Introduction
rejeneratif tıbbın temel bir amacı tamir veya hasarlı değiştirmek için kullanılabilecek yeni, fonksiyonel hücrelerin nesil, doku dejenere. başka bir hücre tipinden dönüştürerek, yeni olanları içine kolayca kullanılabilir yetişkin hücrelerinin yeniden şekillendiriyor, gerekli hücre popülasyonu erişimi bol ya da zor değil, özellikle bir özellikle çekici bir yaklaşımdır. Ancak, yetişkin hücreleri son derece stabildir. Onlar olgun terminali uzmanlık ulaştığında, bunlar stabil bunu 1 korumak onların seçeneklerinde kademeli kısıtlama yoluyla farklılaştırılmış devlet kazanmak ve.
Somatik hücre (iPS) bir pluripotency için yeniden programlama sağlayacak protokoller bir dizi geliştirilmiştir Son yıllarda, transkripsiyon bir dizi 2,3 faktörleri zorla sentezlenmesi yoluyla elde etti. Alternatif olarak, hücre dönüşüm 4 tek sokulması doğrudan nesilli transdiferansiasyon ile elde edilebilir 5-7 faktörleri. Bu strateji, bir de-farklılaştırılmış devlet aracılığıyla geçiş dahil ancak belirli transkripsiyon 8 faktörleri yüksek ifade gerektiriyor.
Son zamanlarda sitidin analog 5-azasitidin (5-aza-CR), iyi karakterize edilmiş DNA metiltransferaz inhibitörünün demetile özelliklerine yetişkin hücrelerinin Kısa süreli dayanan bir dönüşüm protokolü geliştirilmiştir. Demetilasyon adım hemen gerekli terminali fenotip elde etmek için izin veren bir özel farklılaşma protokolü 9-11 tarafından takip edilir. Bu yöntem, farklı soy hücreleri içine olgun farklılaşmış hücreleri dönüştürmek mümkün olup viral vektörlerin kullanımı ve bir egzojen transkripsiyon faktörleri transfeksiyon hem de önlemek için önemli bir avantaja sahiptir. istikrarlı bir pluripotent devletin satın alma ve istikrarsızlık hücre ile ilgili artmış duyarlılık da önlenir.
9-13 hem de köpek kullanılmıştır yaklaşım, geniş bir etkinlik ve dayanıklılık göstermektedir (Eser sunulmuştur).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aşağıda tarif edilen tüm işlemler, steril koşullar laminer akış başlığı altında yapılmalıdır. kendi kullanım boyunca 37 ° C'de tüm kültür prosedürleri termostatik kontrollü aşamalarında yürütülmektedir ve hücreler korunur emin olun.
1. Cilt fibroblast İzolasyonu
- Kültür kabı kaplama solüsyonu hazırlamak
- su (nihai konsantrasyon% 0.1), 100 ml domuz jelatin 0.1 g. otoklav ile çözüm sterilize edin.
- 35 mm Petri tabaklarda steril% 0.1 domuz jelatin 1.5 ml ilave edilir. Oda sıcaklığında onları korumak, kaplamak için 2 saat bekleyin.
Not: İnsan deri biyopsileri ön kol ön yüzünde bir avasküler bölgesine lokal anestezi altında eksizyon ile toplanmış ve kullanımdan önce + 4 ° C'de% 2 antibiyotik antimikotik çözelti takviye edilmiş Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde depolanır.
- Yeni PBS ile yıkayın biyopsileri% 2 antibi ile takviyeotik antimikotik çözüm.
- Bir yerde bir 100 mm Petri kabındaki biyopsileri ve steril neşter ile yaklaşık 2 mm 3 parça halinde kesilmiş.
- fragmanları kaplama hemen önce kaplama çözeltisi aşırı çıkarın.
- önceden kaplanmış 35 mm Petri kabı içine 5-6 deri parçaları yerleştirin.
- fibroblast kültür ortamı hazırlayın:% 77 Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), yüksek glukoz,% 20 fetal sığır serumu (FBS),% 1 L-Glutamin çözeltisi ve% 2 antibiyotik antimikotik çözelti.
- % 5 CO2 içinde 37 ° C de, her parçanın (fragman genellikle her 100 ul) ve kültür onları fibroblast ortamının bir damlacık ekleyin.
- 24 saat sonra,% 5 CO2 içinde 37 ° C sıcaklıkta nemli tutmak için parçaları üzerinde fibroblast kültür ortamında 500 ul ekle.
- en az bir kez pipet her 48 saat ile orta değiştirin.
- İnkübasyon 6 gün sonra, dikkatlice doku parçaları kaldırmak ve atın.
Not: 6 gün sonra, fibroblasts doku parçaları dışında büyümek ve bir hücre tek tabaka oluşturacak şekilde başlarsınız. - , Orta Yenile fibroblast kültür ortamının 2 ml ilave edilir ve CO2 inkübatör% 5, 37 ° C 'de, hücre tek tabakalı kültürü, devam etmektedir.
2. fibroblast Kültür
- 37 ° C 'de kültür fibroblastlar% 5 CO2 içinde 80% konfluansa kadar
- doku kültürü yemekleri Pasajlanması, aspirat fibroblast kültürü ortamı için. PBS 4 ml hücreleri üç kez yıkayın% 1 antibiyotik antimikotik çözelti ile takviye edilmiştir.
- Tripsin-EDTA solüsyonu (0.5 g / L domuz tripsin ve 0.2 g / L EDTA) ince bir tabaka (kültür ortamı hacminin% 10'u) ekleyin ve hücre tekli-tabakası doku altından ayırmak başlayana kadar 37 ° C'de inkübe kültür çanak ve hücreler ayırmak.
- tripsin eylemi etkisiz hale getirmek fibroblast kültürü ortamında 9 parça ile hücre süspansiyonu seyreltilir. Santrifüj gerekli değildir.
- Yeni kültür yemekleri Levha hücreleri (ilejelatin üzerinden) ve Kültür,% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de dayanıklılığı. Büyüme hızına bağlı olarak, 4: 2 ve 1: 1 arasında geçiş oranı tutun.
- Hücreler (haftada genellikle iki kez)% 80 civarında izdiham, geçit onlara ulaşır.
Epigenetik Dönüşüm 3. fibroblast Kaplama
- Hücre kültür tabaklarına 0.26 ml /% 0.1 domuz jelatin cm2 (1.1 de tarif edildiği gibi hazırlandı) ekleyin. kaplamak için 2 saat bekleyin.
- fibroblastlar kaplama öncesinde kaplama çözümü fazlalığı 10-30 dk çıkarın.
- kültür kaplarından fibroblast kültürü ortamı çıkarın. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın% 1 antibiyotik antimikotik çözüm ile desteklenmiş.
- Tripsin-EDTA solüsyonu (0.5 g / L domuz tripsin ve 0.2 g / L EDTA) ince bir tabaka (kültür ortamı hacminin% 10'u) ekleyin ve hücre tekli-tabakası doku altından ayırmak başlayana kadar 37 ° C'de inkübe kültür çanak ve hücreler ayırmak.
- fibrobl 9 parça hücre süspansiyonu seyreltilirAST kültür ortamı tripsin işlemi nötralize etmek.
- Oda sıcaklığında, bir mikroskop altında bir sayım odası kullanarak hücreleri sayın. / Cm2 7.8 x 10 4 fibroblastlann bir hücre konsantrasyonu elde etmek üzere, hücreler tekrar süspansiyon fibroblast kültür ortamı gerekli hacmi hesaplanır. Bu, kullanılan odanın belirli türüne bağlı olacaktır.
Hücreler / ul = küçük ızgara x 90 (çarpım faktörü) x seyreltme başına hücre ortalama sayısı - Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 150 g'de santrifüje hücre süspansiyonu. fibroblast kültürü ortamı önceden hesaplanmış hacmi ile supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarmak.
- % 0.1 jelatin önceden kaplanmış tabaklar ve% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 24 saat süre ile kültür bunları plakası hücreleri.
De-metile Ajan 5-aza-CR Kullanılması 4. Artış Hücre Plastisitesi
- gün 0
- DMEM yüksek glükoz medi 10 ml 5-aza-CR 2.44 mg çözülmesiyle 5-aza-CR stok çözelti hazırlayınum. filtrasyon ile sterilize edin. kullanımdan hemen önce 5-aza-CR stok hazırlayın.
- fibroblast kültür ortamında (nihai konsantrasyon 1 uM), 1 ml 5-aza-CR stok çözeltisi 1 ul seyreltilir.
- Hücre esneklik, hücre kaplama (alt pozisyon 3.8) 24 saat sonra artırmak için, tohumlanmıştır fibroblastlardan kültür ortamı çıkarın ve CO2 inkübatör% 5, 37 ° C de 18 saat 1 uM 5-aza-CR stok çözeltisi ve kültürü ilave edin.
- 1.gün
- Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, taze insan pluripotent (HP) orta hazırlayın.
- 1 uM 5-aza-CR inkübasyondan sonra, 5-aza-CR uzaklıkta durulanır sağlamak için üç kez PBS ile Ortamı çıkarın ve hücreleri yıkayın.
- Inkübe 5-aza-CR,% 5 CO2 içinde 37 ° C de 3 saat (geri kazanım dönemi) için HP ortam ile muamele edilmiş fibroblastlar.
- iyileşme süresinden sonra, orta kaldırmak üç kez PBS ile yıkayın.
- 5-aza-CR tedavisinin etkinliğini izlemek için, bu adım f kontrolveya morfolojik değişikliklerin varlığı (Sonuçlar bölümünde ayrıntılı). Hücreler fibroblast tipik uzatılmış morfoloji kaybeder ve genişlemiş çekirdekleri ile, boyut olarak daha küçük olma yuvarlak veya oval bir şekil kazanır.
- Pankreas farklılaşma ile devam edin.
5. Pankreas Farklılaşma Protokolü
- gün 1-6
- Tablo 2'de tarif edildiği gibi pankreatik bazal ortam hazırlar.
- Bir stok solüsyonu aktivin hazırlayın: steril su 166.6 ul bir rekombinant insan proteini aktivin 5 ug çözülür.
- Kültür 5-aza-CR,% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 6 gün boyunca (5.1.2 bakınız) 1 ul / ml aktivin bir stok çözelti ile desteklenmiş, 0.26 mL / cm Pankreas bazal maddesi 2 fibroblastlar işlemden geçirildi. orta gazetesine değiştirin.
- gün 7-8
- retinoik ACI 50 mg dimetil sülfoksit (DMSO) 16.6 ml ekleyerek retinoik asit stok çözelti hazırlayınd.
- Pankreas Bazal Ortamda 0.26 ml / cm2 Kültür hücreleri 1 ul / ml 37 ° C de bir stok çözelti (5.1.2) ve 2 gün süre ile 1 ul / ml retinoik asit stok çözeltisi (5.2.1 bakınız) aktivin Cı ile desteklenmiş % 5 CO 2. orta gazetesine değiştirin.
- gün 9-36
- Pankreas Bazal Ortamda 0.26 ml / cm2 Kültür hücreleri (h / h), insülin transferin-selenyum (ITS),% 2 (v / v) ile B27 ve% 0.1 (h / h) Rekombinan insan FGF bazik% 1 ile desteklenen % 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de (bFGF) stok çözeltisi (Tablo 1 e bakınız). İlk 15 gün boyunca günde orta değiştirin.
- günden sonra 16, kültür çanak alt ayırmak olabilir agrega hücreleri oluşturan bu yana, bir mikroskop altında, her gün orta yenileyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
deri biyopsisi primer kültürün oluşturulması
Deri biyopsileri, küçük parçalar halinde kesilmiş ve jelatin önceden kaplanmış tabaklar içine yerleştirilmiştir. 6 gün sonra, fibroblastlar doku parçaları dışında büyümeye başladı ve bir hücre tek tabaka (Şekil 1A) kurdu. Hücreler tipik ince uzun bir şekle gösterdi ve beklendiği gibi, fibroblast spesifik bir işaretleyici vimentin (um, Şekil 1B) için tek tip bir bağışıklık-pozitif gösterilir.
5-aza-CR 18 saat maruz bırakıldıktan sonra deri fibroblastları morfolojik değişiklikler ve metilasyon motifi
insülin salgılayan hücrelere fibroblastlar başarılı epigenetik dönüşüm elde etmek için, de-metile madde, 5-aza-CR kullanılarak, plastikliği artmıştır. İnsan fibroblastları 7,8 x 10 4 fibroblastlar / cm2 'lik bir konsantrasyonda% 0.1 jelatin önceden kaplanmış tabaklar üzerine yerleştirildi. tohumlama sonra yirmi dört saat, hücreler were 18 saat 1 uM 5-aza-CR inkübe edildi.
Bu tedavinin sonunda, hücre fenotipinde geniş bir değişim (Mesaj 5-aza-CR, Şekil 2A) görünür. Tedavi edilmeyen fibroblastlar (T0, Şekil 2A) tipik uzatılmış morfoloji, yuvarlak veya oval şekil ile değiştirildi ve hücre boyutu oldukça küçük oldu. Sitoplazma, taneli oldu basık, ve hücreler kültür yüzeye yapışık idi. Çekirdekler büyük çıktı ve rahat bir kromatin yapısının bir sonucu olarak, boşluklu. Deneyimlerimize göre, bu morfolojik değişikliklerin varlığı gereklidir ve dikkatli bir şekilde 5-aza-CR tedavi etkinliği için bir marker olarak izlenmelidir.
18 saat maruz bırakma 5-aza-CR, küresel bir DNA metilasyon bir düşüş (aynı zamanda belirgindir ve açıkça 5-metilsitidin immün azalan yoğunluğu ile ortaya sonra Derinin epigenetik dönüşümü sırasında morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler insülin salgılayan hücrelerin içine fibroblastlar İlk aşama esnasında, hücreler endoderm kararlılığını teşvik etmek için aktivin A ile takviye edilmiş Pankreas Bazal Ortamda 7 gün süre ile kültüre edildi. Bu aralıkta, daha yavaş yavaş basık ve hücreler kümeler (Günlük 7, Şekil 3A) organize etmeye başladı. Daha sonra, pankreas dizi farklılaşma 2 gün retinoik asit ilavesiyle yükseltildi. Bu tedaviye yanıt olarak hücreler, bir ağ desen yeniden düzenlenir ve açıkça ayırt hücre agrega (gün 10, Şekil 3A) arttı. kümeleme oluşumu proses zamanla artmıştır ve daha fazla B27, bFGF ve ITS hücre maruz oluşan üçüncü ve son aşama ile uyarıldı. Bu büyük 3D kolonilerinde toplanmış hücrelerin giderek artan sayıda (Gün 20 Şekil 3A) işe yol açtı. Gün 36 civarında, bu koloniler olarak in vitro tipik pankreas adacıklarının (Gün 36, Şekil 3A) anımsatan farklı yuvarlak yapılar ortaya çıktı. Yeni EpiCC fenotip elde edilmesi işlem görmemiş fibroblastlar (5 mC gün 36 Şekil 3B) gözlenenler ile dönen küresel bir DNA metilasyon seviyesi kademeli bir artış eşlik etmiştir. pankreatik indüksiyon 36 gün sonra, epigenetik dönüşüm verimliliği de muamele edilmemiş fibroblastlarda başlangıçta tespit edilememiştir tipik olgun pankreas markerlerin ekspresyonu, (T0 ile gösterilmiştir, Tablo 1: Malzeme çözümleri. Tablo 2: Malzeme çözümleri.
pankreatik farklılaşmasını teşvik etmek için, 5-aza-CR tedavi fibroblastlar hemen 3 saat iyileşme süresinden sonra, pankreas indüksiyonu için üç aşamalı protokol maruz bırakılmıştır. 
Şekil 1: İzolasyon ve insan derisi fibroblast karakterizasyonu doku parçaları dışında büyüyen fibroblast (A) Temsilcisi görüntü.. (B) Fibroblastlar kendi s için tek tip bağışıklık pozitifliği görüntülerpecific işaretleyici vimentin (um). Çekirdekler DAPI ile boyandı. (Ölçek barlar, 100 mikron). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 2: İnsan deri fibroblastları morfolojik ve metilasyon değişiklikleri 5-aza-CR tedaviden sonra (a) tanecikleştirilmiş uzun bir şekle (T0) gösteren muamele edilmemiş fibroblast Örnek görsel ve bir yuvarlak ya da oval morfoloji 5-aza-CR tedavi fibroblastlar. sitoplazma ve genişlemiş ve vakuole çekirdekler (Mesaj 5-aza-CR). (Ölçek barlar, 100 mikron). (B) Genel DNA metilasyonu bir azalma 5-aza-CR tedaviden sonra (Post 5-aza-CR) tespit edilebilir. (Ölçek barlar, 50 mikron). Cl LütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya ick. 
Şekil 3:. Epigenetik dönüşümü sırasında morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler (A) endokrin pankreas farklılaşması sırasında meydana gelen morfolojik değişiklikler Temsilcisi resimler. indüksiyon 7 gün sonra, insan hücreleri kademeli olarak kümeler (Günlük 7) organize. retinoik asit ilave yanıt olarak, ayırt agregatları (10. Gün) ve retiküler desen ve kümedeki yeniden. Bu oluşumlar (Gün 20) hücrelerin alımı ve büyük 3D koloniler halinde toplayarak, zamanla ilerleme. Son olarak, koloniler ayırmak ve in vitro olarak, tipik pankreatik adacıkların (Gün 36) andıran bir kültür ortamı içinde, serbest bir akış eğilimi küresel yapılar haline gelir. (Ölçek barlar, 100 mikron). Pankreatik 36 gün sonra (B)tim, muamele edilmemiş fibroblastlar (5 mC gün 36) 'de gözlenenden insan EpiCC dönüş, küresel bir DNA metilasyon seviyesi. (Ölçek çubuğu, 50 mikron). endokrin pankreas belirteçler muamele edilmemiş fibroblastlar (T0) tamamen yok iken Cı-PEP ile PDX1 eş-lokalizasyonu, geçiş dönemi (Gün 36) sonunda tespit edilebilir. (Ölçek barlar, 100 mikron). 20 mM D-glükoz ve 20 mM L-glukoz maruz kalmaya bağlı olarak (C) EpiCC insülin salma. Barlar üç bağımsız çoğaltır ± SD ortalamasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Malzeme / Ekipman Adı Birim (h / h) Yorumlar / Açıklama Ham F-10 Besin Karışımı % 40 DMEM düşük glukoz % 40 Nakavt Serum Yedek % 10 FBS % 5 Antibiyotik antimikotik çözümü % 1 L-Glutamin çözeltisi % 1 MEM temel olmayan amino asitleri çözelti % 1 2-merkaptoetanol stok % 1 2-merkaptoetanol hamur hazırlama: Steril 5 ml PBS içinde bir 2-merkaptoetanol diluite 3.5 ul. + 4 ° C'de karanlıkta muhafaza edilmelidir. Not: 2 hafta içinde kullanın Nükleozid karışımı stok % 1 Hazır karışımların hazırlanması nükleosid: 0.042 g guanozin, 0.040 g adenozin 0.036 g sitidin, 0.036 g üridin ve steril 50 ml su içinde 0.012 g Timidine çözülür. çözmek için 50 ° C'de erir. Filtrat ile sterilize4 ° C'de iyon ve mağaza ESGRO (LİF) % 0.1 Rekombinant İnsan FGF temel (bFGF) stok % 0.1 bFGF hamur hazırlama: 5 ml ilave% 0.1 bFGF, 25 ug PBS içinde Sığır Serum Albumin (BSA) Malzeme / Ekipman Adı Birim (h / h) Yorumlar / Açıklama DMEM / F-12 % 93 B-27 Ek Eksi A vitamini % 2 N-2 Ek % 1 MEM temel olmayan amino asitleri çözelti % 1 Antibiyotikantimikotik çözümü % 1 2-merkaptoetanol stok % 1 2-merkaptoetanol hamur hazırlama: Steril 5 ml PBS içinde bir 2-merkaptoetanol diluite 3.5 ul. + 4 ° C'de karanlıkta muhafaza edilmelidir. Not: 2 hafta içinde kullanın L-Glutamin çözeltisi % 1 BSA stok % 1 BSA stokunun hazırlanması: 50 ml su içinde 250 mg çözülür. + 4 ° C'de filtrasyon ve mağaza tarafından sterilize edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
bu yazıda bir dokuya özgü indüksiyon protokolü takiben 5-aza-CR geçici ve kısa maruz kalma ile, insülin üreten hücreler, insan deri fibroblast dönüşümünü sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım transkripsiyon faktörleri veya microRNA zorla ifade ne de hücreler daha istikrarsız ve hatalar 14 eğilimli kılan istikrarlı bir pluripotent devletin satın alma olmadan, mezodermden endoderm ilgili hücrelere bir anahtar verir.
İlk adımda, hücre plastisite terminal açıdan farklılaşmış hücreleri, geçici bir tersinir izin verin durumun indükleyen sentetik epigenetik değiştirici sayesinde artırılır. Özellikle, 5-aza-CR deri fibroblast hücrelerinin, küresel metilasyon bir azalmaya neden olmak için kullanılmıştır. 5-aza-CR doğrudan metil-transferaz aktivitesi inhibe ettiği ve yeni sentezlenen DNA de novo metilasyonu önlediği bilinmektedir. Çünkü etkisinden dolayı, bu molekülDaha önce sessiz genlerin yeniden etkinleştirmek için, hem de ökaryotik hücrelerde 15,16 farklılaşması durumlarını değiştirmeye kullanılmıştır. Buna uygun olarak, yayınlamak 5-aza-CR deri fibroblastları, bu deneyler için kullanılan hücrelerin plastikleşme geliştirmek için 5-aza-CR yeteneğini gösteren genel bir DNA, demetilasyon (Şekil 2A) göstermektedir. Bu 5-aza-CR neurosphere hücreleri (NSC'lerde) 17 yüksek plastiklik ilişkili işaretleyici Ekim-4 ifadesini kolaylaştıran gözlem ile uyumlu olarak aynı zamanda. Bununla birlikte, bu yayın 5-aza-CR deri fibroblastları 5-aza-CR çıkarılmasından sonra orijinal fenotipe geri ilginçtir. Gerçekten de, daha önce fibroblastlar yüksek plastisite durumu epigenetik değiştirici yanıt olarak, alınan belirten orijinal kültür ortamına pluripotense ilgili faktörler 9,10 ayarlanmalarını ifade geri olduğunu göstermiştir, geçici döner ve içermeyen t kalıcı değişikliklerO hücreleri.
Hücre morfolojisi işaretlenmiş değişiklikler daha yüksek bir plastisite durumu (Şekil 2A) uyarılmasını eşlik etti. muamele edilmemiş fibroblast hücreleri tipik uzatılmış hücre gövdeleri farklılaşmış hücrelerin daha büyük çıktı daha küçük boyutlara ve artan çekirdek hacmi sunulan yuvarlak veya oval hücreler ile değiştirilmiştir. Niwa bir Pluripotency ilgili özellik 18 olarak açıklanan rahat kromatin yapısı bu nükleer genişlemeyi korelasyon. vakuole çekirdekleri ve zerre sitoplazma gibi artmış düzleştirmek morfolojisinin, belirgindir. pratik dönüştürme protokolünün ilk bölümü başarılı bir şekilde tamamlanması için bir belirteç olarak kullanılabilir anlatılan tüm morfolojik değişiklikler; değişiklikler mevcut deneyimlerimiz, 5-aza-CR gerçekten daha hoşgörülü bir devlet elde etmek için hücrelere yardımcı olmuştur.
Geçici "yüksek UDS yararlanmak mümkündürtamamen farklı bir fenotipe doğru hücreleri sürücü sivity zaman penceresi ". Bu protokol, yeri 5-aza-CR fibroblastlar, belirli bir farklılaşma ortama karşılık olarak, pankreatik beta hücre benzeri hücreler yeniden ele edilebileceğini göstermektedir. protokolü kullanıldı hücreler endoderm soy ait bir hücre popülasyonuna bir mezoderm kaynaklı hücre tipinden geçiş yapmanızı sağlar.
Muamele edilmemiş olan deri fibroblast başlangıçta tespit edilememiştir İnsülin, farklılaşma protokolü (Şekil 3B) sonunda pozitifti. Belirli bir beta hücre soyu yanında kendi ekzokrin, endokrin ve duktal hücre popülasyonlarının - Bu pankreas bütünün farklılaşmada rol oynayan bu PDX1 gibi diğer faktörlere, aynı anda ifade eşlik etti. Bu beta-hücrelerinin bir diferansiyasyon olgunlaşmamış hücrelerin tasarımlarıyla ile tabakalandı sadece elde belirten fare embriyonik kök hücreleri önceki çalışma (ESC) ile tutarlıdırLangerhans mimarisinin pankreas adacık tarafından sağlanan yerel mikro-çevre, güçlü bir işlevsel bir role sahip olduğunu düşündüren r endokrin hücreleri 19.
Nitekim, EpiCC olgun farklılaştırılmış fenotip elde ve 20 mM glukoz poz (Şekil 3) cevap yeteneğini gösterdi. İnsülin aktif ensülin üreten değildir (Şekil 3C) ve EpiCC arasında iyi niyetli teyit D-glikoz stimülasyon 1 saat sonra, kültür ortamı içinde salınan edildi.
Başarılı bir prosedür için bir ayrı gereklilik steril laminer akış ve mikroskop altında ele dahil olmak üzere tüm adımlarda, 37 ° C'de hücrelerin titiz bakım vardır. Deneyimlerimize göre, aynı zamanda son derece önce kültür içinde kullanımlarına taze reaktif hazırlamak ve protokole göre orta sıkı yenilemek için tavsiye edilir. Bu işlem, oluşturucu, toplam hücre yana mikroskop altında gerçekleştirilmelidirkültür çanak alt ayırmak ve orta değişiklikler sırasında kaybolmuş olabilir.
Epigenetik dönüşüm protokolü de başarılı bir şekilde insanlar için tarif edilen hücre sayısı / cm 2 ve de-metile edici madde konsantrasyonu kullanılarak, domuz türlere ve köpek (Eser sunulmuştur) uygulanmıştır.
Sonuç olarak, başka bir hücre türü içine deri fibroblast dönüşüm sağlayan bir protokol sunulmuştur. açıklanan strateji, bir epigenetik tabanlı hücre dönüşüm avantajları vardır: Kansere yol açabilecek hücreleri geride bırakmak olabilecek bir pluripotent devleti önlemek için, yani imkanı; hücrelerde kalan değişikliklere neden olabilir dışsal genetik faktörlerin ortadan kaldırılması. Bu avantajlar translasyonel tıp uygulamaları için mevcut yaklaşımı son derece umut verici hale ve hasta spesifik hücre tedavisi için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Carraresi Vakfı ve Diyabet Araştırmaları için Avrupa Vakfı (EFSD) tarafından finanse edildi. GP Milano Üniversitesi'nden bir post-doc bursu tarafından desteklenmektedir. Epigenetik ve Periconception çevre ve BM1308 Paylaşımı büyük hayvan modellerinde gelişmeler MALİYET Eylem (Salaam): Yazarlar MALİYET Eylem FA1201 EPICONCEPT üyeleridir. TALB'e MALİYET Eylem CM1406 epigenetik Kimyasal Biyoloji (EPICHEM) üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm Petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm Petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1 µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
- Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
- Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
- Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
- Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
- Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
- Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
- Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
- Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
- Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
- Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
- Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
- Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).
