This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.
Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.
मोटापा, संयुक्त राज्य अमेरिका में जनसंख्या, एक बॉडी मास इंडेक्स के साथ के बारे में 30% में मौजूद 30 से अधिक, एक प्रचलित दुनिया भर में घटना 1 के रूप में उभरा है। मोटापे की वजह से हृदय रोग, टाइप -2 मधुमेह, कैंसर और 2-4 सहित संबंधित जटिलताओं के लिए नेतृत्व करने के लिए जाता है। इसलिए, मोटापे के साथ निपटने के लिए एक महत्वपूर्ण प्राथमिकता है। मोटापे की वजह से वसा ऊतकों का बड़े पैमाने पर विस्तार से प्रकट होता है, और अत्यधिक भोजन की खपत और आधुनिक समाज में एक आसीन जीवन शैली के लिए जिम्मेदार ठहराया है। इसलिए, वसाजनन और lipogenesis के transcriptional विनियमन का गूढ़ रहस्य मोटापा या मधुमेह के इलाज के लिए 5 वादा पकड़ सकता है।
3T3-एल 1, 3T3-F442A और अन्य माउस adipogenic सेल लाइनों वसा ऊतकों के विकास के दौरान वसाजनन या lipogenesis अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है। हालांकि, वहाँ 6 vivo में इन विट्रो में सेल लाइनों और पशुओं के बीच विनियामक तंत्र में कुछ फ़र्क है। प्राथमिक वसा देरीवेद स्टेम सेल (ADSC) stromal संवहनी सेल अंश में सफेद वसा ऊतकों से सीधे पृथक और अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। Adipocytes में ADSC के भेदभाव की संभावना सबसे अधिक विवो 7 में वसाजनन और वसा ऊतकों के विकास में lipogenesis की प्रक्रिया का स्मरण दिलाता है।
सूअर वसा ऊतकों के विकास में वसाजनन और lipogenesis के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त पशु मॉडल हैं। हमारे पिछले अध्ययनों सुअर का 8-10 कि स्टेरोल नियामक तत्व बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक -1 सी (SREBP1c), एक महत्वपूर्ण प्रतिलेखन कारक lipogenic फैटी एसिड synthase की प्रतिलेखन मिलाना के लिए जाना जाता है की अभिव्यक्ति, सुअर का जिगर में फैटी एसिड (PUFA) से हिचकते का प्रदर्शन और वसा ऊतकों। Vivo में इन विट्रो में PUFA की कमी हुई सुअर का SREBP1c की अभिव्यक्ति ऐसे मनुष्यों और चूहों 11-13 के रूप में अन्य प्रजातियों के समान है। इन विट्रो में ये सुअर के अध्ययन के अन्तर में मुख्य रूप से कर रहे हैंerentiated सुअर का ADSC (pADSC) से व्युत्पन्न adipocytes। इसलिए, pADSC के इस प्राथमिक सेल संस्कृति वसा ऊतकों के विकास या अन्य स्टेम सेल अनुप्रयोगों के अध्ययन के लिए एक विश्वसनीय सेलुलर प्रणाली के रूप में सेवा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
यहाँ हम pADSC के प्राथमिक सेल संस्कृति में वसा ऊतकों के विकास का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय सेलुलर प्रणाली प्रस्तुत करते हैं। अन्य अमर सेल लाइनों की तुलना में, इस विधि उच्च गुणवत्ता वाले वयस्क mesenchymal स्टेम कोशिकाओं कि adipocytes या विवो में पशु विकास से संबंधित अन्य mesenchymal प्रजातियों के भेदभाव प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता की बड़ी मात्रा को अलग करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम संशोधित है कि हम एक 7 से 9 दिन पुरानी घेंटा उपयोग कर, क्योंकि यह पुराने सूअरों की तुलना में छोटा घेंटा संभालना आसान और अन्य प्रजातियों 19,20, उपज और pADSC की multipotency के समान है pADSC निकाले जाते है सुअर उम्र 21 के रूप में कम हो जाती है।
संभावित स्टेम सेल के सूत्रों भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी), प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSC), और प्रसव के बाद वयस्क स्टेम सेल शामिल हैं। ADSC की बाधा, वयस्क multipotent स्टेम कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत, वयस्क स्टेम कोशिकाओं की कि multipotency हैअलग-अलग प्रजातियों फर्क में अपेक्षाकृत ईएससी या IPSC के साथ तुलना में सीमित है। हालांकि, IPSC के ईएससी और ऑन्कोजेनिक संपत्तियों की व्युत्पत्ति के बारे में नैतिक मुद्दों ईएससी और IPSC 22,23 के आवेदन को नियंत्रित। इसलिए, कई जांचकर्ताओं pluripotency बढ़ाने के प्रयासों के साथ वयस्क स्टेम कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित किया है। वयस्क mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी), जो लंबे समय से अध्ययन किया गया है, का सबसे आम स्रोत अस्थि मज्जा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल 24 है। हालांकि, कटाई अस्थि मज्जा एक अपेक्षाकृत दर्दनाक प्रक्रिया माना जाता है। एक और चिंता यह है कि अस्थि मज्जा से स्टेम कोशिकाओं की उपज परिमित है। अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस मिलीलीटर प्रति 6 × 10 6 केन्द्रक की कोशिकाओं के एक औसत उपज, और एमएससी केवल सभी केन्द्रक की कोशिकाओं के 0,001 0.01% प्रतिनिधित्व करते हैं। इन कमियों पर विचार करने के बाद, ADSC एक कम निकला हुआ स्रोत multipotent स्टेम कोशिकाओं 25,26 प्राप्त करने के लिए के रूप में सुझाव दिया है।
regenera में ADSC के उपयोग पर सीमाएंसक्रिय चिकित्सा, निर्भर कर रहे हैं सेल उपज और गुणवत्ता पर काफी हद तक। इसलिए, सूअरों को रोजगार के इस प्रोटोकॉल में ADSC अलग-थलग करने के महत्व को उच्च गुणवत्ता वाले वयस्क स्टेम कोशिकाओं की एक बड़ी मात्रा में उपज है। सुअर एक उपयोगी पशु मॉडल तुलनीय अंग के आकार और प्रजाति 27-30 के बीच कई शारीरिक और जैव रासायनिक समानता की वजह से मनुष्य का प्रतिनिधित्व है। वाणिज्यिक कंपनियों से hADSC हासिल करना महंगा है और कई मामलों में कोशिकाओं को चालाकी से किया गया है, passaged या cryopreserved है। मानव नैदानिक नमूने हासिल करना नैतिक मुद्दों की वजह से अपेक्षाकृत मुश्किल है और ADSC के उत्पादन सीमित है। हम collagenase पाचन के बाद ग्राम वसा के अनुसार लगभग 6 x 10 5 hADSC निकाले जाते हैं। महिला स्तन वसा ऊतकों की 100 ग्राम (एक औसत नमूना) के साथ, 6 10 x 7 कोशिकाओं की कुल काटा जा सकता है। एक व्यक्ति माउस का प्रयोग, उपज भी अधिक सीमित है। 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं के कुल चमड़े के नीचे माउस मैं की 0.4 ग्राम से काटा जा सकता हैएक वयस्क FVB माउस के दोनों पैरों से nguinal वसा ऊतकों (6-8 सप्ताह पुराने)। हालांकि एक व्यक्ति सुअर (7 से 9 दिन पुरानी) में, 2 एक्स 10 8 कोशिकाओं की कुल आसानी से चमड़े के नीचे वसा पृष्ठीय वसा डिपो से प्राप्त ऊतक की 60 ग्राम से काटा जा सकता है। pADSC इस प्रोटोकॉल में निकाली गई पूर्ण mesenchymal प्रकार multipotency और उचित mesenchymal स्टेम सेल मार्कर है। इसलिए, pADSC स्टेम सेल गुणवत्ता से समझौता किए बिना वयस्क स्टेम कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने के लिए एक अनुकूल स्रोत हैं।
pADSC के आवेदन वसाजनन और lipogenesis सहित वसाकोशिका भेदभाव का गूढ़ रहस्य के लिए ही सीमित नहीं है। हाल ही में, ADSC पुनर्योजी चिकित्सा 22,31,32 के क्षेत्र में स्टेम कोशिकाओं का एक लोकप्रिय स्रोत बन गए हैं। अन्य स्टेम सेल के सूत्रों की तुलना में, ADSC आसानी से सुलभ और प्रचुर मात्रा में होने का एक अनूठा लाभ को बनाए रखने, और उनके मजबूत multipotency स्टेम सेल थेरेपी और ऊतक ई के लिए एक आशाजनक स्रोत होने के लिए प्रदर्शन किया गया हैngineering 22,33,34। वसा ऊतकों की आसान पहुंच ADSC कम से कम दखल तरीके multipotent progenitors मिल में से एक बनाता है। हाल ही में, हम ग्लूकोज उत्तरदायी इंसुलिन स्रावित समूहों में pADSC भेदभाव, यह दर्शाता है कि pADSC mesenchymal भेदभाव (अप्रकाशित डेटा) तक सीमित नहीं हैं। दूसरों को भी प्रदर्शन किया गया है कि ADSC कई प्रकार की कोशिकाओं में इस तरह के endodermal hepatocytes या बहिर्जनस्तरीय न्यूरॉन्स (hADSC 35 या 36 pADSC से) (hADSC 37 या 38 pADSC से) के रूप में अन्य रोगाणु परतों से निकाली गई में भेदभाव किया जा सकता है। इस प्रकार, pADSC अलग-अलग भेदभाव प्रक्रियाओं के लिए कोशिकाओं निर्देशन वांछित प्रजातियों उपज के द्वारा उच्च throughput दवा या biomaterial स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल में निकाली गई pADSC पुनर्योजी चिकित्सा अनुसंधान के लिए स्टेम सेल थेरेपी और ऊतक प्रत्यारोपण में संभावित आवेदन किया है।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों व्यापक चर्चा के लिए सभी प्रयोगशाला के सदस्यों के प्रति आभार व्यक्त करना चाहूंगा और तकनीक इस प्रोटोकॉल में समर्थन करता है। प्रयोगशाला में प्रदर्शन अनुसंधान विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (सबसे 103-2314-बी-002-126 और सबसे 102-2313-बी-002-026-MY3) और शीर्ष विश्वविद्यालय योजना के लिए उद्देश्य से अनुदान द्वारा राष्ट्रीय विश्वविद्यालय, ताइवान के (104R350144)।
Reagents | |||
Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-001-1 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution | Biological Industries | 03-033-1 | For antibiotics and antimycotic usage |
αMEM, no nucleosides | Life Technologies | 12561-049 | |
ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Life Technologies | 25200072 | |
CD4a-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700063 | |
CD29-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700398 | |
CD31-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700467 | |
CD44-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700183 | |
CD45-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700483 | |
CD90-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700686 | |
HLA Class I-PE (MHC I) | Sigma-Aldrich | SAB4700640 | |
HLA-DR-PE (MHC II) | Sigma-Aldrich | SAB4700662 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | |
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Rosiglitazone | Cayman | 71740 | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
2-Phospho-L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 49752 | |
TGFB1 Recombinant Human Protein | R&D Systems | 240-B-002 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Carbon Steel Blades | Thomas Scientific | 6727C18 | |
Falcon 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
Falcon 6-well plate | Corning | 353046 | |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 |