Introduction
والهدف الأساسي من الطب التجديدي هو توليد خلايا جديدة والفنية التي يمكن أن تستخدم لإصلاح أو استبدال التالفة، تحولت الأنسجة. اعادة تشكيل خلايا بالغة متاحة بسهولة في جديدة، وتحويلها من نوع خلية واحدة إلى أخرى، هو نهج جذابة بشكل خاص، خصوصا عندما يكون السكان الخلية المطلوبة ليست وفيرة أو صعوبة الوصول إليها. ومع ذلك، خلايا بالغة مستقرة بشكل ملحوظ. يكتسبون دولتهم متباينة من خلال تقييد تدريجي في خياراتها، وبمجرد وصولها إلى التخصص محطة ناضجة، فإنها مستقر الاحتفاظ بها 1.
في السنوات الأخيرة تم وضع عدد من البروتوكولات، التي تمكن من إعادة برمجة لتعدد القدرات من خلية جسدية (آي بي إس) تحققت من خلال التعبير القسري لمجموعة من النسخ عوامل 2،3. بدلا من ذلك، تحويل الخلايا يمكن الحصول عليها عن طريق transdifferentiation النسب المباشر، وإدخال واحد 4 ص> أو مزيج من النسخ عوامل 5-7. لا تنطوي هذه الاستراتيجية الانتقال من خلال دولة متباينة دي ولكن يتطلب التعبير عالية من النسخ محددة عوامل 8.
لقد وضعت مؤخرا على بروتوكول التحويل على أساس التعرض قصيرة من الخلايا البالغة إلى خصائص demethylating من سيتيدين التناظرية 5 آزاسيتيدين (5-عزة-CR)، وتتميز بشكل جيد المانع الحمض النووي ناقلة الميثيل. ويتبع الخطوة نزع الميثيل على الفور من قبل بروتوكول التمايز محددة 11/9 التي تسمح للحصول على النمط الظاهري المحطة المطلوبة. هذا الأسلوب هو قادرة على تحويل ناضجة، وخلايا متباينة في الخلايا من سلالة مختلفة ولديه ميزة كبيرة لتجنب كل من استخدام ناقلات فيروسية وترنسفكأيشن من أي عوامل النسخ الخارجية. وتجنب أيضا الاستحواذ على الدولة المحفزة مستقرة، والمتعلقة زيادة القابلية للخلية عدم الاستقرار.
"jove_content"> بروتوكول مفصل يسمح للتحويل الخلايا الليفية الجلد البشري الكبار في الخلايا المفرزة للأنسولين تعمل بكامل طاقتها ويرد هنا. ومع ذلك، فمن الجدير بالذكر أن هذه التقنية تم تطبيقها على أنواع مختلفة من الخلايا، ولدت نتائج إيجابية، عند معالجة الخلايا تجاه مختلف مسارات التمايز. وعلاوة على ذلك، تم استخدام تحويل جينية بنجاح في الجنس البشري والخنازير 13/09 وكذلك في الكلب (مخطوطة المقدمة) مما يدل على فعالية واسعة ومتانة هذا النهج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ كافة الإجراءات الموضحة أدناه تحت غطاء تدفق الصفحي في ظروف معقمة. تأكد من أن يتم تنفيذ جميع الإجراءات ثقافة الخروج على مراحل يسيطر حراريا ويتم الاحتفاظ الخلايا عند 37 درجة مئوية طوال تعاملها.
1. الجلد الخلايا الليفية عزل
- إعداد الثقافة صحن طلاء الحل
- حل 0.1 غرام من الجيلاتين الخنزيري في 100 مل من الماء (تركيز النهائي 0.1٪). تعقيم حل مع الأوتوكلاف.
- إضافة 1.5 مل من العقيمة الجيلاتين الخنزيري 0.1٪ إلى 35 ملم أطباق بتري. الانتظار 2 ساعة إلى معطف، والحفاظ عليها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: يتم جمع خزعات الجلد الإنسان عن طريق الاستئصال تحت التخدير الموضعي من منطقة اوعائية من الجانب الأمامي من الساعد وتخزينها في Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع 2٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية في +4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- غسل الخزعات مع برنامج تلفزيوني جديد تستكمل مع 2٪ عنتيبيحل مضاد فطري أذني.
- مكان الخزعات في طبق 100 ملم بيتري ومقطعة إلى حوالي 2 مم 3 أجزاء مع المشارط معقمة.
- إزالة طلاء حل الزائدة مباشرة قبل الطلاء شظايا.
- ضع 5-6 أجزاء الجلد في طبق بيتري قبل المغلفة 35 مم.
- إعداد مستنبت الخلايا الليفية: 77٪ Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) ارتفاع نسبة الجلوكوز 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪، الجلوتامين حل و 2٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية.
- إضافة قطرة من متوسطة الليفية على كل جزء (عادة 100 ميكرولتر لكل جزء) والثقافة لهم عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- بعد 24 ساعة، إضافة 500 ميكرولتر من مستنبت الخلايا الليفية على شظايا لإبقائها رطبة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- تغيير المتوسطة مع ماصة مرة واحدة على الأقل كل 48 ساعة.
- بعد 6 أيام من الحضانة، وإزالة شظايا الأنسجة بعناية والتخلص منها.
ملاحظة: بعد 6 أيام، الليفيةالصورة تبدأ في النمو من شظايا الأنسجة والبدء في تشكيل أحادي الطبقة الخلية. - تحديث المتوسطة، إضافة 2 مل من مستنبت الخلايا الليفية ومواصلة زراعة الخلايا أحادي الطبقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
2. الخلايا الليفية الثقافة
- الليفية الثقافة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حتى 80٪ التقاء
- لالركض، ونضح مستنبت الخلايا الليفية من أطباق زراعة الأنسجة. غسل خلايا ثلاث مرات مع 4 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية.
- إضافة طبقة رقيقة (10٪ من حجم مستنبت) من حل التربسين-EDTA (0.5 جم / لتر الخنازير التربسين و 0.2 جم / لتر EDTA) واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ أحادي الطبقة الخلية إلى فصل من الجزء السفلي من الأنسجة طبق ثقافة والخلايا تنأى.
- تمييع تعليق خلية مع 9 أجزاء من مستنبت الخلايا الليفية إلى تحييد عمل التربسين. الطرد المركزي ليست ضرورية.
- لوحة الخلايا في أطباق ثقافة جديدة (معمن الجيلاتين) والثقافة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. إبقاء نسبة مرور بين 1: 2 و 1: 4، وهذا يتوقف على معدل النمو.
- عندما تصل خلايا حوالي 80٪ التقاء، والمرور منها (عادة مرتين في الأسبوع).
3. الخلايا الليفية تصفيح لجينية التحويل
- إضافة 0.26 مل / سم 2 من 0.1٪ الجيلاتين الخنزيري (إعداد كما هو موضح في 1.1) لأطباق زراعة الخلايا. الانتظار 2 ساعة إلى معطف.
- إزالة حل طلاء تتجاوز 10-30 دقيقة قبل طلاء الخلايا الليفية.
- إزالة مستنبت الخلايا الليفية من أطباق الثقافة. غسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1٪ محلول مضاد فطري للمضادات الحيوية.
- إضافة طبقة رقيقة (10٪ من حجم مستنبت) من حل التربسين-EDTA (0.5 جم / لتر الخنازير التربسين و 0.2 جم / لتر EDTA) واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ أحادي الطبقة الخلية إلى فصل من الجزء السفلي من الأنسجة طبق ثقافة والخلايا تنأى.
- تمييع تعليق خلية مع 9 أجزاء من fibroblأست مستنبت لتحييد عمل التربسين.
- عد الخلايا باستخدام غرفة الفرز تحت المجهر في درجة حرارة الغرفة. حساب الكمية المطلوبة من مستنبت الخلايا الليفية ل resuspend الخلايا، للحصول على تركيز خلية من 7.8 × 10 4 الخلايا الليفية / سم 2. وهذا يعتمد على نوع معين من الغرفة المستخدمة.
خلية / ميكرولتر = متوسط عدد الخلايا في صغير شبكة × 90 (الضرب عامل) س التخفيف - تعليق خلية الطرد المركزي في 150 غ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة الخلايا طاف و resuspend مع حجم المحسوبة سابقا من مستنبت الخلايا الليفية.
- لوحة الخلايا على 0.1٪ الجيلاتين أطباق والثقافة لهم لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة قبل المغلفة.
4. زيادة اللدونة الخلية باستخدام دي مزج بالميثيل وكيل 5-عزة-CR
- اليوم 0
- إعداد 5-عزة CR-حل الأسهم عن طريق إذابة 2.44 ملغ من 5 عزة-CR في 10 مل من DMEM عالية الجلوكوز ميديأم. تعقيم عن طريق الترشيح. إعداد الأوراق المالية 5-عزة-CR فورا قبل الاستخدام.
- تمييع 1 ميكرولتر من 5 عزة CR-حل الأسهم في 1 مل من مستنبت الخلايا الليفية (نهائي تركيز 1 ميكرومتر).
- لزيادة ليونة الخلية، 24 ساعة بعد خلية الطلاء (العنوان الفرعي 3.8)، وإزالة مستنبت من الخلايا الليفية المزروعة، إضافة 1 ميكرومتر 5-عزة CR-حل الأوراق المالية والثقافة لمدة 18 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
- اليوم 1
- إعداد الطازجة المتوسطة متعددة القدرات البشرية (HP) كما هو موضح في الجدول رقم 1.
- بعد الحضانة مع 1 ميكرومتر 5-عزة-CR، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لضمان 5-عزة-CR يتم شطف بعيدا.
- احتضان 5-عزة-CR الليفية تعامل مع HP متوسطة لمدة 3 ساعة (فترة نقاهة) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
- بعد فترة النقاهة، وإزالة المتوسطة، ويغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- لمراقبة كفاءة 5-عزة-CR العلاج، وتحقق في هذه الخطوة fأو وجود تغيرات شكلية (المفصل في قسم النتائج). تفقد خلايا مورفولوجيا ممدود نموذجية من الخلايا الليفية وتكتسب مستديرة أو بيضاوية الشكل، ليصبح أصغر في الحجم، مع نوى الموسع.
- المضي قدما في التمايز البنكرياس.
5. بروتوكول التمايز البنكرياس
- أيام 1-6
- إعداد البنكرياس بصل متوسطة كما هو موضح في الجدول رقم (2).
- إعداد activin حل الأسهم: حل 5 ميكروغرام من activin البروتين البشري المؤتلف في 166.6 ميكرولتر من الماء المعقم.
- ثقافة 5-عزة-CR علاج الخلايا الليفية في 0.26 مل / سم 2 من البنكرياس بصل متوسطة، على أن تستكمل مع 1 ميكرولتر / مل activin حل الأوراق المالية (انظر 5.1.2) لمدة 6 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. تغيير يوميا المتوسطة.
- أيام 7-8
- إعداد الريتينويك حل الأسهم حمض بإضافة 16.6 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى 50 ملغ من المجلس الدولي للمطارات الريتينويكد.
- خلايا الثقافة في 0.26 مل / سم 2 من البنكرياس بصل متوسطة تستكمل مع 1 ميكرولتر / مل activin حل الأوراق المالية (انظر 5.1.2) و 1 ميكرولتر / مل حل الأسهم حمض الريتينويك (انظر 5.2.1) لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2. تغيير يوميا المتوسطة.
- أيام 9-36
- خلايا الثقافة في 0.26 مل / سم 2 من البنكرياس بصل متوسطة تستكمل مع 1٪ (ت / ت) الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم (ITS)، 2٪ (V / V) B27 و 0.1٪ (ت / ت) المؤتلف جمعية جيل المستقبل الإنسان الأساسية (bFGF) حل سهم (انظر الجدول 1) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. تغيير المتوسطة يوميا لمدة 15 يوما الأولى.
- من يوم 16 فصاعدا، وتجديد المتوسط كل يوم، تحت المجهر، منذ تشكيل خلايا الكلية قد فصل من الجزء السفلي من صحن الثقافة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إنشاء ثقافة الأولية من خزعات الجلد
قطعت خزعات الجلد في أجزاء صغيرة ووضعها في أطباق الجيلاتين قبل المغلفة. بعد 6 أيام، بدأت الخلايا الليفية للتخلص من شظايا الأنسجة وشكلت أحادي الطبقة الخلية (الشكل 1A). أظهرت خلايا مستطيلة نموذجية، وكما هو متوقع، اظهرت موحدة المناعة الإيجابية لالليفية محدد فيمنتين علامة (فيم، الشكل 1B).
تغيرات شكلية ومثيلة نمط من الخلايا الليفية الجلد بعد التعرض 18 ساعة إلى 5 عزة-CR
للحصول على تحويل جينية الناجح الخلايا الليفية إلى خلايا إفراز الأنسولين، قمنا بزيادة مرونة وذلك باستخدام وكيل دي مزج بالميثيل، 5-عزة-CR. كانت مطلية الخلايا الليفية الإنسان على 0.1٪ الجيلاتين الأطباق قبل المغلفة بتركيز 7.8 × 10 4 الخلايا الليفية / سم 2. أربع وعشرين ساعة بعد البذر، وخلايا ثيحرث حضنت مع 1 ميكرومتر 5-عزة-CR لمدة 18 ساعة.
في نهاية هذا العلاج، وكان تغيير واسعة من النمط الظاهري خلية مرئية (المشاركة 5-عزة-CR، الشكل 2A). مورفولوجيا ممدود نموذجية من الخلايا الليفية غير المعالجة (T0، الشكل 2A)، استبدلت مستديرة أو بيضاوية الشكل، وأصبح حجم الخلية أصغر بكثير. كان السيتوبلازم الحبيبية، بالارض، وكانت الخلايا الملتصقة على سطح الثقافة. نوى بدا أكبر وظهور تجاويف، نتيجة لهيكل الكروماتين استرخاء. في تجربتنا، فإن وجود هذه التغييرات الشكلية هو أمر ضروري ويجب أن تراقب بعناية كعلامة لكفاءة العلاج 5-عزة-CR.
بعد 18 ساعة من التعرض لل5-عزة-CR، وهو انخفاض حاد في الحامض النووي العالمي كان واضحا أيضا وتجلى بوضوح من خلال تقلص كثافة المناعية 5 methylcytidine ( التغيرات الشكلية والوظيفية أثناء عملية التحويل جينية من الجلد الخلايا الليفية إلى خلايا إفراز الأنسولين خلال الخطوة الأولى، وكانت الخلايا المستنبتة لمدة 7 أيام في البنكرياس بصل متوسطة تستكمل مع activin ألف إلى تعزيز التزام الأديم. في هذه الفترة، وبدأت خلايا أخرى بالارض والعمل تدريجيا على تنظيم تجمعات في (يوم 7 الشكل 3A). وفي وقت لاحق، تمت ترقيته البنكرياس النسب التمايز مع إضافة حمض الريتينويك لمدة 2 أيام. وردا على هذا العلاج، والخلايا ترتيبها في نمط شبكي ونمت في المجاميع تمييزها بوضوح الخلية (يوم 10، الشكل 3A). تشكيل تجمع عزيادة rocess مع مرور الوقت وكان حافزا أبعد من ذلك الخطوة الثالثة والأخيرة، والتي تتألف من التعرض الخلية B27، bFGF وITS. وأدى ذلك إلى تجنيد عدد متزايد من الخلايا التي تجميعها في المستعمرات 3D كبيرة (يوم 20، الشكل 3A). حول يوم 36، وظهرت هذه المستعمرات عن الهياكل جولة مميزة تذكرنا الجزر نموذجية البنكرياس في المختبر (يوم 36، الشكل 3A). ورافق الاستحواذ على النمط الظاهري EpiCC الجديد زيادة تدريجية لمستويات الحامض النووي العالمية التي عادت لتلك التي لوحظت في الخلايا الليفية غير المعالجة (5 مولودية يوم 36 الشكل 3B). بعد 36 يوما من تحريض البنكرياس، وقد أثبت كفاءة تحويل جينية أيضا التعبير عن علامات البنكرياس ناضجة النموذجية، والتي كانت غير قابلة للكشف أصلا في الخلايا الليفية غير المعالجة (T0، الجدول 1: حلول المادية. الجدول 2: حلول المادية.
للحث على تمايز البنكرياس، تعرضوا 5-عزة-CR الليفية المعالجة لبروتوكول ثلاث خطوات لتحريض البنكرياس، وعلى الفور بعد فترة النقاهة 3 ساعة. 
الشكل 1: عزل وتوصيف الخلايا الليفية الجلد البشري (A) صورة الممثل من الخلايا الليفية المتزايد من شظايا الأنسجة. (ب) الخلايا الليفية عرض موحدة للمناعة إيجابية عن الصورة الخاصةفيمنتين علامة pecific (فيم). هي ملطخة النوى مع دابي. (أشرطة النطاق، 100 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 2: التغيرات المورفولوجية ومثيلة من الخلايا الليفية الجلد البشري بعد 5-عزة-CR العلاج (A) صور الممثل الخلايا الليفية غير المعالجة التي تبين شكل ممدود (T0)، و 5 عزة-CR الليفية المعالجة عرض مستديرة أو التشكل البيضاوي، المحبب. السيتوبلازم، وتوسيع وظهور تجاويف النوى (المشاركة 5-عزة-CR). (أشرطة النطاق، 100 ميكرون). (ب) انخفاض الحامض النووي العالمي اكتشافها بعد العلاج 5-عزة-CR (المشاركة 5-عزة-CR). (أشرطة النطاق، 50 ميكرون). الرجاء CLإك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل (3): التغيرات المورفولوجية والوظيفية أثناء عملية التحويل جينية (A) الصور التمثيلية للتغيرات شكلية تحدث خلال التمايز البنكرياس الغدد الصماء. بعد 7 أيام من تحريض الخلايا البشرية تنظم تدريجيا في مجموعات (يوم 7). وردا على إضافة حمض الريتينويك، وإعادة ترتيب في نمط شبكي والعنقودية في المجاميع مميزة (يوم 10). هذه التشكيلات التقدم مع مرور الوقت، وتجنيد الخلايا وتجميع في المستعمرات 3D كبيرة (يوم 20). وأخيرا، المستعمرات تصبح الهياكل الكروية التي تميل الى فصل وتطفو بحرية في مستنبت، تذكرنا الجزر البنكرياسية نموذجية في المختبر (يوم 36). (أشرطة النطاق، 100 ميكرون). (ب) بعد 36 يوما من البنكرياس فيالدرفلة الجديد، ومستويات الحامض النووي العالمية من عودة EpiCC الإنسان لتلك التي لوحظت في الخلايا الليفية غير المعالجة (5 يوم MC 36). (مقياس شريط 50 ميكرون). شارك في توطين PDX1 مع C-PEP قابلا للاكتشاف في نهاية فترة التحويل (يوم 36)، في حين أن هذه العلامات البنكرياس الصماء غائبة تماما في الخلايا الليفية غير المعالجة (T0). (أشرطة النطاق، 100 ميكرون). اطلاق الانسولين (C) EpiCC ردا على 20 ملي مد الجلوكوز و 20 ملي التعرض-L الجلوكوز. الحانات تمثل متوسط ± SD من ثلاث مكررات مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. اسم المادة / معدات الكمية (ت / ت) تعليقات / الوصف F-10 المغذيات مزيج لحم الخنزير ل 40٪ DMEM انخفاض الجلوكوز 40٪ استبدال خروج المغلوب المصل 10٪ FBS 5٪ حل مضاد فطري مضاد حيوي 1٪ حل الجلوتامين 1٪ MEM غير الضرورية حل الأحماض الأمينية 1٪ الأوراق المالية 2-المركابتويثانول 1٪ 2-المركابتويثانول إعداد الأوراق المالية: diluite 3.5 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول في 5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. مخزن في الظلام في +4 درجة مئوية. ملاحظة: استخدم في حدود 2 أسابيع الأسهم مزيج نوكليوزيد 1٪ نوكليوزيد مزيج إعداد الأوراق المالية: حل 0.042 غرام غوانوزين، 0.040 غرام أدينوسين، 0.036 غرام سيتيدين، 0.036 غرام يوريدين و0.012 ز Timidine في 50 مل من الماء المعقم. تذوب عند 50 درجة مئوية إلى حل. تعقيم بواسطة filtratايون وتخزينها في +4 درجة مئوية ESGRO (ليف) 0.1٪ المؤتلف جمعية جيل المستقبل البشري الأساسي الأوراق المالية (bFGF) 0.1٪ bFGF إعداد الأوراق المالية: إضافة 5 مل من 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني في 25 ميكروغرام من bFGF اسم المادة / معدات الكمية (ت / ت) تعليقات / الوصف DMEM / F-12 93٪ B-27 الملحق ناقص فيتامين (أ) 2٪ N-2 الملحق 1٪ MEM غير الضرورية حل الأحماض الأمينية 1٪ مضاد حيويحل مضاد فطري 1٪ الأوراق المالية 2-المركابتويثانول 1٪ 2-المركابتويثانول إعداد الأوراق المالية: diluite 3.5 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول في 5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. مخزن في الظلام في +4 درجة مئوية. ملاحظة: استخدم في حدود 2 أسابيع حل الجلوتامين 1٪ الأسهم BSA 1٪ إعداد المخزون BSA: حل 250 ملغ في 50 مل من الماء. تعقيم عن طريق الترشيح وتخزينها في +4 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف المخطوطة الحالية الأسلوب الذي يسمح للتحويل الخلايا الليفية الجلد البشري إلى خلايا منتجة للأنسولين، من خلال التعرض عابرة وموجزة ل5-عزة-CR، تليها بروتوكول تحريض محددة الأنسجة. هذا النهج يتيح التحول من الأديم المتوسط إلى خلايا ذات الصلة الأديم، من دون التعبير القسري لعوامل النسخ أو الرنا الميكروية ولا الاستحواذ على الدولة المحفزة مستقرة، والتي تجعل الخلايا أكثر غير مستقرة وعرضة للأخطاء 14.
في الخطوة الأولى، يتم زيادة ليونة الخلية بفضل معدل جينية الاصطناعية أن يؤدي الى عابرة، الدولة متساهلة عكسها في خلايا متباينة عضال. على وجه الخصوص، تم استخدام 5-عزة-CR من أجل تسبب انخفاضا في مثيلة العالمي الخلايا الليفية الجلد. ومن المعروف 5-عزة-CR لتحول دون مباشرة النشاط ميثيل ترانسفيراز ومنع من جديد مثيلة الحمض النووي في تصنيعه حديثا. لما له من أثر، هذا الجزيءتم استخدامها سابقا لإعادة تنشيط الجينات الصامتة، فضلا عن تعديل الدول تمايز الخلايا حقيقية النواة 15،16. وأظهرت اتساقا مع ذلك، إضافة 5-عزة-CR الخلايا الليفية الجلد نزع الميثيل الحمض النووي العالمي (الشكل 2A)، مشيرا 5-عزة-CR القدرة على زيادة ليونة في الخلايا المستخدمة في التجارب الحالية. وهذا هو أيضا في اتفاق مع ملاحظة أن 5-عزة-CR يسهل التعبير عن ارتفاع المتعلقة اللدونة علامة أكتوبر-4 في الخلايا neurosphere (NSCs) 17. ومع ذلك، فإنه من المثير للاهتمام أن نلاحظ أن مشاركة 5-عزة-CR الخلايا الليفية الجلد تعود إلى النمط الظاهري الأصلي بعد إزالة 5-عزة-CR. في الواقع، أثبتنا سابقا أن الخلايا الليفية عادت إلى مستنبت الأصلي، بانخفاض التعبير المنظم للعوامل ذات الصلة تعدد القدرات 9،10، مشيرا إلى أن الدولة اللدونة أعلى المكتسبة، ردا على معدل جينية، هو عابر، والغاء ولا تنطوي تعديلات دائمة رانه الخلايا.
تغيرات ملحوظة في التشكل خلية رافق تحريض على أعلى دولة اللدونة (الشكل 2A). تم استبدال أجسام الخلايا ممدود نموذجية من الخلايا الليفية غير المعالجة التي كتبها مستديرة أو بيضاوية الشكل الخلايا التي قدمت أبعاد أصغر وزيادة حجم النواة، والتي ظهرت أكبر من أن خلايا متباينة. المترابطة نيوا هذا التوسع النووي إلى هيكل لونين استرخاء وصفها بأنها ميزة ذات الصلة تعدد القدرات 18. وجود نواة ظهور تجاويف والسيتوبلازم الحبيبية، فضلا عن زيادة التشكل تتسطح، كان واضحا. كل التغيرات المورفولوجية وصف يمكن استخدامها عمليا بمثابة علامة للحصول على الانتهاء بنجاح من الجزء الأول من بروتوكول التحويل؛ في تجربتنا عند وجود التغييرات، و5-عزة-CR ساعد بالفعل خلايا للحصول على الدولة أكثر تساهلا.
ومن الممكن الاستفادة من هذا عابرة "permis عاليةالوقت النافذة sivity "لدفع الخلايا نحو النمط الظاهري مختلفة تماما. يوضح البروتوكول أن الخلايا الليفية مشاركة 5-عزة-CR يمكن إعادة معالجتها إلى خلايا تشبه الخلايا البنكرياسية بيتا، ردا على المتوسطة تمايز معين. بروتوكول يستخدم تسمح للخلايا للتبديل من الأديم المتوسط المستمدة نوع الخلية إلى خلية السكان الذين ينتمون إلى سلالة الأديم.
كان الأنسولين، الذي كان يمكن اكتشافها أصلا في الخلايا الليفية الجلد غير المعالجة، سواء كان إيجابيا في نهاية بروتوكول التمايز (الشكل 3B). وقد رافق ذلك من خلال التعبير في وقت واحد من العوامل الأخرى، مثل PDX1، والمشاركة في التفريق بين كل من البنكرياس - إفرازات لها، والغدد الصماء، والسكان الخلية الأقنية، بجانب نسب بيتا خلية معينة. وهذا يتفق مع العمل السابق على الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) يشير إلى أن تم التوصل إلى تمييز الصحيح إلى خلايا بيتا فقط عندما كانت الطبقات خلايا غير ناضجة مع تنقية المياهخلايا الغدد الصماء ص 19، مما يدل على أن البيئة الصغيرة المحلية التي توفرها جزيرة البنكرياس العمارة انجرهانز لها دور وظيفي قوي.
في الواقع، حقق EpiCC النمط الظاهري متباينة ناضجة وأظهرت القدرة على الاستجابة ل20 ملي التعرض الجلوكوز (الشكل 3). ويفرز الانسولين بفاعلية في مستنبت بعد 1 ساعة من التحفيز مد الجلوكوز، مما يؤكد طبيعة حسنة النية من EpiCC عن تلك المنتجة للأنسولين (الشكل 3C).
وهناك مطلب واضح لإجراء الناجح هو الحفاظ صارمة الخلايا عند 37 درجة مئوية، في جميع الخطوات، بما في ذلك التعامل في ظل تدفق الصفحي معقمة والمجهر. في تجربتنا، كما يوصى بدرجة كبيرة لتحضير الكواشف حديثا، قبل استخدامها في الثقافة ولتحديث المتوسطة بدقة وفقا للبروتوكول. يجب أن تتم هذه العملية تحت المجهر منذ الخلايا الإجمالية تشكيلقد فصل من الجزء السفلي من صحن الثقافة والمفقود خلال التغييرات المتوسطة.
كما تم تطبيق بروتوكول تحويل جينية بنجاح إلى أنواع الخنازير فضلا عن الكلب (مخطوطة المقدمة)، وذلك باستخدام نفس عدد الخلايا / سم 2 وتركيز وكيل دي مزج بالميثيل وصف للبشر.
وفي الختام، قدم لها البروتوكول الذي يسمح للتحويل الخلايا الليفية الجلد إلى نوع من الخلايا آخر هنا. استراتيجية وصفها والمزايا لتحويل الخلايا استنادا epigenetically: أي إمكانية لتجنب حالة المحفزة التي يمكن أن تترك وراءها خلايا قادرة على التسبب في السرطان. القضاء على العوامل الوراثية الخارجية التي يمكن أن تسبب تغيرات المستمرة في الخلايا. هذه المزايا تجعل النهج الحالي واعدة للغاية لتطبيقات الطب متعدية، ويسمح لعلاج الخلايا المحددة المريض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلف أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة Carraresi والمؤسسة الأوروبية لدراسة مرض السكري (EFSD). ويدعم GP من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه من جامعة ميلانو. المؤلفون هم أعضاء في عمل التكلفة FA1201 Epiconcept: علم التخلق وPericonception البيئة والعمل تكلفة BM1308 مشاركة السلف على نماذج حيوانية كبيرة (SALAAM). TALB عضو في العمل تكلفة الأحياء CM1406 جينية الكيميائية (EPICHEM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
