Abstract
Hier zeigen wir, ein einfaches Verfahren zur schnellen Herstellung von größen steuerbaren, monodisperse, W / O-Mikrotröpfchen eine Kapillare basierten zentrifugalen Mikrofluidvorrichtung. W / O-Mikrotröpfchen wurden kürzlich in leistungsfähige Methoden verwendet worden, die chemische Experimente miniaturisierten ermöglichen. Um daher eine vielseitige Methode entwickeln monodisperse zu ergeben W / O-Mikrotröpfchen erforderlich ist. Wir haben ein Verfahren zur Erzeugung von monodispersen W / O-Mikrotröpfchen auf Basis eines Kapillar-basierten Kreisel axialsymmetrischen co fließenden Mikrofluidik-Vorrichtung entwickelt. Es gelang uns, die Größe der Mikrotröpfchen durch Steuern der Kapillaröffnung einzustellen. Unser Verfahren erfordert Geräte, die einfacher zu bedienen ist als bei anderen Mikrofluidtechniken benötigt nur ein kleines Volumen (0,1-1 & mgr; l) der Probenlösung für die Kapselung und ermöglicht die Herstellung von Hunderttausenden Anzahl von W / O-Mikrotröpfchen pro Sekunde . Wir erwarten, dass diese Methode biologische Untersuchungen helfen, die wertvollen biologischen s erfordernspiele, indem das Volumen der Proben für die schnelle quantitative Analyse biochemischen und biologischen Untersuchungen bewahren.
Introduction
W / O-Mikrotröpfchen 1-5 haben viele wichtige Anwendungen für die Untersuchung der Biochemie und Biotechnologie, einschließlich Proteinsynthese 6, Proteinkristallisation 7, Emulsion PCR 8,9, Zellverkapselung 10 und Konstruktion künstlicher zellenartigen Systemen 5,6. W / O-Mikrotröpfchen für diese Anwendungen, wichtige Kriterien sind Kontrolle der Größe und Monodispersibilität der W / O-Mikrotröpfchen zu erzeugen. Mikrofluidik-Vorrichtungen zur Herstellung von monodispersen, Größe steuerbare W / O-Mikrotröpfchen 11 werden auf der Basis der Co-fließenden Verfahren 12,13, Fließfokussierungsverfahren 14,15, und der T-Kreuzung Verfahren 16 in Mikrokanälen. Obwohl diese Verfahren hoch monodisperse W / O-Mikrotröpfchen erzeugen, benötigt die Mikroprozess komplizierte Handhabung und spezielle Techniken für die Herstellung von Mikrokanälen, und erfordert auch eine große Menge der Probenlösung gegeben (mindestens mehrere hundert81; l) wegen der unvermeidlichen Totvolumen in den Spritzenpumpen und Röhren, die die Probenlösung auf die Mikrokanäle führen. Somit ist eine einfach zu bedienende und Totraumvorrichtung Verfahren zur Erzeugung monodisperser W / O-Mikrotröpfchen erforderlich ist.
Dieses Papier, zusammen mit Videos von experimentellen Verfahren, beschreibt eine Kreisel Kapillare basierten axialsymmetrischen co fließende Mikrofluidvorrichtung 17 zur Erzeugung zellgroßen, monodisperse W / O-Mikrotröpfchen (Abbildung 1). Diese einfache Methode erzielt Größe Monodispersität und Größe Steuerbarkeit. Es erfordert nur eine Tischplatte Mini-Zentrifuge und eine Kapillare basierenden achsensymmetrische zusammen fließt in einer Sampling-Mikroröhrchen befestigt Mikrofluidik-Vorrichtung. Unsere Methode benötigt nur ein sehr kleines Volumen (0,1 ul) und verschwenden keine wesentliche Volumen der Probe.
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Protocol
1. Herstellung eines Kapillar-basierte Mikrofluidikvorrichtung
- Einrichten der Halter
Hinweis: Die Halterdesign ist in 2A dargestellt.- Schneiden Sie jede der vier Scheiben der Halter (2A (i) - (iv)) von 2 mm dicken Polyacetal Kunststoffplatte eine Fräsmaschine. Verwenden Sie die folgenden Dimensionen für jede der vier Scheiben des Inhabers: (i) Disc 1 Durchmesser 8,5 mm, Kapillar-Loch (CH) Durchmesser 1,3 mm, Schraubenloch (SH) Durchmesser 1,8 mm; (Ii) Scheibe 2 Durchmesser 8,7 mm, CH Durchmesser 2,0 mm, SH Durchmesser 1,8 mm; (Iii) Scheibe 3 Durchmesser 8,7 mm, CH Durchmesser 0,5 mm, SH Durchmesser 1,8 mm; und (iv) Scheibe 4 Durchmesser 9,1 mm, CH Durchmesser 1,0 mm, SH Durchmesser 1,8 mm.
- Montieren Sie die Halter mit M2 × 40 Schrauben (2B). Ein unterer Teil des Halters (2B) aus der Platte 1 und der Scheibe 2 in 2A (i), (ii) und einem oberen Teil (Figure 2B) des Halters besteht aus der Scheibe 3 und der Scheibe 4 in Figur 2A (iii), (iv).
- Den unteren Teil des Halters konstruieren, legen Sie die Schraube in drei SH jeder Scheibe 1 und 2 die Schrauben verkürzen, indem ein Stück der Gewindeabschnitt klemm ab. Halten Sie die Schraubenlänge bei 0,9 cm (die gleiche Länge wie das Unterteil des Halters).
- Um den oberen Teil des Halters konstruieren, legen Schrauben in die beiden SH jeder Scheibe 3 und 4 die Schrauben verkürzen, indem ein Stück der Gewindeabschnitt klemm ab. Halten Sie die Schraubenlänge bei 0,7 cm (die gleiche Länge wie der obere Teil des Halters).
- Die Halterung montieren, kommen Sie mit den unteren und oberen Teile des Halters eine lange Schraube.
Hinweis: Halten Sie die Länge der einzelnen Teile des Halters genau: der untere Teil ist 0,9 cm; der obere Teil ist 0,7 cm (2B).
- Die Herstellung der Glaskapillaren
- Verwenden zwei Arten von Glaskapillaren: eine innere Glaskapillare (Außendurchmesser (OD) / Innendurchmesser (ID): 1,0 / 0,6 mm), und eine äußere Glaskapillare (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
- Verwenden Sie einen Glasschneider den äußeren Glas Kapillare in drei gleiche Teile zu teilen und dann die Glasschneider verwenden, um die innere Glaskapillare in zwei gleiche Teile zu teilen.
- Schärfen jeder geteilten inneren und äußeren Glaskapillaren mit einer Glaskapillare Magnet (3A). Stellen Sie das Gewicht des Zieh bei max. Stellen Sie den Wärmeniveau des Zieh bei 60 Grad für die äußere Glas Kapillare und 70 Grad für die innere Kapillare. schärfen vorsichtig das Glas Kapillare.
- Halten Sie die Länge der Spitze innerhalb der verengten Teil der Glaskapillare: die innere Kapillare ist 1,5-1,8 cm; die äußere Kapillare 0,8-1,0 cm (3C). Wenn diese Länge kürzer oder länger als die beschriebene Länge handelt, sollten Sie Wärmeniveau des Zieh einzustellen.
- Fix die inneren oder äußeren Glas Kapillaren zur Mikroschmiede stehen mit Klebeband (3B).
- Schneiden Sie die Spitze der Glaskapillare weg mit der Mikroschmiede in drei Schritten (3B): (i) berühren die Spitze der Glaskapillare auf die Glasperlen auf einem Platindraht, (ii) erwärmen, um die Platindraht auf einem Fuß von Schritt Schalter für 1-2 sec, und (iii) nach 1-2 sec, durch Kühlen der Platindraht der Spitze der Glaskapillare abgeschnitten.
- Anpassen der Durchmesser der inneren (d i) und äußeren (d o) Kapillaröffnungen sind. Der Öffnungsdurchmesser der inneren Glas Kapillare 5, 10, und 20 & mgr; m (d i = 5,10, 20 & mgr; m) und der Außen Glaskapillare (d o) ist 60 & mgr; m (d o = 60 & mgr; m) in diesem Experiment.
Hinweis: Die Glaskapillare stehen zur Verfügung. Wiederholen Sie die Herstellung des Glas Kapillarsystemer Jahren.
- Anpassen der Durchmesser der inneren (d i) und äußeren (d o) Kapillaröffnungen sind. Der Öffnungsdurchmesser der inneren Glas Kapillare 5, 10, und 20 & mgr; m (d i = 5,10, 20 & mgr; m) und der Außen Glaskapillare (d o) ist 60 & mgr; m (d o = 60 & mgr; m) in diesem Experiment.
2. Verfahren zur Erzeugung von W / O-Mikrotröpfchen
- Füllen Sie eine äußere Glas Kapillare mit ölhaltigen Tensid. Die Mischung aus Öl und Tensid Hexadecan, enthaltend 2% (w / w) Sorbitanmonooleat in diesem Experiment (4A).
Hinweis: Es gibt viele Kombinationen von Ölen und Tensiden (beispielsweise Ölen oder kohlensäurehaltigem fluorierten sein können; Tenside können ionische, nichtionische oder Fluorchemikalie).- Einzuführen 10 ul Hexadecan Sorbitanmonooleat in einen äußeren Glaskapillare. In 4A ist der Öffnungsdurchmesser des äußeren Glaskapillare (d o) 60 & mgr; m (d o = 60 um). Um die Öffnung der Glaskapillare einstellen, kehren zu den Schritten 1.2.4-1.2.5.
- Stellen Sie die äußere Kapillare in den unteren Teil des Halters (4B).
- Draw etwa 0,1 & mgr; l einer wässrigen Lösung in eine innere Glaskapillare (4C) durch Kapillarwirkung. In 4C ist der Öffnungsdurchmesser des inneren Glaskapillare (d i) 10 & mgr; m (d i 10 & mgr; m =). Um die Öffnung der Glaskapillare einstellen, kehren zu den Schritten 1.2.4-1.2.5.
- Stellen Sie die innere Kapillare in dem oberen Teil des Halters (4D-a). Legen Sie die innere Kapillare in die äußere Kapillare (4D-a). Mit Blick auf den weißen Punkt-Kreis, wie in Figur 4D-a, beobachten die Position der inneren Kapillare innerhalb der äußeren Kapillare (Innendurchmesser der äußeren Kapillare (w) = 130 um) (4D-b, c) unter Verwendung eines digitalen Mikroskops . Die Position der inneren Kapillare in der äußeren Kapillare muss w = 100-150 & mgr; m eingestellt werden.
Hinweis: Um die Position der inneren ändernKapillare in der äußeren Kapillare Sie bitte die Schraube im oberen Teil der Halterung drehen. Dadurch kann Abstand w genau gesteuert werden. - Einzuführen 100 ul Hexadecan Sorbitanmonooleat (2% w / w) in den Boden eines 1,5 ml Mikroröhrchen Probe. Installieren Sie die Halterung, mit der inneren und äußeren Kapillaren, in der Probe Mikroröhrchen (4E-a). Achten Sie darauf, die äußere Kapillare zu überprüfen, damit es von der Luft-Öl-Grenzfläche entfernt (4E-b).
- Zentrifugieren Sie die Probe Mikroröhrchen ein Tischschwing-out-Typ Mini-Zentrifuge mit einer Dichte von 1,600 g für 1-2 sec unter Verwendung von Mikrotröpfchen (4F) zu erzeugen. Führen Sie alle Experimente bei RT.
Hinweis: Verwenden Sie eine Schwing-out-Zentrifuge. Ein Tropfen können mit einer Seitenwand des Probenmikroröhre kollidieren und zerfallen, wenn ein Festwinkel-Zentrifugentyp verwendet wird. - auszuarbeiten langsam die W / O-Tröpfchen mit einer Pipette und dann legte sie auf ein Glas sLiDE.
- Machen Sie Bilder der Mikrotröpfchen erzeugt ein digitales Mikroskop (Vergrößerung 200X).
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Representative Results
In dieser Studie zeigen wir ein einfaches Verfahren zur Erzeugung von Zellgroße W / O-Mikrotröpfchen durch eine Kapillare basierten zentrifugalen Mikrofluidvorrichtung (1) verwendet wird. Mikrofluidische Vorrichtung bestand aus einem Kapillarhalter besteht (2B), zwei Glaskapillaren (inneren und äußeren Glaskapillaren in 3C) und ein Mikroröhrchen ein Öl einschließlich Tensid enthält. Wir injizierten 0,1 & mgr; l Probenlösung in die innere Glaskapillare und platziert die innere Glaskapillare in die äußere Glaskapillare (4D). Zelle große W / O-Mikrotröpfchen wurden durch Plateau-Rayleigh Instabilität einer Strahlströmung von Probenlösung 17 (1B) und waren stabil erzeugt für mindestens 2 h 17.
Typische Beispiele für die verschiedenen Größen von W / O-Mikrotröpfchen erzeugt aus der Kapillare-baSED zentrifugalen Mikrofluidvorrichtung sind in 5 gezeigt. 5A-F zeigt die digitale Mikroskopie Bilder und Histogramme Größenverteilung (n = 200) der W / O-Mikrotröpfchen. Die W / O-Mikrotröpfchen wurden unter Verwendung eines inneren Kapillare mit einer d erzeugt i = 5 (A, B), 10 (C, D) oder 20 um (E, F) Öffnungsdurchmesser, während d o und w konstant bei 60 gehalten um und 115 & mgr; m auf. Die Messungen der Größe der erzeugten W / O-Mikrotröpfchen wurden durch Analyse des Mikroskopbild erhalten erworben. Für die d i = 5, 10, und 20 & mgr; m Öffnungen, die mittleren Durchmesser der Mikrotröpfchen waren 8,3 & mgr; m (Standardabweichung (SD) 0,9 um, Variationskoeffizient (CV) 10,8%), 12,7 um (SD 1,1 um, CV 8,6%), und 17,9 & mgr; m (SD 1,4 um, CV 7,8%), respectively. Diese Ergebnisse zeigen, dass wir erfolgreich monodisperse W / O microdrople erhaltents durch das vorgeschlagene Verfahren. Darüber hinaus wurden die W / O-Mikrotröpfchendurchmesser nahezu gleich dem Innen Kapillaröffnung (5G). So kann die mittlere Größe der W / O-Mikrotröpfchen leicht über einen weiten Bereich eingestellt werden, in der Regel 5 bis 20 um, die Mikrovorrichtung verwendet wird.
Abbildung 1. Übersicht über die Kreisel kapillar-basierte achsensymmetrische Co-fließenden Mikrofluidik-Vorrichtung und die Bildung von W / O-Mikrotröpfchen mit dem Gerät. (A) Illustration der Kreisel kapillar-basierte achsensymmetrische Co-fließenden Mikrofluidik-Vorrichtung und Verfahren Erzeugungs W / O-Mikrotröpfchen ( innerhalb des Kreises), (B) W / O-Mikrotröpfchen, die durch Plateau-Rayleigh Instabilität eines Strahlstrom an wässriger Lösung 17, ist d i Öffnungsdurchmesser von inneren Glaskapillare, d oÖffnungsdurchmesser von inneren Glaspipette, w Innendurchmesser der äußeren Kapillare ist, (C) Foto von fabrizierten Gerät. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Aufbau Kapillarenhalter (A) Entwurf des Halters Kapillare aus Polyacetal Kunststoff. Die Einheit der Durchmesser in der Halterung befindet mm. (B) Fotografien des Halters bestehen aus einem Oberteil und einem Unterteil. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Flussdiagramm der Mikrofluidik-Vorrichtung Set-up und die Erzeugung von W / O-Mikrotröpfchen. (A) Herstellung von äußeren Kapillare. Öl mit Tensiden in die äußere Kapillare eingeführt, (B) äußere Kapillare in den unteren Teil des Halterkörpers, (C) Herstellung der inneren Kapillare: Wässrige Lösung drawn in eine innere Kapillare durch Kapillarwirkung, (D) Innenkapillare Satz in den oberen Teil des Halters (a). Überprüfen, dass die innere Kapillare in der äußeren Kapillare war ein digitales Mikroskop (b, c), (E) Halter mit inneren und äußeren Kapillaren in das Probenrohr installiert (a). Überprüfen, dass die äußere Kapillare aus der Luft-Öl-Grenzfläche gehalten wurde entfernt, (F) Schließlich Probe Mikroröhrchen mit einer Tischplatte Schwing-out-Typ Mini-Zentrifuge zentrifugiert. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Bildung monodisperser Zelle große W / O-Mikrotröpfchen. Digitale Mikroskopbilder und Größenverteilung Histogramme (n = 200) der erzeugten Mikrotröpfchen Kapillaren verschiedener Durchmesser unter Verwendung vonm d i = 5 (A, B), 10 (C, D) und 20 um (E, F), (G) Korrelation zwischen dem Öffnungsdurchmesser der Glaskapillare und dem Durchmesser der erzeugten W / O-Mikrotröpfchen . Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der Durchmesser der erzeugten W / O-Mikrotröpfchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Mit diesem Gerät wurden die monodisperse W / O-Mikrotröpfchen, die durch Plateau-Rayleigh Instabilität einer Jet-Strömung 17. Die mikroskopische Untersuchung ergab die Anwesenheit von Satellitentröpfchen. Bei der Herstellung der Vorrichtung sind drei kritischen Schritte wesentlichen erfolgreich monodisperse W / O-Mikrotröpfchen erzeugen. Zuerst wird eine gerade Strömung von Öl enthaltenden Tensid und wäßriger Lösung, die Kapillarlöcher vier Scheiben zu liefern, müssen in einem konzentrischen Muster angeordnet werden. Zweitens wurde die innere Kapillare vorsichtig in die äußere Kapillare eingeführt, weil die Spitze der Kapillare der obere Halter leicht, wenn es in Kontakt bricht. Dieser Vorgang kann schwierig sein, so empfehlen wir, mit Hilfe einer Lupe. Schließlich, um eine Ausstoßströmung des wässrigen Lösung 17, die Position der inneren Kapillare in die äußere Kapillare zu machen muss w = 100-150 & mgr; m eingestellt werden. Wenn die Größenverteilung von W / O-Mikrotröpfchen durch Zentrifugalkraft erzeugt microfluidic Gerät nicht monodispers ist, überprüfen Sie die Position der inneren Kapillare in der äußeren Kapillare. Um die Position der inneren Kapillare in der äußeren Kapillare zu ändern, drehen Sie die Schraube im oberen Teil des Halters. Dadurch kann Abstand w genau gesteuert werden.
Um monodisperse W / O-Mikrotröpfchen machen, gibt es die jeweiligen Einschränkungen. Es ist schwierig, die Kreiselgeschwindigkeit zu steigern (falls benötigt), da alle Versuche in der Studie mit der maximalen von dem Desktop Zentrifugenschleudergeschwindigkeit durchgeführt. Zusätzlich Tröpfchenerzeugung aus einer Vielzahl von verschiedenen Probenlösungen schwierig ist, ist die Begrenzung abhängig von der Zentrifugenkonstruktion. Mehrläufige Kapillaren als die innere Kapillare 18 die eingekapselten Mikrotröpfchen aus verschiedenen Kombinationen von Materialien und Lösungen.
Die Mikrofluidik-Vorrichtung hat zwei Hauptvorteile gegenüber herkömmlichen Mikrokanal Methoden: i) easy und robust Herstellung und ii) die Anforderung von nur einem kleinen Volumen (0,1 ul) der Probenlösung. Zunächst wird die Herstellung der Kapillare basierten Kreisel axialsymmetrischen co fließenden mikrofluidischen Vorrichtung ist einfach und robust. Nur dünne Kapillaren, ein Kapillarenhalter und eine Probe Mikroröhrchen erforderlich sind. Die Herstellungszeit beträgt 5-10 min für das Gerät. Herstellung der Vorrichtung benötigt weniger Zeit im Vergleich zu der Herstellung von anderen mikrofluidischen Vorrichtung. Darüber hinaus ist der Kapillarhalter robust und kann wiederverwendet werden. Daher sind die einzigen Verbrauchsmaterialien die Glas von Kapillaren und Probenmikroröhrchen in das Gerät, die es weniger teuer als andere mikrofluidische Systeme macht. Schließlich, da die Öl- und Wasserströme durch die Zentrifugalkraft erzeugt wurden, gab es keine verschwendete Volumen. Für 1-2 sec, erzeugt das Gerät eine große Anzahl von Mikrotröpfchen.
Mikrotröpfchen sind ideale Kandidaten Hochdurchsatz-Experimenten mit kleinen Probenmengen solutio durchzuführenn. Mit dieser Vorrichtung ist es theoretisch möglich, Hunderttausende von 10 & mgr; m großen Mikrotröpfchen pro Sekunde von 0,1 & mgr; l der Probenlösung zu erzeugen. Somit nimmt das Gerät mit wertvollen biologischen Proben arbeiten, indem das Volumen der Proben minimiert für eine schnelle quantitative Analyse erforderlich. Dieses Gerät kann verwendet werden, biochemische Reaktionen 9.6 und enzymatische Reaktionen Single-Cell-10 zu analysieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
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