricazione dei capillari di vetro
- Utilizzare due tipi di capillari di vetro: un capillare di vetro interno (diametro esterno (OD) / diametro interno (ID): 1,0 / 0,6 mm), ed un capillare di vetro esterno (OD / ID: 2,0 / 1,12 millimetri).
- Utilizzare una taglierina di vetro per dividere il capillare di vetro esterna in tre parti uguali, e quindi utilizzare la taglierina di vetro di dividere il capillare di vetro interno in due pezzi uguali.
- Contrasta ogni capillari di vetro interno ed esterno divise con un estrattore capillare di vetro (Figura 3A). Impostare il peso del tirante a max. Impostare il livello di calore del estrattore a 60 gradi per il capillare di vetro esterno e 70 gradi per il capillare interno. affinare con cautela il capillare di vetro.
- Mantenere la lunghezza della punta all'interno della parte ristretta del capillare di vetro: il capillare interno è 1.5-1.8 cm; il capillare esterno è 0,8-1,0 cm (Figura 3C). Se questa lunghezza è più breve o più lungo della lunghezza descritto, regolare il livello di calore del tirante.
- Fix i capillari di vetro interno o esterno al microforge stare con del nastro (Figura 3B).
- Tagliare la punta del capillare di vetro usando l'microforge in tre fasi (Figura 3B): (i) toccare la punta del capillare di vetro alle perline di vetro su un filo di platino, (ii) riscaldare il filo di platino camminando su un piede interruttore per 1-2 sec, e (iii) dopo 1-2 sec, tagliare la punta del capillare di vetro raffreddando il filo di platino.
- Regolare i diametri del interno (d i) ed esterno (d o) orifizi capillari, rispettivamente. Il diametro dell'orifizio del capillare vetro interno è 5, 10 e 20 micron (d i = 5,10, 20 micron) e l'esterno capillare di vetro (d o) è 60 micron (d o = 60 micron) in questo esperimento.
Nota: Il capillare di vetro è monouso. Ripetere la fabbricazione del capillare di vetroi.
- Regolare i diametri del interno (d i) ed esterno (d o) orifizi capillari, rispettivamente. Il diametro dell'orifizio del capillare vetro interno è 5, 10 e 20 micron (d i = 5,10, 20 micron) e l'esterno capillare di vetro (d o) è 60 micron (d o = 60 micron) in questo esperimento.
2. Procedura per microgocce Generazione w / o
- Riempire un capillare di vetro esterna con tensioattivi di olio contenente. La miscela di olio e tensioattivo è esadecano contenente 2% (w / w) sorbitan monooleato in questo esperimento (Figura 4A).
Nota: Ci sono molte combinazioni di oli e tensioattivi (per esempio, gli oli possono essere fluorurato o gassata; tensioattivi possono essere ionici, non ionici o fluorochimico).- Introdurre 10 ml di esadecano contenenti monooleato in un capillare di vetro esterna. Nella figura 4A, il diametro dell'orifizio del capillare vetro esterno (d o) è di 60 micron (d o = 60 micron). Per regolare l'orifizio del capillare di vetro, tornare a passi 1.2.4-1.2.5.
- Impostare il capillare esterno nella parte inferiore del supporto (Figura 4B).
- Draw circa 0,1 ml di una soluzione acquosa in un capillare di vetro interno (Figura 4C) per azione capillare. In Figura 4C, il diametro dell'orifizio del capillare di vetro interno (d i) è di 10 micron (d i = 10 micron). Per regolare l'orifizio del capillare di vetro, tornare a passi 1.2.4-1.2.5.
- Impostare il capillare interna nella parte superiore del supporto (Figura 4D-a). Inserire il capillare interna nel capillare esterno (Figura 4D-a). Guardando il punto bianco cerchio come nella Figura 4D-a, osservare la posizione del capillare interna all'interno del capillare esterno (diametro interno del capillare esterno (w) = 130 micron) (Figura 4D-b, c) utilizzando un microscopio digitale . La posizione del capillare interna nel capillare esterno deve essere impostato w = 100-150 micron.
Nota: Per cambiare la posizione della internocapillare nel capillare esterno, disattivare la vite nella parte superiore del supporto. In tal modo, la distanza w può essere controllato con precisione. - Introdurre 100 ml di esadecano contenenti monooleato di sorbitano (2% w / w) nel fondo di una provetta da 1,5 ml di campione. Installare il supporto, con i capillari interne ed esterne, nel campione microtubo (Figura 4E-a). Assicuratevi di controllare il capillare esterno per tenerlo lontano dall'interfaccia aria-olio (Figura 4E-b).
- Centrifuga provetta campione utilizzando un tavolo oscillante-out di tipo mini-centrifugare a un peso di 1.600 g per 1-2 secondi per generare microgocce (Figura 4F). Eseguire tutti gli esperimenti a temperatura ambiente.
Nota: utilizzare un oscillante-out-tipo centrifuga. Una goccia può collidere con una parete laterale della provetta campione e disintegrano quando si utilizza un angolo di tipo fisso centrifuga. - Lentamente redigere il W / O goccioline tramite una pipetta, e poi, metterli su un vetro slide.
- catturare immagini delle microgocce generati utilizzando un microscopio digitale (ingrandimento, 200X).
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Representative Results
In questo studio, presentiamo un metodo semplice per la generazione di microgocce W / O cellulari dimensioni utilizzando un dispositivo microfluidico centrifuga capillare basata (Figura 1). Il dispositivo microfluidico era composto da un supporto capillare (Figura 2B), due capillari di vetro (vetro capillari interno ed esterno in Figura 3C), e un microtubo contenente un olio compreso tensioattivo. Abbiamo iniettato 0,1 ml di soluzione di campione nel capillare di vetro interno e mise il capillare di vetro interno nel capillare di vetro esterna (Figura 4D). Microgocce W / O cellule dimensioni sono stati generati da Plateau-Rayleigh instabilità di un getto-flusso di soluzione campione 17 (Figura 1B) e risultano stabili per almeno 2 ore 17.
Tipici esempi di diverse dimensioni W / O microgocce generati dal capillare-based dispositivo microfluidica centrifuga sono mostrati in Figura 5. Figura 5A-F mostra le immagini di microscopia digitali e istogrammi di distribuzione dimensioni (n = 200) delle microgocce W / O. Le microgocce W / O sono stati generati utilizzando un capillare interno con d i = 5 (A, B), 10 (C, D), o 20 micron (E, F) diametro dell'orifizio mantenendo d o e w costante a 60 micron e 115 micron, rispettivamente. Le misure della dimensione delle microgocce generati W / O sono stati acquisiti mediante analisi dell'immagine del microscopio ottenuta. Per il d i = 5, 10, e 20 micron orifizi, i diametri medi delle microgocce erano 8,3 micron (deviazione standard (SD) 0,9 micron, coefficiente di variazione (CV) 10,8%), 12,7 micron (SD 1,1 micron, CV 8,6%), e 17,9 micron (SD 1,4 micron, CV 7,8%), rispettivamente. Questi risultati indicano che abbiamo ottenuto con successo monodisperse W microdrople / Ots nel metodo proposto. Inoltre, i diametri microdroplet W / O erano quasi lo stesso come quello interno capillare orifizio (Figura 5G). Così, la dimensione media delle microgocce W / O può essere facilmente regolato in un ampio intervallo, tipicamente da 5 a 20 micron, usando il micro dispositivo.
Figura 1. Panoramica axisymmetric co-scorre dispositivo microfluidica e la formazione di microgocce / O W utilizzando il dispositivo. (A) Illustrazione capillare basata centrifuga della centrifuga capillare basata assialsimmetrici co-scorre dispositivo microfluidica e di generazione di processo W / microgocce O ( all'interno del cerchio), (B) W microgocce / O generati da Plateau-Rayleigh instabilità di un flusso di getto di soluzione acquosa 17, d i è il diametro dell'orifizio del capillare di vetro interno, d oè diametro dell'orifizio del capillare vetro interno, w è diametro interno del capillare esterno, (C) Fotografia di dispositivo fabbricato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Installazione del titolare capillare (A) Design del titolare capillare di plastica poliacetale:. L'unità di diametri nel supporto è di mm. (B) le fotografie del titolare sono costituite da una parte superiore ed una parte inferiore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Diagramma di flusso del dispositivo microfluidico set-up e la generazione di microgocce W / O. (A) Preparazione del capillare esterno. Olio con tensioattivi introdotto nel capillare esterno, (B) capillare esterno impostato nella parte inferiore del supporto, (C) Preparazione del capillare interno: soluzione acquosa drawn in un capillare interna per capillarità, (D) interno capillare fissato nella parte superiore del supporto (a). Controllando che il capillare interna era nel capillare esterno utilizzando un microscopio digitale (b, c), (E) Supporto con capillari interne ed esterne installate nel tubo campione (a). Controllare che il capillare esterno è stato tenuto lontano dall'interfaccia aria-olio, (F) Infine, microtube campione è stato centrifugato da un tavolo oscillante-out di tipo mini-centrifuga. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Formazione di microgocce w / o cellulari di dimensioni monodisperse. Immagini microscopio digitale e distribuzione dimensione istogrammi (n = 200) di microgocce generato utilizzando capillari di vario diametrometri, d i = 5 (A, B), 10 (C, D), e 20 micron (E, F), (G) Correlazione tra il diametro dell'orifizio del capillare di vetro ed il diametro delle microgocce generato W / O . Le barre di errore indicano le deviazioni standard del diametro delle microgocce W / O generate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'utilizzo di questo dispositivo, il monodisperse W microgocce / O sono stati generati da Plateau-Rayleigh instabilità di un jet-flusso 17. L'esame microscopico non ha rivelato la presenza di goccioline satellitari. Nella fabbricazione del dispositivo, tre passi critici sono essenziali per generare successo monodisperse microgocce / O W. Innanzitutto, per fornire un flusso rettilineo di tensioattivo contenente olio e soluzione acquosa, i fori capillari di quattro dischi devono essere disposte in un modello concentrica. In secondo luogo, il capillare interno è stato accuratamente inserito nel capillare esterno perché la punta del capillare si rompe facilmente se viene a contatto con il supporto superiore. Questa operazione può essere difficile, quindi si consiglia di utilizzare una lente di ingrandimento. Infine, al fine di realizzare un getto-flusso della soluzione acquosa 17, la posizione del capillare interna nel capillare esterno deve essere impostato w = 100-150 micron. Se la distribuzione delle dimensioni delle microgocce W / O generato dal microfono centrifugadispositivo rofluidic non è monodisperse, verificare la posizione del capillare interno nel capillare esterno. Per cambiare la posizione del capillare interna nel capillare esterno, accendere la vite nella parte superiore del supporto. In tal modo, la distanza w può essere controllato con precisione.
Per rendere monodisperse microgocce / O W, ci sono delle limitazioni attuali. C'è difficoltà di aumentare il tasso di centrifuga (se necessario) per tutti gli esperimenti nello studio sono state eseguite alla velocità centrifuga massima della centrifuga desktop. Inoltre, la generazione di goccioline è difficile da una varietà di differenti soluzioni campione, la limitazione essendo dipendente dal disegno centrifuga. Capillari Multi-canna come capillare interna può fornire le microgocce incapsulati da varie combinazioni di materiali e soluzioni 18.
Il dispositivo di microfluidica ha due vantaggi principali rispetto ai metodi convenzionali microcanali: i) easy e fabbricazione robusta, e ii) il requisito di solo un piccolo volume (0,1 ml) della soluzione campione. In primo luogo, la fabbricazione del dispositivo axisymmetric centrifuga capillare basata co-scorre microfluidica è semplice e robusto. Solo sono tenuti capillari sottili, un supporto capillare e una provetta del campione. Il tempo di fabbricazione è 5-10 min per il dispositivo. Fabbricazione del dispositivo richiede meno tempo rispetto alla fabbricazione di un altro dispositivo microfluidico. Inoltre, il titolare capillare è robusto e può essere riutilizzato. Pertanto, gli unici materiali di consumo sono i capillari di vetro e microprovetta campione nel dispositivo, che lo rende meno costoso di altri sistemi microfluidici. Infine, dato che i flussi di petrolio e acquose sono state prodotte dalla forza centrifuga, non vi era alcun volume sprecata. Per 1-2 sec, il dispositivo genera un gran numero di microgocce.
Microgocce sono candidati ideali per effettuare esperimenti di high-throughput che coinvolgono piccole quantità di campione solution. Con questo dispositivo, è teoricamente possibile generare centinaia di migliaia di microgocce 10 micron di dimensioni al secondo da 0,1 ml della soluzione campione. Così, il dispositivo ospita lavorare con preziosi campioni biologici minimizzando il volume dei campioni necessari per l'analisi quantitativa rapida. Questo dispositivo può essere utilizzato per analizzare le reazioni biochimiche 6-9 e monocellulari reazioni enzimatiche 10.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
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