Abstract
ここでは、キャピラリーベースの遠心マイクロ流体デバイスを用いたサイズ制御可能な単分散、W / Oの微小液滴の急速な生産のための簡単な方法を示しています。 W / O微小滴は、最近小型化化学実験を可能にする強力な方法で使用されてきました。したがって、単分散W / Oの微小液滴を生成する多様な方法を開発することは必要とされています。我々は、毛管系の遠心軸対称共流れるマイクロ流体デバイスに基づいて、単分散W / Oの微小液滴を生成するための方法を開発しました。我々は、キャピラリーオリフィスを調整することにより、微小液滴のサイズを制御することに成功しました。我々の方法は、カプセル化のためのサンプル溶液のみを少量（0.1μl）を必要とする簡単に使用できる他のマイクロ流体技術に比べてある機器を必要とし、毎秒W / Oの微小液滴の数百万の数の生産を可能にします。我々は、この方法は、貴重な生物学のを必要とする生物学的研究を支援することを期待迅速な定量分析の生化学的および生物学的研究のためのサンプルの容量を節約することによってamples。
Introduction
W / O微小液滴1-5タンパク質合成6、蛋白質結晶7、エマルジ ョンPCR 8,9、細胞カプセル化10、および人工細胞様システム5,6の建設を含む生化学および生物工学の研究のための多くの重要な用途を有します。これらの用途のためにW / Oの微小液滴を生成するために、重要な基準は、W / Oの微小液滴のサイズと単分散性の制御です。単分散、サイズ制御可能にW / O微小液滴11が共同流動法12,13、フローフォーカシング方式14,15、およびマイクロチャネルの中のT-接合法16に基づいています作るためのマイクロ流体デバイス。これらの方法は、高度に単分散W / Oの微小液滴を生成するが、微細加工プロセスは、マイクロチャネルの製造のために複雑な処理及び専門技術を必要とし、また、少なくとも数百サンプル溶液を大量に（必要81; l）のためにマイクロチャネルに試料溶液を行ってシリンジポンプとチューブで避けられない死容積の。したがって、使いやすい、低デッドボリューム法単分散W / Oの微小液滴を生成することが必要です。
本稿では、実験手順の動画と一緒に、セルサイズ、単分散W / Oの微小液滴（ 図1）を生成するための遠心キャピラリーベースの軸対称コ流れるマイクロ流体デバイス17を説明します 。この単純な方法は、サイズの単分散性と寸法制御を実現しています。それはちょうど卓上ミニ遠心機とサンプリングマイクロチューブに固定された毛細管ベースの軸対称コ流れるマイクロ流体デバイスを必要とします。我々の方法は、ごく少量（0.1μl）を必要とし、サンプルの任意の有意な量を無駄にしません。
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Protocol
キャピラリーをベースにしたマイクロ流体デバイスの1製作
- ホルダーのセットアップ
注：ホルダーの設計は、 図2Aに示されています。- 保有者の4ディスクの各切り取り（ 図2Aの（i） - （iv）の ）フライス盤を使用して、厚さ2mmのポリアセタールプラスチック板から。ホルダーの4ディスクごとに次のディメンションを使用しています。（ⅰ）ディスク1直径8.5ミリメートル、キャピラリーホール（CH）直径1.3ミリメートル、ネジ穴（SH）直径1.8ミリメートル。 （ⅱ）ディスク2直径8.7ミリメートル、CH直径2.0ミリメートル、SH直径1.8ミリメートル。 （iii）のディスク3直径8.7ミリメートル、CH直径0.5ミリメートル、SH直径1.8ミリメートル。および（iv）ディスク4直径9.1ミリメートル、CH直径1.0ミリメートル、SH直径1.8ミリメートル。
- M2は、40本のネジ（ 図2B）を ×使ってホルダーを組み立てます。ホルダー（ 図2B）の底部には、図2（a）（i）、（ii）および上部（ 図中、ディスク1、ディスク2から成りホルダーのUREの2B）はディスク3 と図2Aのディスク4（III）、（IV）からなります 。
- ホルダーの底部を構築するために、各ディスク1の3 SHのネジを挿入し、2は、ねじ部の一部をオフにニップすることにより、ネジを短くしてください。 0.9センチメートル（ホルダーの底部と同じ長さ）で、スクリューの長さにしてください。
- ホルダーの上部を構築するために、各ディスク3の2 SHにネジを挿入し、4はねじ部の一部をオフにニップすることにより、ネジを短くしてください。 0.7センチメートル（ホルダーの上部と同じ長さ）で、スクリューの長さにしてください。
- ホルダーを組み立てるために、長いネジを使用して、ホルダーの底部と上部に参加。
注：正確なホルダーの各部分の長さにしてください：底部が0.9 cmで、上部は0.7センチメートル（ 図2B）です。
- ガラスキャピラリーの作製
- 内側のガラスキャピラリー（外径（OD）/内径（ID）：1.0 / 0.6ミリメートル）、および外側ガラスキャピラリー（OD / ID：2.0 / 1.12ミリメートル）ガラスキャピラリーの2種類を使用してください。
- 3等分に外側ガラスキャピラリーを分割するガラスカッターを使用し、さらに2等分内側ガラスキャピラリーを分割するガラスカッターを使用しています。
- ガラスキャピラリープラー（ 図3A）を使用して、各分割し、内側と外側のガラスキャピラリーを研ぎます。最大でプーラーの重みを設定します。内側の毛細血管のための外側のガラスキャピラリーのための60度と70度でプラーの熱レベルを設定します。慎重にガラスキャピラリーを研ぎます。
- ガラスキャピラリーのくびれ部内の先端部の長さを保つ：内部キャピラリーは1.5〜1.8センチメートルです。外側キャピラリーは0.8〜1.0センチメートル（ 図3C）です。この長さは、記載の長さよりも短い又は長い場合、プーラーの熱レベルを調整してください。
- Fテープを使用して、マイクロフォージスタンド（ 図3B）の内側又は外側ガラスキャピラリーIX。
- 3段階（ 図3B）にマイクロフォージを使用して、ガラスキャピラリーの先端をカットオフ：（i）は、白金線上にガラスビーズにガラスキャピラリーの先端に触れ、（ii）の足を踏んにより白金線を加熱1-2秒間スイッチ、および（iii）1から2秒後に、白金線を冷却することによってガラスキャピラリーの先端を切り落としました。
- それぞれ、内側の （d i）をと外側の （d 0）キャピラリーオリフィスの直径を調整します。内側のガラスキャピラリーのオリフィス径は、10 5、及び20ミクロン（dは I = 5,10、20ミクロン）と外側のガラスキャピラリー（D oは）この実験では60ミクロン（D 0 = 60μm）です。
注：ガラスキャピラリーは、使い捨てです。ガラスcapillarの製造を繰り返しIES。
- それぞれ、内側の （d i）をと外側の （d 0）キャピラリーオリフィスの直径を調整します。内側のガラスキャピラリーのオリフィス径は、10 5、及び20ミクロン（dは I = 5,10、20ミクロン）と外側のガラスキャピラリー（D oは）この実験では60ミクロン（D 0 = 60μm）です。
生成W / Oの微小液滴2.手順
- 石油系界面活性剤を有する外側ガラスキャピラリーを記入してください。油と界面活性剤の混合物は、この実験（ 図4A）中の2％（w / w）のソルビタンモノオレエートを含むヘキサデカンです。
注意：油および界面活性剤の多くの組み合わせがあります（ 例えば 、油は、フッ素化又は炭酸であってもよく、界面活性剤は、イオン性、非イオン性、またはフッ素系でもよいです）。- 外側のガラスキャピラリーにモノオレイン酸ソルビタンを含むヘキサデカンの10μLを紹介します。 図4Aに 、外側のガラスキャピラリー（D 0）のオリフィス直径が60ミクロン（D 0 = 60マイクロメートル）です。ガラスキャピラリーのオリフィスを調整するには、手順1.2.4-1.2.5に戻ります。
- ホルダー（ 図4B）の底部に外側キャピラリを設定します。
- DRA毛管作用により、内側ガラスキャピラリー（ 図4C）への水溶液の約0.1μlのwです。 図4Cで、内側のガラスキャピラリー（Dの i）のオリフィス直径は（D私は 10ミクロンを=）10μmです。ガラスキャピラリーのオリフィスを調整するには、手順1.2.4-1.2.5に戻ります。
- ホルダー（ 図4D-A）の上部に内側キャピラリを設定します。外側の毛細血管（ 図4D-A）に、内側キャピラリを挿入します。 図4D-のように白い点の円を見ると、デジタル顕微鏡を用いて、外側キャピラリー（ 図4D-B、C）（外キャピラリー（ ワット ）= 130ミクロンの内径）の内側に、内側キャピラリの位置を観察します。外側の毛細血管の内毛細血管の位置は、 ワット = 100-150ミクロンに設定する必要があります。
注意：内部の位置を変更するには外側の毛細血管内の毛細血管は、ホルダーの上部にネジを回してください。これにより、 距離 W を正確に制御することができます。 - 1.5ミリリットルのサンプルマイクロチューブの底部にヘキサデカン含むソルビタンモノオレエート（w / wの2％）の100μLを紹介します。サンプルマイクロチューブ（ 図4E-a）の中で、内側と外側の毛細血管で、ホルダーを取り付けます。空気-油界面（ 図4E-B）からそれを遠ざけるために、外側キャピラリを確認してください。
- 遠心分離（ 図4F）の微小液滴を生成するために、1-2秒間1600×gでの重力で卓上スイングアウト型ミニ遠心機を用いて、サンプルマイクロチューブ。 RTですべての実験を行います。
注：スイングアウト型遠心分離機を使用してください。液滴は、試料マイクロチューブの側壁に衝突し、固定角度型遠心分離機を使用した場合に崩壊することができます。 - ゆっくりピペットでW / O液滴を策定し、その後、ガラスの上に置きますライド。
- デジタル顕微鏡（倍率、200X）を使用して生成された微小液滴の画像をキャプチャします。
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Representative Results
本研究では、キャピラリーベースの遠心式の微細流動装置（ 図1）を用いて細胞サイズのW / Oの微小液滴を生成するための簡単な方法を提示します。マイクロ流体デバイスは、毛細管ホルダ（ 図2B）、2つのガラスキャピラリー（ 図3Cにおける内側および外側ガラスキャピラリー）、及び界面活性剤を含む油を含むマイクロチューブを構成しました。我々は、内側のガラスキャピラリーに試料溶液の0.1μLを注入し、外側のガラスキャピラリー（ 図4D）に内側のガラスキャピラリーを置きました。セルサイズW / Oの微小液滴が試料溶液17（ 図1B）の吐出流のプラトー・レイリー不安定性によって生成され、少なくとも2時間17安定でした。
毛細管-BAから生成されたW / Oの微小液滴の異なるサイズの典型的な例SED遠心式の微細流動装置は、 図5に示されている。 図5A-Fは、W / Oの微小液滴のデジタル顕微鏡画像及び粒度分布のヒストグラムを示す（N = 200）。 60ミクロンでD oと Wを一定に保ちながら、W / Oの微小液滴を d I = 5（A、B）、10（C、D）、または20ミクロン（E、F）のオリフィス直径を有する内側のキャピラリーを用いて生成されましたそれぞれおよび115μmで、。生成されたW / Oの微小液滴の大きさの測定は、得られた顕微鏡画像の解析によって得られました。 D iについて= 5、10、および20μmのオリフィス、微小液滴の平均直径は8.3ミクロン（標準偏差（SD）が0.9μm、変動係数（CV）10.8％）、12.7ミクロン（SD 1.1μmで、CVましたそれぞれ8.6％）、および17.9ミクロン（SD 1.4μmで、CV 7.8％）、。これらの結果は、我々が正常に単分散W / Oのmicrodropleを得られることを示しています提案手法によりTS。また、W / Oの微小滴の直径は、ほぼ内側毛細管オリフィス（ 図5G）と同じでした。したがって、W / Oの微小液滴の平均サイズは、容易にマイクロデバイスを使用して、典型的には5〜20μmで、広い範囲にわたって調整することができます。
遠心キャピラリーベースの軸対称コ流れるマイクロ流体デバイスおよびプロセス生成W / Oの微小液滴を（ 遠心キャピラリーベースの軸対称コ流れるマイクロ流体デバイスとデバイスを使用してW / Oの微小液滴の形成を。（A）イラストの図1.概要水溶液17の吐出流量のプラトー・レイリー不安定性によって生成された/ Oの微小液滴W円）、（B）内で、D iは 、内側ガラスキャピラリーのオリフィスの直径であり、D O内側のガラスキャピラリーのオリフィス径は、外側キャピラリー、作製した素子の（C）写真の内径はwは、ある。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
毛細管ホルダーの図2セットアップポリアセタールプラスチック製の毛細管ホルダの（A）デザイン：ホルダの直径の単位はmmです。ホルダーの（B）写真は上部と底部で構成されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
W / Oの微小液滴のマイクロ流体デバイスのセットアップおよび生成の図4のフロー・チャート。外側毛管の（A）の調製。水溶液DR：内側キャピラリの外側の毛細血管、（B）ホルダーの底部にセットアウターキャピラリー、（C）の調製に導入界面活性剤と油芒毛細管現象によって内部キャピラリー内に、（D）内の毛細血管は、ホルダー（A）の上部にセット。内側のキャピラリーはサンプル管（A）に設置され、内側および外側毛管とデジタル顕微鏡（B、C）、（E）ホルダーを使用して外側の毛細管であったことをチェックします。最後に、サンプルマイクロチューブを卓上スイングアウト型ミニ遠心機により遠心分離した（F）、外側の毛細血管が離れて空気-油界面から維持したことを確認する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
様々な直径の毛細管を用いて生成された微小液滴の単分散細胞サイズのW / Oの微小液滴の形成図5デジタル顕微鏡の画像とサイズ分布ヒストグラム（N = 200）メートル、D I = 5（A、B）、10（C、D）、及び20ミクロン（E、F）、（G）は、ガラス毛細管のオリフィス直径及び生成W / Oの微小液滴の直径との間の相関。エラーバーは、生成されたW / Oの微小液滴の直径の標準偏差を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この装置を用いて、単分散W / Oの微小液滴を、ジェット流17のプラトー・レイリー不安定性によって生成されました。顕微鏡検査は、サテライト滴の存在を明らかにしませんでした。デバイスの製造においては、3つの重要なステップが正常に単分散W / Oの微小液滴を生成するために必須です。まず、油界面活性剤水溶液の直進流を供給するためには、4つのディスクのキャピラリ孔は同心円状に配置されなければなりません。それ接点上ホルダ場合、キャピラリの先端が割れやすいため、2番目の、内側のキャピラリーは慎重に外側キャピラリーに挿入しました。この操作は困難な場合がありますので、我々は拡大鏡を使用することをお勧めします。最後に、水溶液17の吐出流量を作るために、外側の毛細血管への内側のキャピラリの位置は、 ワット = 100-150ミクロンに設定する必要があります。遠心マイクにより生成したW / Oの微小液滴のサイズ分布の場合rofluidicデバイスが単分散ではなく、外側のキャピラリー内で、内側キャピラリの位置を確認してください。外側の毛細血管の内毛細血管の位置を変更するには、ホルダーの上部にネジを回してください。これにより、 距離 W を正確に制御することができます。
単分散W / Oの微小液滴を作るために、現在の制限があります。研究における全ての実験は、卓上遠心機の最大遠心速度で行ったため、（必要であれば）、遠心速度を増加させるのに困難があります。また、液滴の生成は、異なる試料のさまざまなソリューションから困難である制限は、遠心分離機の設計に依存します。内側の毛細血管のようなマルチ銃身の毛細血管は、材料およびソリューション18の様々な組み合わせからカプセル化された微小液滴を提供することができます。
マイクロ流体デバイスは、従来のマイクロチャネル法上の2つの主要な利点があります。ⅰ）電子メールをASYと堅牢製造、および試料溶液のわずかな量のii）の要件（0.1μL）。まず、キャピラリーベースの遠心軸対称共同流れるマイクロ流体デバイスの製造は、シンプルかつ堅牢です。唯一の薄い毛細管、毛管ホルダ、試料マイクロチューブが必要とされます。製作時間は、デバイスの5〜10分です。デバイスの作製は、他のマイクロ流体装置の製造に比べて少ない時間がかかります。また、毛細管ホルダーは堅牢であり、再使用することができます。したがって、唯一の消耗品は、他のマイクロ流体システムよりも、それは安価になり、デバイス、ガラスキャピラリーおよびサンプルマイクロチューブです。油と水の流れが遠心力によって生成されたので最後に、無駄なボリュームはありませんでした。 1~2秒間、デバイスは、微小液滴を多数生成します。
微小液滴は、サンプルsolutio少量を伴うハイスループット実験を行うための理想的な候補でありますn個。この装置では、試料溶液の0.1μLから毎秒10ミクロンサイズの微小液滴の数十万人を生成することは理論的に可能です。したがって、デバイスは、迅速な定量分析に必要なサンプルの量を最小化することによって、貴重な生物学的サンプルでの作業に対応しています。このデバイスは、生化学反応6-9と単細胞酵素的反応の10を分析するために使用することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
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