Abstract
Aquí, demostramos un método simple para la producción rápida de tamaño controlable, monodispersas, W microgotas de E / S utilizando un dispositivo de microfluidos centrífuga basada en capilar. microgotas W / O se han utilizado recientemente en poderosos métodos que permiten miniaturizados experimentos químicos. Por lo tanto, el desarrollo de un método versátil para dar monodispersa W / O se necesita microgotas. Hemos desarrollado un método para generar monodisperso W microgotas de E / S sobre la base de un dispositivo de co-fluye de revolución centrífuga basada en capilar de microfluidos. Hemos tenido éxito en el control del tamaño de las microgotas ajustando el orificio capilar. Nuestro método requiere un equipo que es más fácil de usar que con otras técnicas de microfluidos, requiere sólo un pequeño volumen (0,1 a 1 l) de solución de muestra para la encapsulación, y permite la producción de cientos de miles número de W microgotas de E / S por segundo . Esperamos que este método ayudará a los estudios biológicos que requieren preciosa s biológicaejemplos de la conservación del volumen de las muestras para la rápida bioquímica análisis cuantitativo y estudios biológicos.
Introduction
W / O microgotas 1-5 tienen muchas aplicaciones importantes para el estudio de la bioquímica y la bioingeniería, incluyendo la síntesis de proteínas 6, 7 de cristalización de proteínas, emulsión PCR 8,9, encapsulación de células 10, y la construcción de sistemas similares a células artificiales 5,6. Para producir microgotitas W / S para estas aplicaciones, criterios importantes son el control de tamaño y monodispersibility de las microgotitas W / O. Los dispositivos microfluídicos para hacer monodispersa, tamaño controlable W / O microgotitas 11 se basan en el método de co-fluye 12,13, método de enfoque de flujo de 14,15, y el método de unión en T 16 en microcanales. Aunque estos métodos producen microgotas W / O altamente monodispersas, el proceso de microfabricación requiere un manejo complicado y técnicas especializadas para la preparación de microcanales, y también requiere una gran cantidad de solución de muestra (al menos varios cientos81; l) debido al volumen muerto inevitable en las bombas de jeringa y tubos que conducen la solución de muestra a los microcanales. Por lo tanto, un método fácil de usar y de bajo volumen muerto para generar monodispersa W / O se necesita microgotas.
Este documento, junto con vídeos de los procedimientos experimentales, se describe un dispositivo de centrífuga a base de capilar de revolución co-fluye microfluidos 17 para la generación de tamaño celular, monodisperso W / O microgotas (Figura 1). Este sencillo método logra monodispersidad tamaño y capacidad de control de tamaño. Requiere sólo una mesa de mini-centrifugadora y un dispositivo de co-fluye de revolución basada en capilares de microfluidos fija en un microtubo de muestreo. Nuestro método sólo se necesita un volumen muy pequeño (0,1 l), y no pierde volumen significativo de la muestra.
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Protocol
1. La fabricación de un dispositivo para microfluidos basada en Capilar
- Puesta en marcha de los titulares
Nota: El diseño de soporte se presenta en la Figura 2A.- Cortar cada uno de los cuatro discos de los titulares (Figura 2A (i) - (iv)) a partir de 2 mm de espesor placa de plástico de poliacetal usando una máquina de molienda. Utilice las siguientes dimensiones para cada uno de los cuatro discos del titular: (i) 1 disco de diámetro 8,5 mm, agujero capilar (CH) de diámetro 1,3 mm, el agujero del tornillo (SH) de diámetro 1,8 mm; (Ii) el disco 2 mm de diámetro 8.7, CH diámetro de 2,0 mm, 1,8 mm de diámetro SH; (Iii) el disco 3 mm de diámetro 8.7, CH 0,5 mm de diámetro, diámetro de 1,8 mm SH; y (iv) del disco 4 de diámetro 9,1 mm, CH diámetro 1,0 mm, diámetro 1,8 mm SH.
- Montar los soportes que utilizan M2 x 40 tornillos (Figura 2B). Una parte inferior del soporte (Figura 2B) consiste en el disco 1 y el disco 2 en la Figura 2A (i), (ii) y una parte superior (Fig2B ure) del soporte consiste en el disco 3 y el disco 4 en la Figura 2A (iii), (iv).
- Para construir la parte inferior del soporte, inserte el tornillo en tres SH de cada disco 1 y 2. Acortar los tornillos mediante el pinzado de un pedazo de la porción de rosca. Mantener la longitud de tornillo a 0.9 cm (la misma longitud que la parte inferior del soporte).
- Para construir la parte superior del soporte, insertar tornillos en los dos SH de cada disco 3 y 4. Acortar los tornillos mediante el pinzado de un pedazo de la porción de rosca. Mantenga la longitud del tornillo de 0,7 cm (la misma longitud que la parte superior del soporte).
- Para montar el soporte, unir las partes de fondo y superior del soporte usando un tornillo largo.
Nota: Mantenga la longitud de la parte de cada titular exacta: la parte inferior es de 0,9 cm; la parte superior es de 0,7 cm (Figura 2 B).
- La fabricación de los capilares de vidrio
- Utilizar dos tipos de capilares de vidrio: una capilares de vidrio interior (diámetro externo (OD) / diámetro interior (ID): 1,0 / 0,6 mm), y un capilar de vidrio exterior (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
- Utilice un cortador de vidrio para dividir el capilar de vidrio exterior en tres partes iguales, y luego usar el cortador de vidrio para dividir el capilar de vidrio interior en dos partes iguales.
- Afilar cada uno capilares de vidrio interior y exterior dividido utilizando un extractor capilar de vidrio (Figura 3A). Ajuste el peso del extractor en el máximo. Establecer el nivel de calor del extractor a 60 grados para el capilar de vidrio exterior y 70 grados durante el capilar interior. afilar con cuidado el capilar de vidrio.
- Mantenga la longitud de la punta dentro de la parte estrecha del capilar de vidrio: el capilar interior es 1.5-1.8 cm; el capilar exterior es 0,8-1,0 cm (Figura 3C). Si esta longitud es más corta o más larga que la longitud se describe, por favor, ajuste el nivel de calor del extractor.
- Fix los capilares de vidrio interior o exterior a la microforge destacan el uso de cinta (Figura 3B).
- Corte la punta del capilar de vidrio utilizando la microforge en tres etapas (Figura 3B): (i) toque la punta del capilar de vidrio de las perlas de vidrio en un alambre de platino, (ii) calentar el alambre de platino por pisar un pie cambiar durante 1-2 segundos, y (iii) después de 1-2 segundos, cortar la punta del capilar de vidrio mediante el enfriamiento del alambre de platino.
- Ajuste los diámetros del interior (d i) y exterior (d o) orificios capilares, respectivamente. El diámetro del orificio del capilar de vidrio interior es 5, 10, y 20 micras (d i = 5,10, 20 m) y el capilar de vidrio exterior (d O) es de 60 micras (d o = 60 micras) en este experimento.
Nota: El capilar de vidrio es desechable. Repita la fabricación del capilar de vidrioIES.
- Ajuste los diámetros del interior (d i) y exterior (d o) orificios capilares, respectivamente. El diámetro del orificio del capilar de vidrio interior es 5, 10, y 20 micras (d i = 5,10, 20 m) y el capilar de vidrio exterior (d O) es de 60 micras (d o = 60 micras) en este experimento.
2. Procedimiento para la generación de microgotas W / O
- Llenar un capilar de vidrio exterior con surfactante aceite que contiene. La mezcla de aceite y surfactante es hexadecano que contiene 2% (w / w) monooleato de sorbitán en este experimento (Figura 4A).
Nota: Existen muchas combinaciones de aceites y agentes tensioactivos (por ejemplo, los aceites pueden ser fluorado o carbonatada; tensioactivos pueden ser iónicos, no iónicos, o fluoroquímico).- Introducir 10 l de hexadecano que contiene monooleato de sorbitán en un capilar de vidrio exterior. En la Figura 4A, el diámetro del orificio del capilar de vidrio exterior (d O) es de 60 micras (d o = 60 micras). Para ajustar el orificio del capilar de vidrio, volver a los pasos 1.2.4-1.2.5.
- Ajuste el capilar exterior en la parte inferior del soporte (Figura 4B).
- draW sobre 0,1 l de una solución acuosa en un capilar de vidrio interior (Figura 4C) por acción capilar. En la Figura 4C, el diámetro del orificio de capilar de vidrio interior (d i) es de 10 micras (d i = 10 m). Para ajustar el orificio del capilar de vidrio, volver a los pasos 1.2.4-1.2.5.
- Ajuste el capilar interior en la parte superior del soporte (Figura 4D-a). Insertar el capilar interior en el capilar exterior (Figura 4D-a). Mirando el círculo punto blanco como en la Figura 4D-a, observar la posición del capilar interior dentro del capilar exterior (diámetro interno del capilar exterior (w) = 130 m) (Figura 4D-b, c) usando un microscopio digital . La posición del capilar interno en el capilar exterior debe estar ajustado a W = 100 a 150 micras.
Nota: Para cambiar la posición del interiorcapilar en el capilar exterior, por favor gire el tornillo en la parte superior del soporte. De este modo, la distancia w puede ser controlada con precisión. - Introducir 100 l de hexadecano que contiene monooleato de sorbitán (2% w / w) en la parte inferior de un microtubo de 1,5 ml de la muestra. Instale el soporte, con los capilares interiores y exteriores, en el microtubo muestra (Figura 4E-a). Asegúrese de revisar el capilar exterior para mantenerlo alejado de la interfaz aire-aceite (Figura 4E-b).
- Se centrifuga la muestra de microtubo utilizando una mesa de tipo tirándole mini centrífuga a una densidad de 1.600 g durante 1-2 segundos para generar microgotas (Figura 4F). Llevar a cabo todos los experimentos a temperatura ambiente.
Nota: Utilice una centrífuga de tipo tirándole. Una gotita puede chocar con una pared lateral del microtubo muestra y se desintegran cuando se utiliza una centrífuga de tipo de ángulo fijo. - Lentamente elaborar el documento W / O gotitas mediante una pipeta, y luego, ponerlos en un vaso slide.
- Capturar imágenes de las microgotas generados usando un microscopio digital (magnificación de 200X).
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Representative Results
En este estudio, se presenta un método simple para la generación de microgotas W / S de tamaño de células mediante el uso de un dispositivo para microfluidos de centrífuga basada en capilar (Figura 1). El dispositivo microfluídico se compone de un soporte capilar (Figura 2B), dos capilares de vidrio (capilares de vidrio interior y exterior en la Figura 3C), y un microtubo que contiene un aceite que incluye tensioactivo. Se les inyectó 0,1 l de solución de la muestra en el capilar de vidrio interior y colocamos el capilar de vidrio interior en el capilar de vidrio exterior (Figura 4D). Microgotas W / S de células de tamaño se generaron por Plateau-Rayleigh inestabilidad de un chorro de flujo de solución de muestra 17 (Figura 1B) y fueron estables durante al menos 2 hr 17.
Los ejemplos típicos de los diferentes tamaños de W / O microgotas generan a partir de los capilares-based dispositivo para microfluidos de centrífuga se muestra en la Figura 5. Figura 5A-F muestra las imágenes de microscopía digitales y los histogramas de distribución de tamaño (n = 200) de las microgotas W / O. Las microgotas W / S se generaron usando un capilar interior con una d i = 5 (A, B), 10 (C, D), o 20 micras (E, F) diámetro del orificio, manteniendo d oy constante w a 60 micras y 115 micras, respectivamente. Las mediciones de tamaño de las microgotas de E / S generados W fueron adquiridos por análisis de la imagen de microscopio obtenida. Para el d i = 5, 10, y 20 micras orificios, los diámetros medios de las microgotitas eran 8,3 m (desviación estándar (SD) 0,9 m, el coeficiente de variación (CV) 10,8%), 12,7 m (SD 1,1 micras, CV 8,6%) y 17,9 micras (SD 1,4 m, 7,8% CV), respectivamente. Estos resultados indican que se obtuvo con éxito monodisperso W microdrople / Ots por el método propuesto. Además, los diámetros de microgotas W / S eran casi el mismo que el orificio capilar interior (Figura 5G). Por lo tanto, el tamaño medio de las microgotitas W / O fácilmente se puede ajustar en un amplio rango, típicamente de 5 a 20 micras, utilizando el dispositivo de micro.
Figura 1. Descripción general de co-fluye dispositivo de microfluidos y la formación de microgotas W / S utilizando el dispositivo. (A) Ilustración de revolución basada en capilar centrífuga de la centrífuga a base de capilar de revolución co-fluye dispositivo de microfluidos y de generación de proceso de W / O microgotas ( dentro del círculo), (B) W microgotas de E / S generadas por Plateau-Rayleigh inestabilidad de un flujo de chorro de solución acuosa 17, d i es el diámetro del orificio de capilar de vidrio interior, d oes el diámetro del orificio del capilar de vidrio interior, w es el diámetro interno del capilar exterior, (C) Fotografía del dispositivo fabricado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Configuración de soporte capilar (A) Diseño del soporte del capilar de plástico poliacetal:. La unidad de diámetros en el soporte es mm. (B) Las fotografías del titular consisten en una parte superior y una parte inferior. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Diagrama de flujo del dispositivo para microfluidos de la configuración y la generación de W microgotas de E / S. (A) Preparación de capilar exterior. Aceite con tensioactivos introducidos en el capilar exterior, (B) capilar exterior fijado en la parte inferior del soporte, (C) Preparación del capilar interno: solución acuosa drAWN en un capilar interno por capilaridad, capilar (D) interior configurado en la parte superior del soporte (a). La comprobación de que el capilar interior estaba en el capilar exterior usando un microscopio digital (b, c), (E) Holder con capilares interior y exterior instalados en el tubo de muestra (a). Comprobación de que el capilar exterior se mantuvo alejado de la interfaz aire-aceite, (F) Por último, microtubo muestra fue centrifugada por una mesa de tipo tirándole mini-centrifugadora. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. La formación de microgotas W / O de tamaño de células monodispersas. Imágenes de microscopio digital y la distribución del tamaño de los histogramas (n = 200) de microgotas generados utilizando capilares de diferentes diametros, d i = 5 (A, B), 10 (C, D), y 20 micras (E, F), (G) La correlación entre el diámetro del orificio del capilar de vidrio y el diámetro de las microgotitas generado W / O . Las barras de error muestran las desviaciones estándar del diámetro de las microgotas W / S generadas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El uso de este dispositivo, el monodisperso W / O microgotas fueron generados por Plateau-Rayleigh inestabilidad de un chorro de flujo 17. El examen microscópico no reveló la presencia de gotitas satélite. En la fabricación del dispositivo, tres pasos críticos son esenciales para generar con éxito microgotas W / O monodispersas. En primer lugar, para suministrar un flujo lineal de aceite que contiene tensioactivo y la solución acuosa, los orificios capilares de cuatro discos deben estar dispuestos en un patrón concéntrico. En segundo lugar, el capilar interior se insertó cuidadosamente en el capilar exterior debido a que la punta del capilar se rompe fácilmente si entra en contacto con el soporte superior. Esta operación puede ser difícil, por lo que recomendamos el uso de una lupa. Por último, con el fin de hacer un chorro de flujo de solución acuosa 17, la posición del capilar interno en el capilar exterior debe estar ajustado a W = 100 a 150 micras. Si la distribución del tamaño de las microgotas W / S generada por micro centrífugarofluidic dispositivo no es monodispersa, comprobar la posición del capilar interno en el capilar exterior. Para cambiar la posición del capilar interno en el capilar exterior, por favor, girar el tornillo en la parte superior del soporte. De este modo, la distancia w puede ser controlada con precisión.
Para hacer microgotas W / O monodispersas, existen limitaciones actuales. Hay dificultad en el aumento de la tasa de centrífuga (si es necesario), porque todos los experimentos en el estudio se realizaron en la tasa de centrífuga máxima de la centrífuga de escritorio. Además, la generación de gotas es difícil a partir de una variedad de diferentes soluciones de muestra, siendo dependiente en el diseño de centrífuga de la limitación. Capilares Multi-cañón como el capilar interno puede proporcionar las microgotitas encapsulados de varias combinaciones de materiales y soluciones 18.
El dispositivo de microfluidos tiene dos principales ventajas frente a los métodos convencionales de microcanales: i) easy y fabricación robusta, y ii) el requisito de sólo un pequeño volumen (0,1 l) de la solución de muestra. En primer lugar, la fabricación del dispositivo de co-fluye de revolución centrífuga basada en capilar de microfluidos es simple y robusto. Sólo se requieren capilares finas, un soporte capilar, y un microtubo muestra. El tiempo de fabricación es de 5-10 min para el dispositivo. La fabricación del dispositivo de toma menos tiempo en comparación con la fabricación de otro dispositivo de microfluidos. Por otra parte, el soporte capilar es robusto y se puede reutilizar. Por lo tanto, los únicos consumibles son los capilares de vidrio y microtubo muestra en el dispositivo, lo que hace que sea menos costoso que otros sistemas de microfluidos. Finalmente, puesto que los flujos de aceite y acuosa fueron producidos por la fuerza centrífuga, no había volumen perdido. Para 1-2 seg, el dispositivo genera un gran número de microgotas.
Las microgotas son candidatos ideales para llevar a cabo experimentos de alto rendimiento que implican pequeñas cantidades de muestra de solunorte. Con este dispositivo, es teóricamente posible generar cientos de miles de microgotas 10-micras de tamaño por segundo de 0,1 l de la solución de muestra. Así, el dispositivo tiene capacidad para trabajar con muestras biológicas preciosos reduciendo al mínimo el volumen de las muestras necesarias para el análisis cuantitativo rápido. Este dispositivo puede ser utilizado para analizar las reacciones bioquímicas de 6-9 y una sola célula de las reacciones enzimáticas 10.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
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