Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

العزلة وتمايز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الخنزير تحت الجلد الدهنية الأنسجة

doi: 10.3791/53886 Published: March 31, 2016

Introduction

السمنة، موجودة في حوالي 30٪ من السكان في الولايات المتحدة الأمريكية، مع مؤشر كتلة الجسم أكثر من 30، وقد برز بوصفه ظاهرة عالمية منتشرة 1. السمنة تميل إلى أن يؤدي إلى مضاعفات ذات الصلة بما في ذلك أمراض القلب والشرايين والسكري من النوع 2، والسرطان 2-4. لذلك، والتعامل مع السمنة هو أولوية هامة. ويتجلى البدانة والتوسع الهائل في الأنسجة الدهنية، والتي تعزى إلى استهلاك المفرط للطعام ونمط الحياة المستقرة في المجتمع الحديث. وبالتالي، فك رموز تنظيم النسخي من تكون الشحم وتكون الدهون يمكن أن تبشر لعلاج داء السكري أو السمنة 5.

وقد تم تطبيق 3T3-L1، 3T3-F442A وغيرها من الماوس مكون الشحم خطوط الخلايا لدراسة تكون الشحم أو تكون الدهون خلال تطوير الأنسجة الدهنية. ومع ذلك، هناك بعض التناقضات في الآليات التنظيمية بين خطوط الخلايا في المختبر، والحيوانات في الجسم الحي (6). الأساسي الدهنية-درعيالخلايا الجذعية فيد (ADSC) في الخلية جزء-انسجة الأوعية الدموية ويمكن أن تكون معزولة مباشرة من الأنسجة الدهنية البيضاء والتي يسببها للتمييز. تمايز ADSC في الخلايا الشحمية الأكثر احتمالا يلخص عملية تكون الشحم وتكون الدهون في تنمية الأنسجة الدهنية في الجسم الحي 7.

الخنازير هي نماذج حيوانية مناسبة لدراسة تكون الشحم وتكون الدهون في تنمية الأنسجة الدهنية. لدينا دراسات الخنازير السابقة 8-10 تثبت أن التعبير عن ستيرول تنظيمي ملزم عنصر عامل النسخ 1C (SREBP1c)، وهو عامل النسخ المهم المعروف أن تعدل النسخ من شحمي المنشأ سينسيز الأحماض الدهنية، وتحول دون الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (بوفا) في الكبد الخنازير والأنسجة الدهنية. التعبير عن SREBP1c الخنازير بنسبة بوفا في المجراة في المختبر يشبه الأنواع الأخرى مثل البشر والفئران 11-13. هذه الدراسات الخنازير في المختبر هي في المقام الأول في مهرجان دبي السينمائي الدوليالخلايا الشحمية erentiated المستمدة من ADSC الخنازير (pADSC). لذلك، هذه الثقافة الخلية الأولية من pADSC يمكن استخدامها لتكون بمثابة نظام الهاتف الخلوي يمكن الاعتماد عليها لدراسة تطوير الأنسجة الدهنية أو غيرها من تطبيقات الخلايا الجذعية.

Protocol

ملاحظة: تم تأسيس هذه الطريقة واستخدامها في الأبحاث ذكرت سابقا 14-17 من هذا المختبر. مع مرور الوقت تم تعديل منهجية. تم تنفيذ الإجراء الحالي باستخدام متوسط ​​60 غرام من الأنسجة الدهنية تحت الجلد الخنازير من خنزير صغير واحد (7-9 أيام من العمر) مع البذر على لوحات زراعة الأنسجة 6-جيدا. تم تنفيذ كافة الإجراءات في RT ما لم يعين خلاف ذلك. تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في جامعة تايوان الوطنية.

1. إعداد الهضم المتوسطة

  1. الحصول على الأنسجة الدهنية تحت الجلد من العنق والظهر. 40-80 غرام لكل خنزير صغير (7-9 أيام من العمر)، وهذا يتوقف على حجم الخنازير. هنا، استخدم 60 غرام من الأنسجة الدهنية تحت الجلد تم الحصول عليها من خنزير واحد.
  2. إعداد المتوسطة الهضم: وزن مسحوق كولاجيناز الثاني مع ما مجموعه 54000 وحدة، وحله في 90 مل Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM،60 غرام من الدهون) في 100 مل زجاجة المصلية (900 وحدة من كولاجيناز / 1.5 مل DMEM / غرام من الدهون).
  3. تستنهض الهمم بلطف المتوسط ​​الهضم على طاولة شاكر (100 دورة في الدقيقة) لمدة 15 دقيقة على الأقل إلى حل ومن ثم تمرير المتوسطة الهضم من خلال مرشح 0.22 ميكرون للتعقيم. تخزين عند 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.

2. تشريح تحت الجلد الدهنية الأنسجة من الخنازير

  1. تعقيم جميع الأدوات والمنتجات الزجاجية والبلاستيكية ودافئة جميع وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. التضحية خنزير صغير مع الكهربائية استنزاف مذهلة وأو باستخدام طريقة وفقا للوائح IACUC المحلية. أداء تشريح بعناية وعلى الفور بعد أن يتم التضحية الخنازير.
  3. وضع خنزير صغير على طاولة الجراحة النظيفة (التي تواجه احتياطية والبطن أسفل). يحلق الشعر من الخلف خنزير صغير إزالة كل الشعر من الرقبة الى الذيل وعلى الجانبين وصولا الى خط الوسط.
  4. فرك الجلد الظهري الخنزير بنسبة 7.5٪ povidone-اليود ثلاث مرات (مع ثلاثة الدعك مستقلة جديدة) ثم تسمح اليود على الجلوس على سطح البشرة لمدة حوالي 10 دقيقة.
  5. إزالة بوفيدون اليود مع البخاخات متعددة من الايثانول 70٪. استخدام قطع من الشاش أو أوراق الأنسجة التي تحتوي على 70٪ من الإيثانول لمسح الجلد في اتجاه واحد، وتكرار حتى يتم احترام أي لون واضح من بوفيدون اليود.
  6. استخدام مشرط لفصل الخنزير الطبقة الظهرية الدهون من الأنسجة الدهنية تحت الجلد مع طبقة الجلد المرفقة من العضلات في حين يمسك الدهون والجلد باستخدام ملقط.
  7. على الفور تزج طبقة الدهون من الأنسجة الدهنية تحت الجلد مع الجلد تعلق في كوب تعقيمها (200 مل) التي تحتوي على DMEM المصل خالية.
  8. رش خارج الكأس الذي يحتوي على طبقة الدهون مع 70٪ من الإيثانول ومكان في غطاء تدفق الصفحي ثقافة الخلية. ضع كبير (40 سم × 30 سم) تعقيم طبقة ثلاثية احباط غطاء في غطاء محرك السيارة. [يستخدم طبقة ثلاثية لضمان سلامة مستمرة.]
  9. ضع الالأنسجة مع الجلد لأسفل على احباط غطاء.
  10. تقليم الأنسجة العضلية المتبقية الخروج من الأنسجة الدهنية باستخدام ملقط ومقص لتجنب التلوث مع الأنسجة العضلية.
  11. خفض الدهون إلى قطع مربعة (~ 7 سم × 7 سم) مع مشرط أو مقص. وضع هذه القطع من طبقة الدهون في كوب تعقيم جديد (200 مل) التي تحتوي على DMEM المصل خالية.
  12. تعيين حامل شريحة مخصصة على احباط غطاء تجميعها مع شفرة الفولاذ الكربوني تقطيع اللحم (الشكل 1). خذ قطعة واحدة من الدهن من كوب ووضعه على تقطيع اللحم (طبقة الجلد على أعلى والدهون طبقة أدناه).
  13. شريحة طبقة الدهون من الأنسجة الدهنية تحت الجلد إلى حوالي 1 ملم قطع سميكة. شريحة الطبقة الدهنية من الجلد أقرب وقت ممكن ولكن تشريح الجلد تجنبها.
  14. اللحم المفروم شرائح الأنسجة الدهنية مع مقص غرامة قدر الإمكان.
  15. إضافة المتوسطة الهضم المصفاة التي تحتوي على كولاجيناز إلى 250 مل دورق مخروطي أو زجاجة المصلية مع مفرومالأنسجة الدهنية (54000 وحدة من كولاجيناز / 90 مل DMEM / 60 غرام من الدهون).
  16. احتضان ودوامة دورق مخروطي في 45 دورة في الدقيقة شاكر المداري لمدة 90 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للكولاجيناز لهضم أنسجة.
    ملاحظة: تحقق كل 15 إلى 30 دقيقة لتجنب الإفراط في الهضم. اكتمال عملية الهضم إذا كانت متوسطة الهضم هو الطين بدون كتل الأنسجة كبيرة.
  17. إضافة حجم مساو (مساويا لمتوسط ​​الهضم) من مستنبت يحتوي DMEM / F12 مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لوقف عملية الهضم كولاجيناز.

الشكل 1
وتتكون الشكل 1. تقطيع مخصصة تستخدم لعزل pADSC. تشريح الأنسجة الدهنية من ظهري الخنازير الأنسجة الدهنية تحت الجلد طبقة الدهون مع طبقات الجلد المرفقة. مطلوب تقطيع اللحم لشريحة طبقة الدهون حوالي 1 مم مع تجنب الإفراطتشريح في طبقات الجلد. من اليسار إلى اليمين: حامل شريحة، وسادة تقطيع اللحم، شفرة الكربون الصلب وتقطيع اللحم، ومسامير. يتم إدخال تقطيع شفرة بين حامل شريحة ولوحة تقطيع اللحم عند تجميعها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. جمع من pADSC من الكسر-اللحمية الأوعية الدموية

  1. تمرير المتوسطة الهضم التي تحتوي على الأنسجة الدهنية هضمها من خلال طبقة واحدة من الشيفون إلى تعقيم 250 مل دورق مخروطي نظيفة أو 250 مل زجاجة المصلية. استخدام ملقط لخفض منتصف الشيفون لتوجيه ومساعدة مرور الملخص.
  2. استنزاف وتحريف الشيفون مع ملقط لإكمال مرور.
  3. توزيع المتوسطة الهضم إلى أربع 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية (~ 40 مل المتوسطة في أنبوب).
  4. أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة لجمع بيليه من خلايا انسجة الوعائية.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 6 دقائق. صب وطاف.
  6. إضافة 10 مل العازلة تحلل ACK ثم resuspend الكرية من قبل pipetting. السماح لها الوقوف لمدة 7 دقائق (5-10 دقيقة) في RT لليز خلايا الدم الحمراء في جزء-انسجة الوعائية.
  7. إضافة كميات متساوية من DMEM (10 مل) لوقف التفاعل مع اهتزاز لطيف من الأنبوب ثم الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 10 دقيقة.
  8. صب وطاف، إضافة 10 مل DMEM إلى كل أنبوب، resuspend الكرية مع pipetting لالمتكررة، وأجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 6 دقائق. كرر مرتين.
  9. جمع وتمرير DMEM (ما مجموعه 40 مل DMEM من 4 أنابيب يمثلون 60 غرام من الدهون) مع خلايا مع وقف التنفيذ من خلال مصفاة 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد.
  10. بلطف ميدي ماصةأم عدة مرات لخلط جيدا وقسامة 20 ميكرولتر من المتوسطة التي تحتوي على خلية مختلطة مع 180 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان حل الأزرق (01:10 تمييع) في أنبوب جديد 1.5 مل إيبندورف.
  11. عدد الخلايا مع عدادة الكريات ثم pADSC البذور في مناطق ذات كثافة من 60،000 خلية / سم 2 في الصعود إلى الحجم المطلوب من طبق ثقافة أو لوحة مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على DMEM / F12، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ المضادات الحيوية البنسلين حل ب -streptomycin-أمفوتيريسين (P / S / A). عموما، البذور وpADSC على لوحات زراعة الأنسجة 6-جيدا لخلية شحمية أو التمايز خلية عظمية. البذور وpADSC على أطباق 10 سم لتلطيخ علامة سطح الخلايا الجذعية أو التمايز خلية غضروفية.
  12. احتضان لوحات أو أطباق في الحاضنة 37 درجة مئوية في الهواء مع 5٪ CO 2 للسماح مرفق الخلية إلى لوحات.

4. تحديد علامات الجذعية خلايا سطح pADSC بواسطة التدفق الخلوي

  1. بعد 24 ساعة، وإزالة المتوسطة تماما، وغسل والعشرينه 10 سم طبق مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وخلايا الحصاد مع 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  2. تحييد التربسين-EDTA مع كميات متساوية من مستنبت (1 مل)، وجمع خلايا في أنبوب مخروطي 15 مل الجديد، ثم الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 7 دقائق.
  3. صب وطاف. يغسل بيليه مرتين في 3 مل العازلة FCS غسل الجليد الباردة (PBS تحتوي على 10٪ FBS) باستخدام اعادة تعليق من قبل pipetting جانب الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 7 دقائق.
  4. و resuspend، عد، وضبط pADSC إلى 10 6 خلية / مل في المخزن FCS غسل الجليد الباردة. مكان الخلايا (100 ميكرولتر / كل أنبوب) الى عدة أنابيب مخروطية 15 مل جديدة واحتضان الأنابيب التي تحتوي pADSC في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الأجسام المضادة ضد أي CD4a فيكوإيريترين، مترافق (CD4a-PE)، CD29-PE، CD31-PE ، CD44-PE، CD45-PE، CD90-PE، MHC I-PE أو MHC II-PE لتلطيخ المباشر. وقف رد فعل عن طريق غسل الخلايا مرتين في 10 مل العازلة FCS غسل يقترن مع 400 × ز centrifugatايون لمدة 7 دقائق.
  5. إصلاح و resuspend الخلايا في عازلة تثبيت (PBS مع 0.01٪ FBS و 1٪ الفورمالديهايد) لالتدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ونشر رسائلنا السابقة (18).

5. تمايز pADSC في الخلايا الشحمية، خلية عظمية وغضروفية

  1. تمايز pADSC في الخلايا الشحمية
    1. إعداد خلية شحمية الحث المتوسطة وخلية شحمية المتوسطة الصيانة
      1. لخلية شحمية الحث المتوسطة، وإعداد 1 لتر من المصل خالية DMEM / F12 (مع المضادات الحيوية من 1٪ P / S / A) التي تحتوي على ما يلي: 1 مل الأسهم الأنسولين (10 ملغ / مل العازلة HEPES، ودرجة الحموضة 8)، اضرب النهائي = 10 ميكروغرام / مل. 1 ميكرولتر الأسهم T3 (3،3 '، 5 Triiodo-L-ثيرونين، 1 ملم في DMSO)، اضرب النهائي = 1 نانومتر. 200 ميكرولتر الأسهم ترانسفيرين (50 ملغ / مل مزدوج H المقطر 2 O)، نهائي اضرب = 10 ميكروغرام / مل. 100 ميكرولتر الأسهم ديكساميثازون (10 ملم في الإيثانول)، اضرب النهائي = 1 ميكرومتر. 100 سهم روزيجليتازون ميكرولتر (10 ملم في DMSO)، اضرب النهائي= 1 ميكرومتر.
      2. إعداد خلية شحمية المتوسطة صيانة مع نفس الإضافات باعتبارها وسيلة تحريض، ولكن مع إغفال ديكساميثازون.
    2. عملية التمايز عن الخلايا الشحمية
      ملاحظة: بعد البذر pADSC على 6 لوحات جيدا، وسوف متموجة pADSC خلال 72 ساعة.
      1. بعد 3 أيام، وإزالة المتوسطة تماما ثم قم بإضافة 3 مل من المتوسط ​​خلية شحمية الاستقراء في كل بئر. العودة لوحات لالحاضنة، وهذا هو اليوم صفر من التمايز.
      2. بعد 3 أيام، وإزالة المتوسطة خلية شحمية تحريض تماما واستبدالها مع 3 مل من المتوسط ​​الصيانة خلية شحمية كل ثلاثة أيام. سيتم الخلايا الشحمية ناضجة متباينة عضال لا شفاء منه حوالي 9 أيام. أكثر من 90٪ من الخلايا الشحمية يتم التمييز جيدا باستخدام هذا البروتوكول. هذه الخلايا الشحمية على استعداد للنفط الأحمر يا تلطيخ.
  2. تمايز pADSC إلى خلية عظمية
    1. إعداد المتوسطة خلية عظمية الاستقراء: جامعة المدينة العالمية ثقافة كاملةم (DMEM / F12 مع FBS 10٪ و 1٪ P / S / A) التي تحتوي على 1 ميكرومتر ديكساميثازون، 10 ملي β-سكرولي و 50 ميكروغرام / مل أسكوربات-2-الفوسفات.
    2. عملية التمايز لخلية عظمية
      ملاحظة: بعد البذر pADSC على 6 لوحات جيدا، وسوف متموجة pADSC خلال 72 ساعة.
      1. بعد 3 أيام، وإزالة المتوسطة تماما وإضافة 3 مل من المتوسط ​​خلية عظمية الاستقراء في كل بئر. العودة لوحات ل37 درجة مئوية الحاضنة. هذا هو اليوم صفر من التمايز.
      2. استبدال المتوسطة خلية عظمية تحريض كل ثلاثة أيام. سوف خلية عظمية ناضجة تشكل قبل 14 يوما من التمايز. هذه خلية عظمية جاهزة للالصبغ الأحمر S تلطيخ.
  3. تمايز pADSC إلى غضروفية
    1. إعداد خلية غضروفية المتوسطة الاستقراء: αMEM تحتوي على 1٪ FBS، 6.25 ميكروغرام / مل الانسولين، 50 ميكروغرام / مل أسكوربات-2-الفوسفات، و 10 نانوغرام / مل عامل النمو المحول-β1.
    2. عملية التمايز لغضروفية بعد البذر pADSC على أطباق ثقافة 10 سم لمدة 24 ساعة، وإزالة مستنبت تماما وغسل الأطباق مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    3. يعرض للتريبسين pADSC مع 1 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لمدة 5 دقائق، ثم تحييد مع مستنبت 1 مل. جمع والاعتماد وضبط pADSC في أنابيب مخروطية 15 مل مع كثافة 2.5 × 10 5 خلايا في أنبوب. استخدام عدادة الكريات لحساب الخلايا.
    4. بعد الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 7 دقائق، تجاهل طاف دون الإخلال بيليه وإضافة 1 مل من المتوسط ​​خلية غضروفية الاستقراء في أنبوب 15 مل. يتم إرجاع أنبوب إلى 37 درجة مئوية الحاضنة. هذا هو اليوم صفر من التمايز.
    5. استبدال المتوسطة خلية غضروفية تحريض كل ثلاثة أيام دون إزالة الخلايا على القاع. سوف غضروفية ناضجة تشكل في ما يقرب من 14 يوما. هذه غضروفية جاهزة للطولويدين الأزرق يا تلطيخ.

6. تلون متباينة الخلايا الشحمية، Osteocyقسم التدريب والامتحانات وغضروفية

  1. النفط الأحمر يا تلطيخ لالخلايا الشحمية متباينة
    1. في يوم 9، وإزالة خلية شحمية المتوسطة الصيانة في لوحات ثقافة 6 جيدا مع الخلايا الشحمية متباينة، وبعد ذلك غسل لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني. [في الخطوات التالية، إضافة الكواشف المعين كافية لتغطية كل بئر من لوحة 6 جيدا.]
    2. إصلاح الخلايا الشحمية مع 10٪ من محلول الفورمالين لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    3. إزالة حل الفورمالين 10٪ وغسل لوحة مرتين مع الماء المقطر المزدوج.
    4. بعد سنتين يغسل، إضافة 100٪ بروبيلين غليكول إلى لوحة الثقافة واسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة.
    5. إزالة 100٪ بروبيلين غليكول ثم إضافة زيت الأحمر يا حل (0.5٪ في غليكول البروبيلين) إلى لوحة الثقافة. اسمحوا الوقوف لمدة 10 دقيقة على الأقل على شاكر الروك مع الإثارة لطيف (100 دورة في الدقيقة).
    6. إزالة الحل النفط الأحمر O ثم قم باستبدال مع 60٪ بروبيلين غليكول. اسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة.
    7. إزالة 60٪ بروبيلين غليكول ثم يغسل لوحة مرتين مع دالمياه ouble المقطر.
    8. استبدال 10٪ من محلول الفورمالين. قطرات الدهون الملون داخل الخلايا الشحمية جاهزة للمراقبة بواسطة المجهر الضوئي.
    9. الكمي من الخلايا النفط الأحمر O (الخطوات الاختيارية أدناه): بعد الملاحظة المجهرية، وإزالة 10٪ من محلول الفورمالين وغسل لوحة مرتين مع الماء المقطر المزدوج.
    10. استنزاف لوحة تماما، وإضافة 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى لوحة 6 جيدا.
    11. السماح الأيسوبروبانول يقف في لوحة 6 جيدا على شاكر الروك لطيف (100 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة على الأقل إلى حل صبغ النفط الأحمر O.
    12. نضح الأيسوبروبانول التي تحتوي على النفط الأحمر يا وتوزيعها على لوحة 96-جيدا. قياس استخراج النفط الأحمر يا باستخدام القراءة طيفية في 510 نانومتر.
  2. الصبغ الأحمر الأحمر S تلطيخ لخلية عظمية متباينة
    1. في يوم 14، وإزالة المتوسطة خلية عظمية تحريض من 6 لوحات بشكل جيد مع خلية عظمية متباينة، وتغسل الصحون مرتين مع برنامج تلفزيوني. [في followiنانوغرام الخطوات، إضافة الكواشف المعين كافية لتغطية كل بئر من لوحة 6 جيدا.]
    2. إصلاح خلية عظمية في 10٪ من محلول الفورمالين لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    3. إزالة حل الفورمالين 10٪ من كل بئر وغسل لوحة مرتين مع الماء المقطر المزدوج.
    4. بعد سنتين يغسل، إضافة 2٪ الصبغ الأحمر S الحل (درجة الحموضة = 4،1-4،3) إلى لوحة 6 جيدا واسمحوا الوقوف لمدة 15 دقيقة على الأقل على شاكر الروك لطيف (100 دورة في الدقيقة).
    5. إزالة الصبغ الأحمر S الحل ثم يغسل لوحة مرتين مع الماء المقطر المزدوج.
    6. استبدال 10٪ من محلول الفورمالين. خلية عظمية مستعدون للمراقبة بواسطة المجهر الضوئي.
  3. طولويدين الأزرق يا تلطيخ لغضروفية متباينة
    1. في يوم 14، نضح خلية غضروفية الحث المتوسطة من 15 مل أنبوب مخروطي الشكل دون إزالة الرواسب من غضروفية متباينة في الجزء السفلي من الأنبوب وغسل أنبوب مرتين مع برنامج تلفزيوني. [في الخطوات التالية، إضافة الكواشف المعين كافية لتغطية ايةص غضروفية في الجزء السفلي من أنبوب أو على قسم الشرائح.]
    2. إصلاح غضروفية في 10٪ من محلول الفورمالين لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    3. إزالة حل الفورمالين 10٪ من كل أنبوب وغسل أنبوب مرتين مع الماء المقطر المزدوج.
    4. بعد سنتين يغسل، وتضمين الكريات في أكتوبر مجمع وقسم مع ناظم البرد في سمك من 5 ميكرون.
    5. وصمة عار على شريحة من المقاطع ناظم البرد مع طولويدين الأزرق يا حل (0.1٪ مع درجة الحموضة 4.1).
    6. إزالة طولويدين الأزرق يا الحل ثم يغسل قسم مرتين مع الماء المقطر المزدوج.
      ملاحظة: غضروفية على الشرائح مستعدون للمراقبة بواسطة المجهر الضوئي.

Representative Results

وكانت المصنفة في pADSC المشتقة من الخنازير الدهون تحت الجلد الظهري على لوحات ثقافة أو أطباق ويظهر في الشكل (2). ومورفولوجية pADSC المستمدة من جزء-انسجة الوعائية يشبه الفأر أو ADSC البشري. أربع وعشرين ساعة بعد البذر، والالتزام subconfluent pADSC ويكون موسعة تشبه الخلايا الليفية مورفولوجيا (الشكل 2A). سوف pADSC تصبح متكدسة خلال 72 ساعة وعلى استعداد للخلية شحمية أو غيرها الوسيطة من نوع التمايز (الشكل 2B). pADSC يحمل إمكانات مكون الشحم قوية بعد تحريض الكيميائية والخلايا الشحمية ناضجة يمكن ملاحظتها بعد 9 أيام من التمايز مع أكثر من 90٪ من pADSCs يظهر التمايز مكون الشحم (الشكل 2C).

لمعالجة خصائص pADSC المستمدة في هذا البروتوكول، وجرى تقييم علامات سطح pADSC التدفق الخلوي الشرجيسيس. كما هو مبين في الشكل (3)، علامات سطح الخلايا الجذعية الوسيطة، بما في ذلك CD29، CD44، CD90 ومعقد التوافق النسيجي الكبير (أو HLA I)، ابديت للغاية. كانت علامات سطح السلبية، مثل CD4a، CD31، CD45 وMHC II (أو HLA II) للكشف بالكاد في pADSC مشتقة في البروتوكول (الشكل 3). هذه النتائج تثبت أن هذه pADSC معرض الوسيطة من نوع خصائص الخلايا الجذعية دون البطانية كبيرة أو تلوث الخلية الجذعية المنتجة للدم، بما في ذلك النخاعي أو اللمفاوية الأسلاف.

لمزيد من تأكيد أن pADSC تمثل الخلايا الجذعية الوسيطة، تم فحص multipotency من pADSC من التمايز في الخلايا الشحمية، خلية عظمية وغضروفية. كانت ملطخة هذه الخلايا الشحمية، خلية عظمية وغضروفية من الأصباغ محددة، النفط الأحمر O، الصبغ الأحمر S، وطولويدين الأزرق O، على التوالي (الشكل 4). وتشير هذه البيانات إلى أن هذا البروتوكول إنشاء pADSC التي احتفظت موltipotency مع الخصائص الكاملة تشبه الوسيطة من نوع الأسلاف.

الشكل 2
الشكل 2. مورفولوجيا pADSC من الخنازير إلى الوراء المنطقة الدهون. (A) Subconfluent pADSC الالتزام وتوسعت بعد 24 ساعة البذر على طبق ثقافة 6 جيدا. (ب) pADSC أصبح متموجة بعد 72 ساعة البذر على طبق ثقافة 6 جيدا. وقد لوحظت الخلايا الشحمية (C) الناضجة بعد 9 أيام من التمايز مكون الشحم من pADSC. واتخذت صورة في 100 × التكبير باستخدام المجهر النقيض من المرحلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تحديد الخلايا الجذعيةوقد تم رد فعل علامات سطح لpADSC 1 × 10 5 من pADSC مع الاجسام المضادة المحددة وتحليلها لعلامات الخلايا الجذعية عن طريق تحليل التدفق الخلوي. الأرقام تشير إلى النسبة المئوية للخلايا الملون في عدد السكان (الأحمر) مقارنة مع سيطرة غير ملوثين. يمثل محور س كثافة مضان النسبية. يمثل المحور ص السكان من الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
تم تحديد الشكل 4. متعددة القدرات التفريق بين pADSC. Multipotency من pADSC عن طريق التفريق pADSC إلى (أ) الخلايا الشحمية، (ب) خلية عظمية (C) غضروفية والبقع بسبب الأصباغ التمثيلية، النفط الأحمر O، الصبغ الأحمر S، وطولويدين الأزرق O، على التوالي . معهد العالم العربياتخذت غيس في (A) 100 × (ب) 200 ×، و (ج) 100 × التكبير باستخدام مجهر تباين الطور، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هنا نقدم نظام الهاتف الخلوي يمكن الاعتماد عليها لدراسة تطوير الأنسجة الدهنية في الثقافة الخلية الأولية من pADSC. بالمقارنة مع خطوط الخلايا الأخرى خلد، وهذه الطريقة توفر وسيلة مريحة لعزل كميات كبيرة من جودة عالية خلايا اللحمة المتوسطة الكبار الجذعية التي يمكن تطبيقها على دراسة عمليات تمايز الخلايا الشحمية أو غيرها من الأنساب الوسيطة ذات الصلة بالتنمية الحيوانية في الجسم الحي. الخطوة تعديل حاسمة في هذا البروتوكول هو أن نستمدها pADSC باستخدام خنزير صغير القديم 7- إلى 9 أيام لأنه من السهل التعامل معها خنزير صغير صغير بالمقارنة مع الخنازير القديمة وعلى غرار الأنواع الأخرى 19،20، والعائد وmultipotency من pADSC يتناقص ال 21 خنزير الأعمار.

وتشمل مصادر الخلايا الجذعية المحتملة الخلايا الجذعية الجنينية (ESC)، الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (IPSC)، والخلايا الجذعية البالغة بعد الولادة. القيد من ADSC، تصنف على أنها خلايا جذعية متعددة القدرات الكبار، هو أن multipotency من خلايا جذعية للبالغينفي التفريق بين السلالات المختلفة محدود نسبيا بالمقارنة مع ESC أو التوجيهية. ومع ذلك، والقضايا الأخلاقية المتعلقة اشتقاق ESC وأنكجنيك خصائص IPSC كبح تطبيق ESC وIPSC 22،23. لذلك، ركزت العديد من المحققين على الخلايا الجذعية للبالغين مع الجهود الرامية إلى تعزيز تعدد القدرات. المصدر الأكثر شيوعا من خلايا البالغين الجذعية الوسيطة (MSC)، التي طالما درس، والعظام المستمدة من نخاع الخلايا الجذعية الوسيطة 24. ومع ذلك، يعتبر حصد نخاع العظام إجراء مؤلم نسبيا. قلق آخر هو أن العائد من الخلايا الجذعية من نخاع العظم هو محدود. aspirates نخاع العظم العائد بمعدل 6 × 10 6 خلايا الأنوية لكل مل، وMSC تمثل سوى 0،001-0،01٪ من جميع الخلايا الأنوية. بعد النظر في هذه السلبيات، ويقترح ADSC كمصدر أقل فظاظة للحصول على خلايا جذعية متعددة القدرات 25،26.

القيود المفروضة على استخدام ADSC في regeneraTIVE الطب تعتمد إلى حد كبير على محصول الخلية والجودة. ولذلك، فإن أهمية توظيف الخنازير لعزل ADSC في هذا البروتوكول هو لانتاج كمية كبيرة من الخلايا الجذعية البالغة جودة عالية. الخنزير هو نموذج حيواني مفيد تمثل البشر بسبب حجم الجهاز مقارنة والعديد من أوجه التشابه الفسيولوجية والبيوكيميائية بين الأنواع 27-30. الحصول على hADSC من الشركات التجارية غير مكلفة وفي كثير من الحالات قد تم التلاعب بها الخلايا، passaged أو cryopreserved. الحصول على العينات السريرية البشرية من الصعب نسبيا بسبب قضايا أخلاقية وإنتاج ADSC محدودة. نحن نستمد حوالي 6 × 10 5 hADSC في غرام من الدهون بعد الهضم كولاجيناز. مع 100 غرام من الإناث الأنسجة الدهنية الثدي (متوسط ​​أخذ العينات)، أي ما مجموعه 6 × 10 7 خلايا يمكن حصاده. باستخدام الماوس الفردية، والعائد محدودة أكثر. ما مجموعه 1 × 10 6 خلايا يمكن أن تحصد من 0.4 غرام من ط الماوس تحت الجلدالأنسجة الدهنية nguinal من مباراتي الذهاب والماوس FVB الكبار (6-8 أسابيع من العمر). ولكن في خنزير فرد واحد (7-9 أيام من العمر)، أي ما مجموعه 2 × 10 8 خلايا يمكن أن تحصد بسهولة من 60 غرام من الأنسجة الدهنية تحت الجلد تم الحصول عليها من ظهري مستودع الدهون. وpADSC المستمدة في هذا البروتوكول يكون الكامل الوسيطة من نوع multipotency وعلامات المناسبة الخلايا الجذعية الوسيطة. لذلك، pADSC هي مصدر مواتية للحصول على كميات كبيرة من الخلايا الجذعية للبالغين دون المساومة على جودة الخلايا الجذعية.

لا يقتصر تطبيق pADSC في فك رموز خلية شحمية التمايز بما في ذلك تكون الشحم وتكون الدهون. في الآونة الأخيرة، أصبحت ADSC مصدر شعبية للخلايا الجذعية في مجال 22،31،32 الطب التجديدي. بالمقارنة مع مصادر الخلايا الجذعية الأخرى، ADSC الاحتفاظ بميزة فريدة من التي يمكن الوصول إليها بسهولة وفيرة، وقد أثبتت multipotency من قوة ليكون مصدرا واعدا لعلاج الخلايا الجذعية والبريد الأنسجةngineering 22،33،34. لسهولة الوصول إليها من الأنسجة الدهنية يجعل ADSC واحدة من الطرق الأقل تدخلا للحصول على الأسلاف متعددة القدرات. في الآونة الأخيرة، ونحن متباينة pADSC في مجموعات إفراز الأنسولين الجلوكوز استجابة، مشيرا إلى أن pADSC لا تقتصر على الوسيطة التمايز (بيانات غير منشورة). كما تم تظاهر آخرون أن ADSC يمكن أن تكون متباينة في العديد من أنواع الخلايا المشتقة من طبقات جرثومية أخرى مثل خلايا الكبد الأديم الباطن (من hADSC 35 أو pADSC 36) أو الخلايا العصبية الأدمة (من hADSC 37 أو pADSC 38). وهكذا، pADSC يمكن استخدامها لمكافحة المخدرات والإنتاجية العالية أو فحص مادة بيولوجية عن طريق توجيه الخلايا لعمليات التمايز المتباينة لانتاج السلالات المرغوبة. لذلك، pADSC المستمدة في هذا البروتوكول لديهم إمكانية تطبيقها في العلاج بالخلايا الجذعية وزراعة الأنسجة لبحوث الطب التجديدي.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أعرب عن امتناني لجميع أعضاء مختبر لمناقشة مستفيضة ويدعم تقنية في هذا البروتوكول. وأيد الأبحاث التي أجريت في المختبر من المنح المقدمة من وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST 103-2314-B-002-126 والأكثر 102-2313-B-002-026-MY3) ومن المنح المقدمة من هدف لخطة جامعة الأعلى (104R350144) من الجامعة الوطنية، تايوان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-040
DMEM/F-12, HEPES Life Technologies 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biological Industries 04-001-1  
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution Biological Industries 03-033-1 For antibiotics and antimycotic usage
αMEM, no nucleosides  Life Technologies 12561-049
ACK lysis buffer  Life Technologies A10492-01
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Life Technologies 25200072
CD4a-PE Sigma-Aldrich SAB4700063
CD29-PE Sigma-Aldrich SAB4700398
CD31-PE Sigma-Aldrich SAB4700467
CD44-PE Sigma-Aldrich SAB4700183
CD45-PE Sigma-Aldrich SAB4700483
CD90-PE Sigma-Aldrich SAB4700686
HLA Class I-PE (MHC I)  Sigma-Aldrich SAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II)  Sigma-Aldrich SAB4700662
Insulin  Sigma-Aldrich I9278
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T6397
Transferrin  Sigma-Aldrich T2036
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich I7018
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D4902
Rosiglitazone Cayman 71740
β-Glycerophosphate  Sigma-Aldrich G9422
2-Phospho-L-ascorbic acid  Sigma-Aldrich 49752
TGFB1 Recombinant Human Protein  R&D Systems  240-B-002
Oil Red O  Sigma-Aldrich O0625
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Carbon Steel Blades Thomas Scientific 6727C18
Falcon 100 µm cell strainer Corning  352360
Falcon 6-well plate Corning  353046
Falcon 100 mm  dish Corning  353003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
  2. Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335, (28), 30-32 (2012).
  3. Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
  4. Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
  5. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
  6. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
  7. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. (2013).
  8. Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
  9. Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
  10. Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
  11. Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
  12. Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
  13. Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
  14. Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
  15. Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
  16. Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
  17. Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
  18. Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
  19. Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
  20. Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
  21. Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
  22. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
  23. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
  24. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
  25. Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
  26. Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
  27. Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
  28. Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
  30. Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
  31. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
  32. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
  33. Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
  34. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
  35. Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
  36. Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
  37. Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
  38. Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).
العزلة وتمايز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الخنزير تحت الجلد الدهنية الأنسجة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).More

Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter