Introduction
Een fundamentele doelstelling van de regeneratieve geneeskunde is het genereren van nieuwe, functionele cellen die kunnen worden gebruikt voor het repareren of vervangen van beschadigde, ontaardde weefsels. Herbouwen gemakkelijk beschikbaar volwassen cellen in nieuwe, door ze te converteren van de ene cel naar het andere, is een bijzonder aantrekkelijke benadering, vooral wanneer de gewenste celpopulatie niet overvloedig of moeilijk toegankelijk. Echter, volwassen cellen opmerkelijk stabiel. Zij krijgen hun gedifferentieerde toestand via een geleidelijke beperking van hun mogelijkheden en, als ze eenmaal de volwassen terminal specialisatie te bereiken, ze stabiel te houden dat 1.
In de afgelopen jaren een aantal protocollen ontwikkeld, dat de herprogrammering mogelijk om pluripotentie van een somatische cel (iPS) gerealiseerd door geforceerde expressie van een aantal transcriptiefactoren 2,3. Als alternatief kan de cel conversie worden verkregen door directe afstamming transdifferentiatie, de invoering van een enkele 4 5-7. Deze strategie is niet de overgang door middel van een-de gedifferentieerde toestand te betrekken, maar vereist een hoge expressie van het specifieke transcriptiefactoren 8.
We hebben onlangs een conversie protocol gebaseerd op de korte blootstelling van volwassen cellen aan de demethylerende eigenschappen van het cytidine analoog 5-azacytidine (5-aza-CR), een goed gekarakteriseerde DNA-methyltransferase inhibitor. De demethylering stap wordt onmiddellijk gevolgd door een differentiatie protocol 9-11 waarmee de vereiste terminal fenotype te verkrijgen. Deze methode kan rijpe, gedifferentieerde cellen omgezet in cellen van een ander geslacht en heeft aanzienlijke voordelen voor zowel het gebruik van virale vectoren en transfectie van elke exogene transcriptiefactoren voorkomen. De overname van een stabiele pluripotente toestand, en de daarmee samenhangende verhoogde gevoeligheid voor instabiliteit cel wordt ook vermeden.
9-13 en bij honden (manuscript ingediend) suggereert een grote effectiviteit en robuustheid van de benadering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Alle hieronder beschreven procedures moeten worden uitgevoerd onder laminaire stroming kap onder steriele omstandigheden. Zorg ervoor dat alle cultuur procedures worden uitgevoerd op thermostaatkraan podia bij 37 ° C gedurende hun behandeling uitgevoerd en cellen worden gehandhaafd.
1. Skin Fibroblast Isolation
- Bereid Cultuur Dish Coating Solution
- Los 0,1 g varkensgelatine in 100 ml water (eindconcentratie 0,1%). Steriliseren oplossing met een autoclaaf.
- Voeg 1,5 ml steriel 0,1% varkensgelatine tot 35 mm petrischalen. Wacht 2 uur om de vacht, het behoud van hen bij kamertemperatuur.
Opmerking: menselijke huid biopten worden verzameld door excisie onder plaatselijke verdoving een avasculaire gebied van het voorste aspect van de onderarm en opgeslagen in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% antibiotica-antimycotische oplossing bij 4 ° C vóór gebruik.
- Wassen biopten met nieuwe PBS gesupplementeerd met 2% antibiotische antimycotische oplossing.
- Plaats biopsieën in een 100 mm petrischaal en snijd ze in ongeveer 2 mm 3 fragmenten met steriele scalpels.
- Verwijder de overmaat bekledingsoplossing direct voorafgaand aan uitplaten fragmenten.
- Plaats 5-6 huid fragmenten in de pre-gecoate 35 mm petrischaal.
- Bereid fibroblast kweekmedium: 77% Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoog glucose, 20% foetaal runderserum (FBS), 1% L-Glutamine-oplossing en 2% antibiotica antimycotische oplossing.
- Voeg een druppel fibroblast medium dan elk fragment (meestal 100 pl per fragment) en kweken ervan bij 37 ° C in 5% CO2.
- Na 24 uur, voeg 500 pl fibroblast kweekmedium via fragmenten om ze vochtig houden 37 ° C in 5% CO2.
- Verander het medium met een pipet ten minste eenmaal per 48 uur.
- Na 6 dagen incubatie, verwijder weefsel fragmenten voorzichtig en gooi ze weg.
Let op: Na 6 dagen, fibroblasts beginnen te groeien uit het weefsel fragmenten en beginnen een cel monolaag te vormen. - Vernieuwen medium, voeg 2 ml fibroblast kweekmedium en blijven cel monolaag cultuur bij 37 ° C in 5% CO 2 incubator.
2. Fibroblast Cultuur
- Fibroblasten kweek bij 37 ° C in 5% CO2 tot 80% confluentie
- Voor passage, aspireren fibroblast kweekmedium uit weefselkweek gerechten. Was de cellen drie keer met 4 ml PBS aangevuld met 1% antibioticum antimycoticum oplossing.
- Voeg een dunne laag (10% van het kweekmedium volume) van trypsine-EDTA-oplossing (0,5 g / l varkens trypsine en 0,2 g / l EDTA) en incubeer bij 37 ° C tot cel monolaag begint los van de bodem van het weefsel cultuur schotel en cellen distantiëren.
- Verdun celsuspensie met 9 delen van fibroblast kweekmedium trypsine actie te neutraliseren. Centrifugatie niet noodzakelijk.
- Plaat cellen in nieuwe cultuur gerechten (metuit gelatine) en de cultuur bij 37 ° C in 5% CO 2 incubator. Houd de doorgang verhouding tussen 1: 2 en 1: 4, afhankelijk van de groeisnelheid.
- Wanneer de cellen bereikt ongeveer 80% confluentie passage daarvan (meestal twee keer per week).
3. fibroblast Plating voor Epigenetische Conversion
- Voeg 0,26 ml / cm 2 of 0,1% varkensgelatine (bereid zoals beschreven in 1.1) naar celkweekschalen. Wacht 2 uur tot vacht.
- Verwijder de overtollige coatingoplossing 10-30 min voorafgaand aan uitplaten fibroblasten.
- Verwijder fibroblast kweekmedium van cultuur gerechten. Was de cellen drie keer met PBS aangevuld met 1% antibioticum antimycoticum oplossing.
- Voeg een dunne laag (10% van het kweekmedium volume) van trypsine-EDTA-oplossing (0,5 g / l varkens trypsine en 0,2 g / l EDTA) en incubeer bij 37 ° C tot cel monolaag begint los van de bodem van het weefsel cultuur schotel en cellen distantiëren.
- Verdun celsuspensie met 9 delen fibroblast kweekmedium trypsine actie te neutraliseren.
- Aantal cellen met behulp van een telkamer onder een microscoop bij kamertemperatuur. Bereken het vereiste volume van fibroblast kweekmedium om cellen te resuspenderen, een celconcentratie van 7,8 x 10 4 fibroblasten / cm2 verkregen. Dit zal afhangen van het specifieke type gebruikte kamer.
Cellen / l = Gemiddeld aantal cellen per kleine rooster x 90 (vermenigvuldigingsfactor) x verdunning - Centrifugeer celsuspensie bij 150 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen met de eerder berekende volume van fibroblast kweekmedium.
- Plaat cellen op 0,1% gelatine vooraf beklede schalen en kweken ervan gedurende 24 uur bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
4. Verhoog Cell Plasticiteit De demethyleren Agent 5-aza-CR
- dag 0
- Bereid 5-aza-CR voorraadoplossing door het oplossen van 2,44 mg van 5-aza-CR 10 ml DMEM hoge glucose medium. Steriliseren door middel van filtratie. Bereid 5-aza-CR stock onmiddellijk voor gebruik.
- Verdun 1 pi van 5-aza-CR voorraadoplossing in 1 ml fibroblast kweekmedium (eindconcentratie 1 uM).
- Naar cel plasticiteit, 24 uur na plateren cell (post 3,8) toeneemt, verwijdert kweekmedium geënt fibroblasten en voeg 1 uM 5-aza-CR voorraadoplossing en kweek gedurende 18 uur bij 37 ° C in 5% CO2 incubator.
- Dag 1
- Vers bereid pluripotente menselijke (HP) medium volgens Tabel 1.
- Na incubatie met 1 uM 5-aza-CR, verwijderen medium en wassen cellen drie keer met PBS zodat 5-aza-CR wordt weggespoeld.
- Incubeer 5-aza-CR behandelde fibroblasten HP medium voor 3 uur (herstelperiode) bij 37 ° C in 5% CO2.
- Na de herstelperiode, te verwijderen medium, was drie keer met PBS.
- Om de efficiëntie van 5-aza-CR behandeling te controleren, controleren in deze stap fof de aanwezigheid van morfologische veranderingen (gespecificeerd in resultaten sectie). Cellen verliezen de typische langwerpige morfologie van fibroblasten en het verwerven van een ronde of ovale vorm, steeds kleiner in omvang, met vergrote kernen.
- Ga verder met pancreas differentiatie.
5. Pancreatic Differentiatie Protocol
- dagen 1-6
- Bereid Pancreatic Basale Medium zoals beschreven in Tabel 2.
- Bereid activine A voorraad: los 5 ug activine A recombinant humaan eiwit in 166,6 ul van steriel water.
- Cultuur 5-aza-CR behandelde fibroblasten in 0,26 ml / cm2 alvleesklier- Basal Medium, aangevuld met 1 ul / ml activine A voorraadoplossing (zie 5.1.2) gedurende 6 dagen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Veranderen medium elke dag.
- dagen 7-8
- Bereid retinoïnezuur voorraadoplossing door het toevoegen van 16,6 ml dimethylsulfoxide (DMSO) om 50 mg reti- acid.
- Kweekcellen in 0,26 ml / cm2 Pancreatic basismedium gesupplementeerd met 1 ul / ml activine A voorraadoplossing (zie 5.1.2) en 1 ul / ml voorraadoplossing retinoïnezuur (zie 5.2.1) gedurende 2 dagen bij 37 ° C in 5% CO2. Veranderen medium elke dag.
- dagen 9-36
- Kweekcellen in 0,26 ml / cm2 Pancreatic basismedium gesupplementeerd met 1% (v / v) insuline-transferrine-selenium (ITS), 2% (v / v) B27 en 0,1% (v / v) recombinant humaan FGF basis- (bFGF) stockoplossing (zie tabel 1) bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Verander het medium dag gedurende de eerste 15 dagen.
- Vanaf dag 16 verder, verversen medium om de dag, onder een microscoop, aangezien vormende geaggregeerde cellen los van de bodem van de kweekschaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oprichting van primaire kweek van de huid biopsieën
Skin biopsies werden in kleine stukken gesneden en in gelatine vooraf beklede schalen. Na 6 dagen, fibroblasten gaan groeien uit het weefsel fragmenten en vormden een monolaag van cellen (Figuur 1A). Cellen vertoonden typische langwerpige vorm en, zoals verwacht, vertoonden een uniforme immuun-positiviteit voor fibroblast specifieke marker vimentine (Vim, figuur 1B).
Morfologische veranderingen en methyleringspatroon van huidfibroblasten na blootstelling 18 uur tot 5-aza-CR
Om een succesvolle epigenetische omzetting van fibroblasten in insuline uitscheidende cellen te verkrijgen, verhoogden we de plasticiteit met de de-methyleringsmiddel, 5-aza-CR. Humane fibroblasten werden uitgeplaat op 0,1% gelatine vooraf beklede schalen in een concentratie van 7,8 x 10 4 fibroblasten / cm2. Vierentwintig uur na het enten werden cellen were geïncubeerd met 1 urn 5-aza-CR 18 uur.
Na afloop van deze behandeling een uitgebreide verandering van cel fenotype toegankelijk (Voeg 5-aza-CR, Figuur 2A). De typische langwerpige morfologie onbehandelde fibroblasten (T0, figuur 2A), werd vervangen door een ronde of ovale vorm en celgrootte werd aanzienlijk kleiner. Cytoplasma was granulair, afgevlakt en hechtende cellen aan de cultuur oppervlak. Kernen bleek groter en gevacuoliseerde, als gevolg van de ontspannen chromatinestructuur. In onze ervaring, de aanwezigheid van deze morfologische veranderingen essentieel en moeten zorgvuldig worden gevolgd als een merker voor de efficiëntie van 5-aza-CR behandeling.
Na 18 uur blootstelling aan 5-aza-CR, een scherpe daling van de mondiale DNA-methylatie was ook duidelijk en werd duidelijk aangetoond door de verminderde intensiteit van de 5-methylcytidine immunokleuring ( Morfologische en functionele veranderingen tijdens epigenetische omzetting van huidfibroblasten in-insulineproducerende cellen Tijdens de eerste stap, de cellen werden gedurende 7 dagen in alvleesklier- basismedium aangevuld met activine A endoderm engagement bevorderen. In dit interval, cellen verder afgevlakt en geleidelijk begon te organiseren in clusters (Dag 7, figuur 3A). Vervolgens werd pancreas lineage differentiatie gepromoot met de toevoeging van retinoïnezuur gedurende 2 dagen. In reactie op deze behandeling cellen gerangschikt in een netvormige patroon en groeiden duidelijk te onderscheiden celaggregaten (Dag 10, figuur 3A). De clustering formatie process toe met de tijd en werd verder gestimuleerd door de derde en laatste stap, bestaande uit blootstelling cel B27, bFGF en ITS. Dit leidde tot de aanwerving van een groeiend aantal cellen die samengevoegd in grote 3D-kolonies (Dag 20, figuur 3A). Rond dag 36, deze kolonies worden onderscheiden door structuren denken aan typische pancreaseilandjes in vitro (Dag 36, figuur 3A). De overname van de nieuwe EPICC fenotype ging gepaard met een geleidelijke toename van de globale DNA methylatie niveaus die terug naar die waargenomen bij onbehandelde fibroblasten (5 mC Dag 36 Figuur 3B). Na 36 dagen alvleesklier inductie, werd de efficiëntie van epigenetische omzetting ook uit de expressie van typische volwassen pancreas markers, die oorspronkelijk niet detecteerbaar in onbehandelde fibroblasten (T0, Tabel 1: Materiaal oplossingen. Tabel 2: Materiaal oplossingen.
Alvleesklier differentiatie te induceren, werden 5-aza-CR behandelde fibroblasten blootgesteld aan een drie-stappen-protocol voor alvleesklier- inductie direct na de 3 uur herstelperiode. 
Figuur 1: Isolatie en karakterisering van de menselijke huid fibroblasten (A) representatief beeld van fibroblasten voortkomen uit het weefsel fragmenten.. (B) fibroblasten vertonen een uniform immuun-positiviteit voor hun sPECIFIEKE marker vimentine (Vim). Kernen zijn gekleurd met DAPI. (Schaal bars, 100 pm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 2: Morfologische en methylatie veranderingen van menselijke huidfibroblasten na 5-aza-CR behandeling (A) Representatieve beelden van onbehandelde fibroblasten toont langwerpige vorm (T0) en 5-aza-CR behandelde fibroblasten weergeven van een ronde of ovale morfologie, gegranuleerd. cytoplasma, en vergroot en gevacuoliseerde kernen (Voeg 5-aza-CR). (Schaalbalken, 100 urn). (B) een daling van de globale DNA methylatie is detecteerbaar na 5-aza-CR behandeling (Voeg 5-aza-CR). (Schaal bars, 50 pm). Gelieve click hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 3:. Morfologische en functionele veranderingen tijdens epigenetische conversie (A) Vertegenwoordiger foto's van de morfologische veranderingen die plaatsvinden tijdens de endocriene pancreas differentiatie. Na 7 dagen na inductie, menselijke cellen geleidelijk organiseren clusters (Dag 7). In reactie op de toevoeging van retinoïnezuur, ze te herschikken in een netvormige patroon en cluster onderscheiden aggregaten (Dag 10). Deze formaties voortgang met de tijd, het werven van cellen en aggregeren in grote 3D-kolonies (Dag 20). Tenslotte kolonies worden bolvormige structuren die de neiging hebben los en vrij te drijven in het kweekmedium, herinnerend typische pancreaseilandjes in vitro (Dag 36). (Schaalbalken, 100 urn). (B) Na 36 dagen van de pancreas inproductie, wereldwijde DNA methylatie niveau van menselijke EPICC terugkeer naar die waargenomen bij onbehandelde fibroblasten (5 mC Dag 36). (Schaal bar, 50 pm). Co-lokalisatie van Pdx1 met C-PEP detecteerbaar aan het eind van de omzetting (dag 36), terwijl deze pancreatische endocriene markers volledig afwezig in onbehandelde fibroblasten (T0). (Schaalbalken, 100 urn). (C) EPICC insulineafgifte in respons op 20 mM D-glucose en 20 mM L-glucose blootstelling. Staven geven het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke herhalingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Naam van Materiaal / Equipment Hoeveelheid (v / v) Opmerkingen / Omschrijving Ham's F-10 Nutrient Mix 40% DMEM laag glucose 40% KnockOut Serum Vervangende 10% FBS 5% Antibiotica antimycotische oplossing 1% L-glutamine oplossing 1% MEM niet-essentiële aminozuren Solution 1% 2-Mercaptoethanol voorraad 1% 2-Mercaptoethanol voorraadbereiding: diluite 3,5 pl 2-mercaptoethanol in 5 ml steriel PBS. Bewaren in het donker bij 4 ° C. Let op: gebruik binnen 2 weken Nucleoside mix voorraad 1% nucleoside mix voorraad voorbereiding: los 0,042 g Guanosine, 0,040 g Adenosine, 0,036 g Cytidine, 0,036 g Uridine en 0,012 g Timidine in 50 ml steriel water. Smelten bij 50 ° C op te lossen. Steriliseren door filtratie-ion en bewaar bij 4 ° C ESGRO (LIF) 0,1% Recombinant humaan FGF basis- (bFGF) stock 0,1% bFGF voorraadbereiding: voeg 5 ml 0,1% runderserumalbumine (BSA) in PBS bij 25 pg bFGF Naam van Materiaal / Equipment Hoeveelheid (v / v) Opmerkingen / Omschrijving DMEM / F-12 93% B-27 Supplement Minus Vitamine A 2% N-2 Supplement 1% MEM niet-essentiële aminozuren Solution 1% Antibioticumantimycotische oplossing 1% 2-Mercaptoethanol voorraad 1% 2-Mercaptoethanol voorraadbereiding: diluite 3,5 pl 2-mercaptoethanol in 5 ml steriel PBS. Bewaren in het donker bij 4 ° C. Let op: gebruik binnen 2 weken L-glutamine oplossing 1% BSA voorraad 1% Voorbereiding van de BSA voorraad: los 250 mg in 50 ml water. Steriliseren door filtratie en bewaar bij 4 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft een werkwijze die de omzetting van menselijke huidfibroblasten in insulineproducerende cellen toestaat, door een voorbijgaande en korte blootstelling aan 5-aza-CR, gevolgd door een weefselspecifieke inductieprotocol. Deze benadering maakt een overstap van mesoderm naar endoderm gerelateerde cellen, zonder dat de geforceerde expressie van transcriptiefactoren of microRNAs, noch de verwerving van een stabiele pluripotente toestand, dat cellen meer instabiel en gevoelig voor fouten 14 maakt.
In de eerste stap wordt de cel plasticiteit toeneemt door een synthetische epigenetische modifier die een tijdelijke, omkeerbare toelatende toestand induceert in terminaal gedifferentieerde cellen. In het bijzonder werd 5-aza-CR gebruikt om een afname van globale methylering van de huid fibroblast cellen. 5-aza-CR is bekend methyltransferase activiteit rechtstreeks te remmen en de novo methylatie in nieuw gesynthetiseerde DNA voorkomen. Door zijn effect, dit molecuulis eerder gebruikt om stille genen activeren, alsmede de differentiatie toestanden van eukaryotische cellen 15,16 modificeren. Consistent hiermee onderbrengen 5-aza-CR huidfibroblasten toonde een algemene DNA demethylering (Figuur 2A), wat aangeeft 5-aza-CR vermogen om plasticiteit in de cellen voor de onderhavige experimenten verhogen. Dit is ook in overeenstemming met de waarneming dat 5-aza-CR vergemakkelijkt expressie van de high-plasticiteit gerelateerde marker oktober-4 in neurosfeercellen (NSC) 17. Het is echter interessant dat na 5-aza-CR huidfibroblasten terugkeren naar hun oorspronkelijke fenotype na verwijdering van 5-aza-CR. Inderdaad hebben we eerder aangetoond dat fibroblasten weer in hun oorspronkelijke kweekmedium omlaag gereguleerde expressie van de pluripotentie factoren 9,10, wat aangeeft dat de hogere plasticiteit staat verworven, in reactie op de epigenetische modifier, voorbijgaand, reversibel en niet gepaard gaat permanente wijzigingen aan thij cellen.
Duidelijke veranderingen in celmorfologie vergezeld de inductie van een hogere plasticiteit toestand (figuur 2A). De typische langgerekte cellichamen van de onbehandelde fibroblastcellen werd vervangen door ronde of ovale cellen die kleinere afmetingen en het toegenomen kernen gepresenteerd, die groter is dan die van gedifferentieerde cellen zich vormden. Niwa gecorreleerd deze nucleaire uitbreiding met een ontspannen chromatine structuur beschreven als een pluripotentie-gerelateerde functie 18. De aanwezigheid van vacuolen nuclei en granulair cytoplasma, evenals een verhoogde flatten morfologie, waren duidelijk. Alle morfologische veranderingen beschreven praktisch worden gebruikt als een marker voor succesvolle voltooiing van het eerste deel van de omzetting protocol; in onze ervaring als de veranderingen aanwezig zijn, heeft 5-aza-CR inderdaad geholpen cellen om een meer tolerante staat te verwerven.
Het is mogelijk om te profiteren van deze tijdelijke "high permissivity tijdvenster "cellen drijven naar een heel ander fenotype. Dit protocol blijkt dat na 5-aza-CR fibroblasten kan opnieuw worden gericht aan pancreatische bèta-cel-achtige cellen, in antwoord op een specifieke differentiatie medium. Het gebruikte protocol toestaan dat cellen van een mesoderm afgeleide celtype te schakelen naar een cel bevolking behoort tot de endoderm afstamming.
Insuline, die oorspronkelijk niet detecteerbaar in onbehandelde huid fibroblasten, was positief aan het einde van de differentiatie protocol (Figuur 3B). Dit ging gepaard met gelijktijdige expressie van andere factoren, zoals Pdx1 betrokken bij de differentiatie van de gehele alvleesklier - de exocriene, endocriene en ductale celpopulaties, naast de specifieke beta-cellijn. Dit is consistent met eerder werk op muis embryonale stamcellen (ESC) aangeeft dat een goede differentiatie in beta-cellen bereikt wanneer onrijpe cellen werden gelaagd met other 19 endocrine cellen, wat suggereert dat de lokale micro-omgeving die de pancreaseilandjes van Langerhans architectuur een sterke functionele rol.
Inderdaad, EPICC hiermee volwassen gedifferentieerd fenotype en toonden het vermogen om te reageren op 20 mM glucose blootstelling (Figuur 3). Insuline werd actief uitgescheiden in het kweekmedium na 1 h D-glucose stimulatie bevestigt het bonafide karakter van EPICC als insulineproducerende die (Figuur 3C).
Een duidelijk vereiste voor een succesvolle werkwijze is de strikte handhaving van de cellen bij 37 ° C, bij alle stappen, waaronder hun behandeling onder steriele laminaire stroming en de microscoop. In onze ervaring, is het ook zeer aan te bevelen om reagentia vers bereiden, voorafgaand aan het gebruik ervan in de cultuur en tot middelgrote strikt te vernieuwen volgens het protocol. Deze operatie moet onder een microscoop, omdat de vorming van gezamenlijke cellen worden uitgevoerdkunnen raken van de bodem van de kweekschaal en verloren tijdens mediumveranderingen.
De epigenetische omzetting protocol is ook met succes toegepast voor de varkens en de hond (manuscript ingediend), met hetzelfde aantal cellen / cm2 en de-methyleringsmiddel concentratie beschreven voor de mens.
Tot slot wordt er een protocol dat de conversie van de huid fibroblasten in een ander celtype maakt hier gepresenteerd. De beschreven strategie heeft de voordelen van een epigenetisch gebaseerde celconversie namelijk de mogelijkheid om een pluripotente toestand achtergebleven cellen kunnen veroorzaken kanker kon verlaten voorkomen; de eliminatie van exogene genetische factoren die aanhoudende veranderingen in de cellen kunnen veroorzaken. Deze voordelen maken de huidige aanpak veelbelovend voor translationele geneeskunde applicaties en zorgt voor patiëntspecifieke celtherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Carraresi Foundation en de Europese Stichting voor de Studie van Diabetes (EFSD). GP wordt ondersteund door een post-doc fellowship van de Universiteit van Milaan. De auteurs zijn lid van de COST Actie FA1201 Epiconcept: Epigenetica en Periconception omgeving en de COST Actie BM1308 Sharing voorschotten op grote diermodellen (SALAAM). TALB is lid van de COST Actie CM1406 Epigenetische Chemical Biology (EPICHEM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
