Abstract
Her viser vi en enkel metode for hurtig produksjon av størrelses-styrbar, monodisperse, W / O mikrodråper ved hjelp av et kapillar-baserte mikrofluid sentrifugalpumpe-enhet. W / O mikrodråper har nylig blitt brukt i kraftige metoder som gjør det mulig miniatyriserte kjemiske eksperimenter. Derfor er utvikling av en fleksibel metode for å gi monodisperse W / O mikrodråper er nødvendig. Vi har utviklet en metode for generering av monodisperse W / O mikrodråper basert på et kapillar-baserte sentrifugale aksesymmetrisk co strømmende mikrofluidenhet. Vi lykkes i å kontrollere størrelsen på mikrodråper ved å justere kapillær åpning. Vår metode krever utstyr som er lettere å bruke enn med andre teknikker microfluidic, krever bare et lite volum (0,1-1 pl) av prøveløsning for innkapsling, og muliggjør produksjon av flere hundre tusen antall av W / O-mikrodråpene i sekundet . Vi forventer at denne metoden vil hjelpe biologiske studier som krever dyrebar biologisk samples av å bevare volumet av prøvene for rask kvantitativ analyse biokjemiske og biologiske studier.
Introduction
W / O mikrodråper 1-5 har mange viktige anvendelser for studiet av biokjemi og bioteknologi, inkludert proteinsyntese 6, protein krystallisering 7, emulsjon PCR 8,9, celle innkapsling 10, og konstruksjonen av kunstige cellelignende systemer 5,6. For å produsere W / O mikrodråper for disse programmene, viktige kriterier er kontroll av størrelse og monodispersibility av W / O mikrodråper. Microfluidic anordninger for fremstilling av monodisperse, størrelse Regulerbar vann / olje-mikrodråper 11 er basert på den medstrømmende metode 12,13, flow-fokusering metode 14,15, og den T-kryss-metoden 16 i mikrokanaler. Selv om disse fremgangsmåter fremstille sterkt monodisperse W / O mikrodråper, krever microfabrication prosessen komplisert håndtering og spesialiserte teknikker for fremstilling av mikrokanaler, og krever også en stor mengde prøveoppløsning (i det minste flere hundre81; l) på grunn av den uunngåelige dødvolum i sprøytepumper og rør som driver prøveoppløsningen til mikrokanaler. Således, til en lett-å-bruke og lav-død-volum-metoden genererer monodisperse W / O mikrodråper er nødvendig.
Dette papir, sammen med videoer fra eksperimentelle prosedyrer, beskriver en sentrifugal-kapillar-baserte aksesymmetrisk co strømmende mikrofluidinnretningen 17 for generering av cellestørrelse, monodispers W / O mikrodråpene (figur 1). Denne enkle metoden oppnår størrelse monodispersitet og størrelse kontrollerbarhet. Det krever bare en tabletop mini-sentrifuge og en kapillær-basert aksesymmetrisk co-strømmer microfluidic enheten fast i et utvalg microtube. Vår metode trenger bare et meget lite volum (0,1 ul), og ikke kaste bort noe vesentlig volum av prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabrikasjon av en kapillær-baserte mikrofluid Device
- Sett opp av innehaverne
Merk: Holderen utforming er vist i figur 2A.- Skjær ut hver av de fire skiver av holderne (figur 2A (i) - (iv)) fra 2 mm tykk polyacetal plastplate ved hjelp av en fresemaskin. Bruk følgende mål for hver av de fire platene av holderen: (i) disc 1 diameter 8,5 mm, kapillær hull (CH) diameter 1,3 mm, skruehullet (SH) diameter 1,8 mm; (Ii) to skivediameter 8,7 mm, CH diameter på 2,0 mm, SH diameter på 1,8 mm; (Iii) -plate 3 diameter 8,7 mm, CH diameter 0,5 mm, SH diameter på 1,8 mm; og (iv) skiven 4 diameter på 9,1 mm, CH diameter på 1,0 mm, SH diameter på 1,8 mm.
- Monter holderne ved hjelp av M2 × 40 skruer (figur 2B). En nedre del av holderen (figur 2B) består av platen 1 og skiven 2 i figur 2A (i), (ii) og en øvre del (Figure 2B) av holderen består av skiven 3 og skiven 4 i figur 2A (iii), (iv).
- Å konstruere den nederste delen av holderen, sett skruen i tre SH av hver plate 1 og 2. Kutt skruene ved nipping av et stykke av tråden delen. Holde lengden på skruen 0.9 cm (den samme lengde som den nederste del av holderen).
- Å konstruere den øvre delen av holderen, skru inn skruer i de to SH av hver plate 3 og 4. Kutt skruene ved nipping av et stykke av tråden delen. Holde lengden på skruen 0.7 cm (den samme lengde som den øvre del av holderen).
- For å montere holderen, delta i bunn og øvre deler av holderen ved hjelp av en lang skrue.
Merk: Hold lengden av hver del av holderen eksakte: den nederste del er 0,9 cm; den øvre del er 0,7 cm (figur 2B).
- Fabrikasjon av glasskapillærer
- Bruker to typer glasskapillærer: en indre glasskapillære (ytre diameter (OD) / indre diameter (ID): 1,0 / 0,6 mm), og en ytre glasskapillar (OD / ID: 2,0 / 1,12 mm).
- Bruk et glass cutter å dele den ytre glass kapillær i tre like deler, og deretter bruke glass cutter å dele det indre glasset kapillær i to like store stykker.
- Skjerpe hver delt indre og ytre glasskapillærer ved hjelp av en glasskapillar avtrekker (figur 3A). Angi vekten av avtrekker ved maks. Angi at varmenivå av trekk-anordningen 60 grader for den ytre glasskapillære og 70 grader for den indre kapillær. skjerpe forsiktig glass kapillær.
- Holde lengden av spissen i den innsnevrede del av glasskapillær: den indre kapillær er 1,5-1,8 cm; den ytre kapillær er 0,8-1,0 cm (Figur 3C). Hvis denne lengde er kortere eller lengre enn den som er beskrevet lengde, kan justere varmen nivået av avtrekker.
- Fix de indre eller ytre glasskapillærer til microforge stativ ved hjelp av bånd (figur 3B).
- Skjær av spissen av glasskapillær ved hjelp av microforge i tre trinn (Figur 3B): (i) berører tuppen av glasskapillar til glasskulene på en platinatråd, (ii) oppvarme platinatråd ved å trå på en fot bytte i 1-2 sekunder, og (iii) etter 1-2 sek, avskåret spissen av glasskapillær ved avkjøling av platinatråd.
- Juster diametrene til den indre (d i) og ytre (d o) kapillære åpninger, henholdsvis. Åpningsdiameteren på det indre glasset kapillær er 5, 10, og 20 um (d i = 5,10, 20 um), og den ytre glasskapillar (d o) er 60 um (d o = 60 um) i dette eksperimentet.
Merk: glass kapillær er disponibel. Gjenta fabrikasjon av glass capillartallet.
- Juster diametrene til den indre (d i) og ytre (d o) kapillære åpninger, henholdsvis. Åpningsdiameteren på det indre glasset kapillær er 5, 10, og 20 um (d i = 5,10, 20 um), og den ytre glasskapillar (d o) er 60 um (d o = 60 um) i dette eksperimentet.
2. Prosedyre for generering av W / O mikroskopiske dråper
- Fyll en ytre glass kapillær med olje som inneholder overflateaktivt stoff. Blandingen av olje og overflateaktivt middel er heksadekan inneholdende 2% (vekt / vekt) sorbitanmonooleat i dette eksperimentet (figur 4A).
Merk: Det er mange kombinasjoner av oljer og tensider (f.eks kan oljer være fluor eller kullsyreholdig, overflateaktive stoffer kan være ioniske, ioniske eller fluor).- Introduser 10 ul inneholdende heksadekan sorbitanmonooleat inn i et ytre glasskapillar. I figur 4A, åpningsdiameteren av den ytre glasskapillar (d o) er 60 um (d o = 60 um). For å justere åpningen av glass kapillær, gå tilbake til trinn 1.2.4-1.2.5.
- Still ytre kapillær i den nedre delen av holderen (figur 4B).
- Draw ca 0,1 pl av en vandig oppløsning inn i en indre glasskapillar (figur 4C) ved kapillarvirkning. I figur 4C, er åpningsdiameteren av inner glasskapillar (d) 10 um (d = 10 pm). For å justere åpningen av glasskapillar, gå tilbake til trinn 1.2.4-1.2.5.
- Setter det indre kapillær i den øvre del av holderen (figur 4D-a). Sett indre kapillært inn i den ytre kapillær (figur 4D-a). Ser vi på den hvite dot sirkelen som i figur 4D-en, observere posisjonen til den indre kapillær inne i den ytre kapillar (indre diameter av den ytre kapillar (w) = 130 um) (Figur 4D-b, c) ved hjelp av et digitalt mikroskop . Posisjonen av den indre kapillær i den ytre kapillær må settes til w = 100-150 um.
Merk: Hvis du vil endre plasseringen av den indrekapillær i den ytre kapillær, kan skru skruen i den øvre del av holderen. Derved kan avstanden w styres presist. - Introduser 100 ul inneholdende heksadekan sorbitanmonooleat (2% w / w) inn i bunnen av en 1,5 ml prøve mikrorør. Installere holderen, med de indre og ytre blodkar, i prøven mikrorør (figur 4E-a). Pass på å sjekke den ytre kapillær å holde det borte fra luften-olje grensesnitt (figur 4E-b).
- Sentrifuger prøven microtube ved hjelp av en bord svingende-out-type mini-sentrifuger ved en tetthet på 1600 xg for 1-2 sek å generere mikrodråper (figur 4F). Utføre alle eksperimenter ved RT.
Merk: Bruk en svingende-out-type sentrifuge. En dråpe kan kollidere med en sidevegg av prøven mikrorør og gå i oppløsning når en fast vinkel-type sentrifuge anvendes. - Sakte utarbeide W / O-dråper med pipette, og deretter, legg dem på et glass sLiDE.
- Ta bilder av mikrodråpene generert ved hjelp av et digitalt mikroskop (forstørrelse 200X).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien presenterer vi en enkel metode for generering av cellestørrelse W / O-mikrodråper ved hjelp av et kapillar-baserte sentrifugal mikrofluidinnretningen (figur 1). Den mikrofluid Enheten var sammensatt av en kapillær holder (figur 2B), to glasskapillærer (indre og ytre glasskapillærer på figur 3C), og en mikrorør inneholdende en olje, inkludert overflateaktivt middel. Vi injisert 0,1 mL av prøveoppløsning inn i det indre glasskapillær og anbrakt den indre glasskapillært inn i den ytre glasskapillar (figur 4D). Celle størrelse W / O mikrodråper ble dannet ved Plateau-Rayleigh ustabilitet av en jetting-strøm av prøveoppløsning 17 (figur 1B) og var stabil i minst 2 timer 17.
Typiske eksempler på de forskjellige størrelser av W / O mikrodråper som genereres fra den kapillar-based sentrifugal mikrofluidinnretningen vist i figur 5 Fig. 5A-F viser de digitale mikroskopi bilder og størrelsesfordeling histogrammer (n = 200) av W / O-mikrodråper. Vann / olje-mikrodråper ble samlet ved hjelp av en indre kapillær med en d i = 5 (A, B), 10 (C, D), eller 20 nm (E, F) åpningsdiameter, samtidig som d o og w konstant på 60 um og 115 um, respektivt. Målingene av størrelsen av de genererte W / O mikrodråper ble ervervet ved analyse av mikroskopbilde erholdt. For d = 5, 10 og 20 um åpninger, den gjennomsnittlige diameteren til mikrodråpene var 8,3 um (standard avvik (SD) 0,9 um, variasjonskoeffisienten (CV) 10,8%), 12,7 um (SD 1,1 um, CV 8,6%), og 17,9 um (SD 1,4 um, CV 7,8%), henholdsvis. Disse resultatene indikerer at vi med hell oppnådd monodisperse W / O microdroplets av den foreslåtte metoden. Videre er mikrodråpediameter vann / olje var nesten den samme som den indre kapillær åpning (figur 5G). Således kan den midlere størrelsen av W / O-mikrodråper lett bli innstilt over et vidt område, typisk 5 til 20 um, ved hjelp av mikro-enheten.
Figur 1. Oversikt over sentrifugal kapillar-baserte aksesymmetrisk co strømmende mikrofluidanordning og dannelse av W / O mikrodråper ved hjelp av anordningen. (A) Illustrasjon av sentrifugal kapillær-baserte aksesymmetrisk co strømmende mikrofluid anordning og fremgangsmåte genererende W / O mikrodråpene ( innenfor sirkel), (B) W / O mikrodråper som genereres av platå-Rayleigh ustabilitet av en spylestrømning av vandig oppløsning 17, d er åpningsdiameteren av inner glasskapillar, d oer åpningsdiameter på indre glass kapillær, w er innvendig diameter på det ytre kapillært, (C) Fotografi av fabrikkerte enheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Oppsett av kapillær holderen (A) Design av kapillær holder laget av polyacetal plast. Enheten diameter i holderen er mm. (B) Fotografier av holderen består av en øvre del og en nedre del. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Flytskjema av mikrofluid anordningen set-up og dannelse av W / O mikrodråper. (A) Fremstilling av ytre kapillær. Olje med overflateaktive midler innføres i den ytre kapillær, (B) ytre kapillar satt inn i den nedre del av holderen, (C) Fremstilling av den indre kapillær: Vannholdig løsning drawn inn i en indre kapillær ved kapillaritet, (D) indre kapillære satt inn i den øvre del av holderen (a). Kontroll av at den indre kapillær var i den ytre kapillaren ved hjelp av et digitalt mikroskop (b, c), (E) Innehaver med indre og ytre kapillærer som er installert i prøverøret (a). Kontrollere at den ytre kapillær ble holdt vekk fra luft olje grensesnitt, (F) Til slutt ble prøven mikrorør sentrifugeres ved en tabletop svingende-out-type mini-sentrifuger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Dannelse av monodisperse celle-sized W / O mikrodråper. Digitalt mikroskop bilder og størrelsesfordeling histogrammer (n = 200) av genererte mikrodråper ved hjelp av kapillærene av ulike diameter, d i = 5 (A, B), 10 (C, D), og 20 nm (E, F), (G) Korrelasjon mellom åpningsdiameteren av glasset kapillær og diameteren av de genererte W / O mikrodråpene . Feilsøylene viser standardavvikene til diameteren av de genererte W / O mikrodråper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av denne enheten, ble den monodisperse W / O mikrodråper som genereres av Plateau-Rayleigh ustabilitet av en jet-flow 17. Mikroskopisk undersøkelse ikke avsløre tilstedeværelsen av satellitt dråper. I fabrikasjon av anordningen, tre kritiske trinn er avgjørende for å kunne generere monodisperse W / O mikrodråper. Først, for å levere en rett strøm av olje som inneholder overflateaktivt middel og vandig oppløsning, må de kapillære hull av fire plater være anordnet i et konsentrisk mønster. For det andre, vil det indre kapillarrør ble forsiktig satt inn i den ytre kapillaren fordi spissen av kapillaren lett brekker hvis det kommer i kontakt den øvre holderen. Denne operasjonen kan være vanskelig, så vi anbefaler at du bruker et forstørrelsesglass. Til slutt, for å foreta en stråle-strømmen av vandig oppløsning 17, posisjonen til den indre kapillært inn i den ytre kapillær må settes til w = 100-150 um. Hvis størrelsesfordelingen av W / O-mikrodråper som genereres av sentrifugal-microfluidic enheten ikke er monodisperse, kontrollere posisjonen av den indre kapillær i den ytre kapillaren. For å endre posisjonen av den indre kapillær i den ytre kapillær, kan skru skruen i den øvre del av holderen. Derved kan avstanden w styres presist.
For å gjøre monodisperse W / O mikrodråper, det er dagens begrensninger. Det er vanskeligheter med å øke sentrifugehastigheten (hvis nødvendig), fordi alle eksperimentene i studien ble utført ved den maksimale sentrifugalkraft hastigheten av skrivebordet sentrifugen. I tillegg er vanskelig fra en rekke forskjellige prøveoppløsninger dråpe generasjon, begrensningen er avhengig av sentrifugen design. Multi-barreled kapillærer som den indre kapillær kan gi de innkapslede mikrodråpene fra ulike kombinasjoner av materialer og løsninger 18.
Den microfluidic Enheten har to primære fordeler fremfor konvensjonelle microchannel metoder: i) easy og robust fabrikasjon, og ii) kravet om bare et lite volum (0,1 ul) av prøveløsningen. For det første er fremstillingen av kapillaren baserte sentrifugale aksesymmetrisk co strømmende mikrofluid anordning enkel og robust. Bare tynne kapillærer, en kapillær holder, og en prøve microtube er påkrevd. Fabrikasjon tid er 5-10 min for enheten. Fabrikasjon av anordningen tar mindre tid i forhold til fabrikasjon av andre mikrofluidenhet. Dessuten er den kapillære holderen robust og kan brukes om igjen. Derfor er den eneste forbruks er glasskapillærer og prøven mikrorør i anordningen, noe som gjør det mindre kostbare enn andre microfluidic systemer. Til slutt, ettersom olje- og vannstrømmer ble produsert ved hjelp av sentrifugalkraften, var det ingen bortkastet volum. I 1-2 sek, genererer enheten et stort antall av mikrodråper.
Mikrodråper er ideelle kandidater til å gjennomføre high-throughput eksperimenter som involverer små mengder prøve løsning;n. Med denne anordning, er det teoretisk mulig å generere hundretusener av 10-mikrometer-størrelse mikroskopiske dråper per sekund fra 0,1 ul av prøveoppløsningen. Således rommer innretningen arbeider med kostbare biologiske prøver ved å minimalisere volumet av prøvene som er nødvendig for hurtig kvantitativ analyse. Denne anordning kan brukes til å analysere biokjemiske reaksjoner 6-9 og encellede enzymatiske reaksjoner 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-mm-thick polyacetal plastic plate | Tool | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (Japan) | 244-6432-08 |
| Milling machine | Tool | Roland DG Co., Ltd. (Japan) | MDX-40A |
| End Mill RSE230-0.5*2.5 | Tool | NS Tool Co., Ltd. (Japan) | 01-00644-00501 |
| M2*40 screws | Tool | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (Japan) | 0001-024 |
| Glass Capillry Puller | Tool | Narishige (Japan) | PC-10 |
| Microforge | Tool | Narishige (Japan) | MF-900 |
| Inner Glass Capillary | Tool | Narishige (Japan) | G-1 |
| Outer Glass Capillary | Tool | World Precision Instruments Inc. (USA) | 1B200-6 |
| 1.5 ml Sample tube | Tool | INA OPTIKA CO.,LTD (Japan) | ST-0150F |
| Hexadecane | Reagent | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (Japan) | 080-03685 |
| Sorbitan monooleate (Span 80) | Reagent | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Japan) | S0060 |
| Milli Q system | Reagent | Merck Millipore Corporation (Germany) | ZRQSVP030 |
| Swinging-out-type Mini-centrifuge | Tool | Hitech Co., Ltd. (Japan) | ATT101 |
| Digital Microscope | Tool | KEYENCE Corporation (Japan) | VHX-2001 |
References
- Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F.
- Huebner, A., et al.
- Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P.
- Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
- Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
- Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
- Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
- Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
- He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
- Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R.
- Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502 (2007).
- Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
- Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
- Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
- Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
- Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
- Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).
