Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel

doi: 10.3791/53886 Published: March 31, 2016

Introduction

Obesitas, aanwezig in ongeveer 30% van de bevolking in de Verenigde Staten, met een body mass index van meer dan 30, is uitgegroeid tot een overwegende wereldwijd fenomeen 1. Obesitas heeft de neiging te leiden tot complicaties zoals hart- en vaatziekten, diabetes type 2 en kanker 2-4. Daarom is het omgaan met obesitas is een belangrijke prioriteit. Obesitas manifesteert zich door enorme expansie van vetweefsel, en wordt toegeschreven aan overmatig eten en een sedentaire levensstijl in de moderne samenleving. Vandaar dat het ontcijferen van de transcriptionele regulatie van adipogenese en lipogenese kon houden beloven om de behandeling van obesitas of diabetes 5.

De 3T3-L1, 3T3-F442A en andere muis adipogene cellijnen toegepast op adipogenese of lipogenese bestuderen bij de ontwikkeling van vetweefsel. Er zijn echter enkele verschillen in regulerende mechanismen tussen cellijnen in vitro en in vivo 6 dieren. Primaire vet-Derived stamcellen (ADSC) in de stromale-vasculaire cel fractie kan direct worden geïsoleerd van wit vetweefsel en geïnduceerd om te differentiëren. Differentiatie van ADSC tot adipocyten waarschijnlijk recapituleert het proces van adipogenese en lipogenese in vetweefsel ontwikkelen in vivo 7.

Varkens zijn een geschikt diermodel voor het bestuderen van adipogenese en lipogenese in de ontwikkeling van vetweefsel. Onze eerdere studies varkens 8-10 tonen aan dat expressie van sterol-regulerende element bindende transcriptiefactor 1c (SREBP1c), een belangrijke transcriptiefactor bekend lipogene transcriptie van vetzuursynthese te moduleren, wordt geremd door polyonverzadigde vetzuren (PUFA) in de varkenslever en vetweefsel. De expressie van varkens SREBP1c daalde PUFA in vivo en in vitro is vergelijkbaar met andere soorten, zoals mensen en muizen 11-13. Deze varkens studies in vitro zijn voornamelijk in differentiated adipocyten afgeleid van varkens ADSC (pADSC). Daarom kan deze primaire celkweek van pADSC worden gebruikt als betrouwbare cellulair systeem vetweefsel ontwikkeling worden stamceltoepassingen bestuderen.

Protocol

Opmerking: deze methode is vastgesteld en gebruikt in het onderzoek meldde eerder 14-17 van dit laboratorium; na verloop van tijd de methodologie werd aangepast. De huidige procedure werd uitgevoerd met een gemiddelde van 60 g varkens onderhuidse vetweefsels van een biggetje (7-9 dagen oud) met zaaien op 6-putjes weefselkweekplaten. Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven. Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) bij National Taiwan University.

1. Bereid Spijsvertering Medium

  1. Verkrijgen onderhuidse vetweefsel van de nek en rug; 40 tot 80 g per big (7-9 dagen oud), afhankelijk van de grootte van de varkens. Hier, gebruik maken van 60 g van het onderhuidse vetweefsel verkregen uit één varken.
  2. Bereid spijsvertering medium: weeg collagenase II poeder met een totaal van 54.000 eenheden en oplossen in 90 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM,60 g vet) in een 100 ml fles serologische (900 eenheden collagenase / 1,5 ml DMEM / g vet).
  3. Schud het digestiemedium op een schudtafel (100 opm) gedurende ten minste 15 min op te lossen en vervolgens de vertering medium door een 0,22 urn filter voor sterilisatie. Bewaar bij 4 ° C voor gebruik.

2. Dissect Onderhuids vetweefsel van varkens

  1. Steriliseer alle instrumenten, glas en plastic ware en warm alle media tot 37 ° C voor gebruik.
  2. Offeren biggetje met elektrische verdoving en leegbloeden of met een werkwijze volgens de plaatselijke IACUC voorschriften. Voer dissectie zorgvuldig en direct na biggen worden opgeofferd.
  3. Leg de biggen op een schone chirurgische tabel (terug naar boven en de buik naar beneden). Afscheren het haar van de big terug verwijderen van al het haar van de nek tot de staart en aan beide zijden tot aan de middellijn.
  4. Schrob het varken dorsale huid met 7,5% povidone-jood driemaal (met drie nieuwe onafhankelijke scrubs), waarna het jodium op de oppervlakte van de huid zitten voor ongeveer 10 minuten.
  5. Verwijder de povidonjood met meerdere sprays van 70% ethanol. Gebruik gaasjes of toiletpapier met 70% ethanol om de huid te reinigen van een richting, herhalen totdat geen duidelijke kleur van povidonjood waargenomen.
  6. Gebruik een scalpel varkens dorsale vetlaag van onderhuidse vetweefsels scheiden samen met de aangehechte huidlaag van de spieren terwijl het vet en huid behulp van een tang.
  7. Onmiddellijk dompel de vetlaag van het onderhuidse vetweefsel met aangehechte huid in een gesteriliseerde bekerglas (200 ml) met serumvrij DMEM.
  8. Spuit de buitenzijde van de beker die de vetlaag met 70% ethanol en in een laminaire stroming kap celkweek. Zet een grote (40 cm x 30 cm) gesteriliseerd drielaagse afdekfolie in de kap. [Een driedubbele laag wordt gebruikt om continue integriteit.]
  9. Plaats deweefsel met de huid naar beneden op de afdekfolie.
  10. Snijd de resterende spierweefsel af van het vetweefsel met behulp van pincet en een schaar om besmetting met spierweefsel te voorkomen.
  11. Snijd het vet in vierkante stukjes (~ 7 cm x 7 cm) met een scalpel of schaar. Deze verdelen van de vetlaag in een nieuwe gesteriliseerde bekerglas (200 ml) met serumvrij DMEM.
  12. Stel een aangepaste slice houder op de afdekfolie geassembleerd met een koolstofstalen snijmachine mes (figuur 1). Neem een ​​stuk van vet uit de beker en plaats het op de snijmachine (huidlaag bovenop en vetlaag onder).
  13. Snijd de vetlaag van het onderhuidse vetweefsel in ongeveer 1 mm dikke stukken. Snijd de vetlaag van de huid zo dicht mogelijk, maar voorkomen doorsnijden van de huid.
  14. Gehakt gesneden vetweefsel met schaar zo fijn mogelijk.
  15. Voeg gefilterd spijsvertering medium dat collagenase een erlenmeyer van 250 ml of een serologische fles met gehaktvetweefsel (54.000 eenheden van collagenase / 90 ml DMEM / 60 g vet).
  16. Incubeer en schud de kolf bij 45 rpm in een orbitale schudder gedurende 90 min bij 37 ° C om de collagenase om de weefsels te verteren.
    Opmerking: Controleer elke 15 tot 30 minuten om te voorkomen dat over-vergisting. Het verteringsproces is afgerond als de spijsvertering medium is een suspensie zonder noemenswaardige weefsel klonten.
  17. Voeg een gelijk volume (gelijk aan de digestiemedium) of kweekmedium dat DMEM / F12 met 10% foetaal runderserum (FBS) aan de collagenase digestie stoppen.

Figuur 1
Figuur 1. Een aangepast snijmachine gebruikt voor isolatie van pADSC. Ontlede vetweefsel van varkens dorsale subcutane vetweefsel bestaan ​​uit de vetlaag met aangrenzende huidlagen. Een snijmachine is vereist om de vetlaag ongeveer 1 mm dik met vermijden van over- snijdensnijden in de huidlagen. Van links naar rechts: De plak van de houder, snijmachine pad, koolstofstaal snijmachine mes en schroeven. Snijmachine blad wordt tussen slice houder en snijmachine pad als het wordt gemonteerd geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Inning van pADSC uit de stromale-vasculaire Fraction

  1. Voorbij de vertering medium dat het gedigereerde vetweefsel door een enkele laag van chiffon in een schone gesteriliseerde 250 ml Erlenmeyer of 250 ml serologische fles. Gebruik een tang om het midden van de chiffon te begeleiden en de passage van de digest te helpen drukken.
  2. Giet ze af en draai de chiffon met een tang om doorgang te voltooien.
  3. Verdeel de vertering medium in vier 50 ml conische centrifugebuizen (~ 40 ml medium per buis).
  4. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min naar het pellet van stromale-vasculaire cellen te verzamelen.
  5. Centrifugeer bij 700 xg gedurende 6 min. Schenk de bovenstaande vloeistof.
  6. Voeg 10 ml ACK lysis buffer en resuspendeer de pellet door pipetteren. Laten staan ​​7 minuten (5-10 min) bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren in de stromale-vasculaire fractie.
  7. Voeg gelijke hoeveelheden DMEM (10 ml) aan het reactiemengsel onder zachtjes schudden van de buis te stoppen en centrifugeer bij 700 xg gedurende 10 min.
  8. Decanteer het supernatant, voeg 10 ml DMEM aan elke buis, resuspendeer de pellet met herhaalde pipetteren en centrifugeer bij 700 xg gedurende 6 min. Herhaal dit twee keer.
  9. Verzamelen en passeren de DMEM (totaal 40 ml DMEM vanaf 4 buizen die 60 g vet) met gesuspendeerde cellen door een 100 urn zeef in een nieuwe 50 ml conische buis.
  10. Voorzichtig pipet medium meerdere malen goed en aliquot meng 20 pl celbevattende medium gemengd met 180 ul 0,4% trypan blauwe oplossing (1:10 verdunning) in een nieuwe 1,5 ml Eppendorf buis.
  11. Tel de cellen met een hemocytometer en zaad pADSC bij een dichtheid van 60.000 cellen / cm2 op een gewenste grootte van kweekschaal of platen met kweekmedium dat DMEM / F12, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotica penicilline -streptomycin-amfotericine B oplossing (P / S / A). In het algemeen, het zaad van de pADSC op de 6-well weefselkweek platen voor adipocyten of osteocyt differentiatie. Het zaad van de pADSC op 10-cm schalen voor oppervlakte marker kleuring van stamcellen of chondrocyten differentiatie.
  12. Incubeer de platen of schotels in de 37 ° C incubator in lucht met 5% CO2 tot celhechting aan de platen mogelijk.

4. Identificatie Stem-celoppervlaktemerkers van pADSC door flowcytometrie

  1. Na 24 uur, volledig verwijderen van het medium, th wassene 10-cm schaaltje tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), en oogsten cellen met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
  2. Neutraliseren trypsine-EDTA met gelijke hoeveelheden kweekmedium (1 ml), laat cellen in een nieuwe 15-ml conische buis en centrifugeer bij 400 xg gedurende 7 minuten.
  3. Schenk de bovenstaande vloeistof. Was de pellet twee keer in 3 ml ijskoude FCS-wasbuffer (PBS dat 10% FBS) middels resuspensie door pipetteren gekoppeld aan centrifugatie bij 400 xg gedurende 7 min.
  4. Resuspendeer, tellen, en pas pADSC tot 10 6 cellen / ml in ijskoud FCS-wasbuffer. Plaats cellen (100 pl / per buisje) in meerdere nieuwe 15-ml conische buis en incubeer buisjes die pADSC bij 4 ° C gedurende 30 min met antilichamen tegen ofwel phycoerythrine-geconjugeerd CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC I-PE of MHC II-PE voor directe kleuring. Stop de reactie door het wassen van de cellen tweemaal in 10 ml FCS-wasbuffer in combinatie met 400 × g centrifugation gedurende 7 min.
  5. Fix en resuspendeer cellen fixatie buffer (PBS met 0,01% FBS en 1% formaldehyde) voor flowcytometrie volgens de instructies van de fabrikant en onze eerdere publicatie 18.

5. Differentiatie van pADSC tot adipocyten, Osteocyten en chondrocyten

  1. Differentiatie van pADSC tot adipocyten
    1. Bereid adipocyten inductie medium en adipocyten onderhoud medium
      1. Voor adipocyten inductiemedium bereiden 1 L serumvrij DMEM / F12 (met antibiotica van 1% P / S / A) het volgende bevat: 1 ml insuline voorraad (10 mg / ml HEPES buffer, pH 8), eindconc = 10 ug / ml; 1 pl T3 voorraad (3,3 ', 5-trijood-L-thyronine, 1 mM in DMSO), eindconcentratie = 1 nm; 200 pl stock transferrine (50 mg / ml dubbel gedestilleerd H2 O), eindconcentratie = 10 ug / ml; 100 ul dexamethason voorraad (10 mmol in ethanol), eindconcentratie = 1 micrometer; 100 ul rosiglitazon voorraad (10 mM in DMSO), final conc= 1 uM.
      2. Bereid adipocyten onderhoudsmedium met dezelfde toevoegingen als inductiemedium, maar met weglaten van dexamethason.
    2. Differentiatie proces voor adipocyten
      Let op: Na het zaaien pADSC op 6-well platen, zal pADSC worden confluent binnen 72 uur.
      1. Na 3 dagen Verwijder het medium volledig en voeg 3 ml adipocyten inductie medium in elk putje. Zet de platen in de incubator. Dit is dag nul van differentiatie.
      2. Na 3 dagen, verwijder de adipocyten inductie medium volledig en te vervangen door 3 ml van adipocyten onderhoud medium om de drie dagen. Volwassen adipocyten zullen terminaal gedifferentieerd worden met ongeveer 9 dagen. Meer dan 90% van de adipocyten zijn goed gedifferentieerd gebruik van dit protocol. Deze adipocyten zijn klaar voor Oil Red O kleuring.
  2. Differentiatie van pADSC in osteocyten
    1. Bereid osteocyt inductie medium: compleet cultuur medium (DMEM / F12 met 10% FBS en 1% P / S / A) met 1 uM dexamethason, 10 mM β-glycerofosfaat en 50 pg / ml ascorbaat-2-fosfaat.
    2. Differentiatie proces voor osteocyten
      Let op: Na het zaaien pADSC op 6-well platen, zal pADSC worden confluent binnen 72 uur.
      1. Na 3 dagen, verwijder het medium volledig en voeg 3 ml osteocyt inductie medium in elk putje. Zet de platen om de 37 ° C incubator. Dit is de dag nul van differentiatie.
      2. Vervang osteocyt inductie medium om de drie dagen. Volwassen osteocyten zal vormen met 14 dagen van differentiatie. Deze osteocyten zijn klaar voor alizarinerood S kleuring.
  3. Differentiatie van pADSC tot chondrocyten
    1. Bereid chondrocyten inductie medium: aMEM bevattende 1% FBS, 6,25 ug / ml insuline, 50 ug / ml ascorbaat-2-fosfaat en 10 ng / ml transformerende groeifactor-β1.
    2. Differentiatie proces voor chondrocyten Na zaaien pADSC op 10-cm kweekschalen gedurende 24 uur, verwijder kweekmedium volledig en afwassen tweemaal met PBS.
    3. Trypsinize pADSC met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 min, en vervolgens neutraliseren met 1 ml kweekmedium. Verzamelen, tellen pas pADSC in 15 ml conische buizen met een dichtheid van 2,5 x 10 5 cellen per buis. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen.
    4. Na centrifugatie bij 400 xg gedurende 7 minuten, verwijder de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en voeg 1 ml van chondrocyten inductie medium in een 15 ml buis. De buis wordt teruggegeven aan de 37 ° C incubator. Dit is de dag nul van differentiatie.
    5. Vervang de chondrocyten inductiemedium drie dagen zonder het verwijderen van cellen op de bodem. Rijpe chondrocyten zal vormen ongeveer 14 dagen. Deze chondrocyten zijn klaar voor Toluidine Blue O kleuring.

6. kleuring van gedifferentieerde adipocyten Osteocytes en chondrocyten

  1. Oil Red O kleuring voor gedifferentieerde adipocyten
    1. Op dag 9, verwijderen vetcellen onderhoud medium in 6-putjes met gedifferentieerde adipocyten en was daarna de plaat tweemaal met PBS. [In de volgende stappen, voeg genoeg aangewezen reagentia aan elk putje van de 6-well plaat bedekken.]
    2. Fix adipocyten met 10% formaline oplossing gedurende tenminste 10 minuten.
    3. Verwijder de 10% formaline oplossing en was de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water.
    4. Na twee wasbeurten, voeg 100% propyleenglycol in de petrischaal en laat gedurende 1 minuut.
    5. Verwijder de 100% propyleenglycol en voeg Oil Red O-oplossing (0,5% in propyleenglycol) in de petrischaal. Laat staan ​​gedurende ten minste 10 minuten op een shaker rocker zacht schudden (100 rpm).
    6. Verwijder de Oil Red O-oplossing en vervolgens te vervangen door 60% propyleenglycol. Laat staan ​​voor 1 min.
    7. Verwijder de 60% propyleenglycol en was daarna de plaat tweemaal met double gedestilleerd water.
    8. Vervang met 10% formaline-oplossing. De gebrandschilderde vetdruppels binnenkant van adipocyten zijn klaar voor observatie door lichtmicroscopie.
    9. Kwantificering van intracellulaire Oil Red O (hieronder optionele stappen): na microscopische observatie, verwijderen 10% formaline-oplossing en was de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water.
    10. volledig Tap de plaat en voeg 500 ul van isopropanol aan de 6-wells plaat.
    11. Isopropanol laat staan ​​in de 6-well plaat op een zachte rocker schudapparaat (100 rpm) gedurende ten minste 10 min aan de kleurstof met Oil Red O. oplossen
    12. Zuig het isopropanol dat Oil Red O en verspreiden op een 96-wells plaat. Kwantificeren van de gewonnen olie rode O met behulp van een spectrofotometrische aflezing bij 510 nm.
  2. Alizarinerood S kleuring voor gedifferentieerde osteocyten
    1. Op dag 14, verwijder osteocyten inductiemedium van 6-well platen met gedifferentieerde osteocyten en was de platen tweemaal met PBS. [In de following stap, voeg genoeg aangewezen reagentia aan elk putje van de 6-well plaat bedekken.]
    2. Fix osteocyten in 10% formaline oplossing gedurende tenminste 10 minuten.
    3. Verwijder de 10% formaline-oplossing uit elk putje en was de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water.
    4. Na twee wasbeurten, voeg 2% Alizarin Red S oplossing (pH = 4,1-4,3) bij de 6-well plaat en laat gedurende tenminste 15 minuten op een zachte rocker schudapparaat (100 rpm).
    5. Verwijder de alizarinerood S oplossing en was daarna de plaat tweemaal met tweemaal gedestilleerd water.
    6. Vervang met 10% formaline-oplossing. Osteocyten zijn klaar voor observatie door lichtmicroscopie.
  3. Toluïdine blauw O kleuring gedifferentieerde chondrocyten
    1. Op dag 14, zuig chondrocyten inductiemedium van de 15 ml conische buis zonder het verwijderen van sedimenten van gedifferentieerde chondrocyten in de bodem van de buis en was het buisje tweemaal met PBS. [In de volgende stappen, voeg genoeg aangewezen reagentia cover chondrocyten in de bodem van de buis of het gedeelte dia.]
    2. Fix chondrocyten in 10% formaline oplossing gedurende tenminste 10 minuten.
    3. Verwijder de 10% formaline-oplossing uit elke buis en was het buisje tweemaal met tweemaal gedestilleerd water.
    4. Na twee wasbeurten, pellets insluiten in OCT verbinding en gedeelte met een cryostaat met een dikte van 5 urn.
    5. Vlekken op de schuif van de cryostaat secties met Toluidine Blue O-oplossing (0,1% bij pH 4,1).
    6. Verwijder toluïdineblauw O-oplossing en was daarna de sectie tweemaal met tweemaal gedestilleerd water.
      Opmerking: Chondrocyten op dia's zijn klaar voor observatie door lichtmicroscopie.

Representative Results

De pADSC afgeleid van varken dorsale subcutane vet werden gezaaid op de kweekplaten of schotels en figuur 2. De morfologie van de pADSC afgeleid van de stromale-vasculaire fractie vergelijkbare muizen- of menselijke ADSC. Vierentwintig uur na het zaaien worden subconfluente pADSC gehecht en een uitgebreide fibroblastachtige morfologie (figuur 2A). De pADSC zal confluent worden binnen 72 uur en zijn klaar voor adipocyten of andere mesenchymale-type differentiatie (figuur 2B). pADSC sterke adipogenic potentieel vertonen na chemische inductie en mature adipocyten kunnen worden waargenomen na 9 dagen van differentiatie meer dan 90% van de pADSCs tonen adipogene differentiatie (figuur 2C).

De kenmerken van pADSC verkregen in dit protocol te pakken, werden oppervlaktemerkers van pADSC beoordeeld door flowcytometrie analetion. Zoals getoond in figuur 3, oppervlaktemerkers van mesenchymale stamcellen, waaronder CD29, CD44, CD90 en MHC I (of HLA I) werden sterk tot expressie. Negatieve oppervlaktemerkers, zoals CD4a, CD31, CD45 en MHC II (of HLA II) waren nauwelijks detecteerbaar in pADSC verkregen in het protocol (figuur 3). Deze resultaten demonstreren dat deze pADSC vertonen mesenchymale stamcel-type eigenschappen zonder significante endotheliale of hematopoëtische stamcellen verontreiniging, waaronder myeloïde of lymfoïde progenitorcellen.

Om verder te bevestigen dat pADSC vertegenwoordigen mesenchymale stamcellen, de multipotent van pADSC werd onderzocht door differentiatie in adipocyten, osteocyten en chondrocyten. Deze adipocyten, chondrocyten en osteocyten werden gekleurd met specifieke kleurstoffen, Oil Red O, alizarine rood S en Toluidine Blue O, respectievelijk (figuur 4). Deze gegevens geven aan dat dit protocol gegenereerd pADSC dat mu behoudenltipotency met volledige kenmerken lijken op mesenchymale-type voorlopers.

figuur 2
Figuur 2. Morfologie van pADSC van varkens terug vet regio. (A) Subconfluente pADSC aangehouden en uitgebreid na 24-h zaaien op een 6-well cultuur plaat. (B) pADSC werd confluent 72e-h zaaien op een 6-well cultuur plaat. (C) mature adipocyten werden na 9 dagen van adipogene differentiatie van pADSC. Beelden werden genomen op 100 x vergroting met behulp van fase contrast microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Identificatie van stamcellenoppervlaktemerkers voor pADSC. 1 x 10 5 van pADSC werden gereageerd met specifieke antilichamen en geanalyseerd op stamcel markers door flowcytometrie analyse. De getallen geven het percentage gekleurde cellen in de populatie (rood) ten opzichte van de ongekleurde control. De x-as geeft de relatieve fluorescentie-intensiteit. De y-as geeft de populatie van cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Multipotent differentiatie van pADSC. Multipotent van pADSC werd bepaald door differentiëren pADSC in (A) adipocyten, (B) osteocyten (C) en gekleurd door chondrocyten representatieve kleurstoffen, Oil Red O, alizarine rood S en Toluidine Blue O respectievelijk . ImaGES werden genomen bij (A) 100 x (B) x 200, en (C) 100 x vergroting met behulp van fase-contrast microscopie, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Hier presenteren we een betrouwbare cellulaire systeem om de ontwikkeling van vetweefsel in primaire celcultuur van pADSC bestuderen. Vergeleken met andere geïmmortaliseerde cellijnen, deze methode een handige manier om grote hoeveelheden hoogwaardige volwassen mesenchymale stamcellen die kunnen worden toegepast om differentiatie van adipocyten processen of andere mesenchymale lijnen verband met de ontwikkeling dier in vivo te bestuderen isoleren. De kritische stap in deze gemodificeerde protocol die worden verkregen pADSC met een 7- tot 9 dagen oude biggen omdat het gemakkelijk is om de kleine biggen handgreep ten opzichte van oudere varkens en vergelijkbaar met andere soorten 19,20, de opbrengst en multipotent van pADSC afneemt naarmate het varken leeftijden 21.

Potentiële stamcel bronnen zijn embryonale stamcellen (ESC), geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), en postnatale volwassen stamcellen. De beperking van ADSC, geclassificeerd als volwassen multipotente stamcellen, is dat multipotent van volwassen stamcellenin het onderscheiden van uiteenlopende lijnen is relatief beperkt in vergelijking met ESC of iPSC. Echter, ethische kwesties met betrekking tot afleiding van ESC en oncogene eigenschappen van iPSC beperken de toepassing van ESC en iPSC 22,23. Daarom hebben veel onderzoekers gericht op volwassen stamcellen met inspanningen om pluripotentie verbeteren. De meest voorkomende bron van volwassen mesenchymale stamcellen (MSC), die al lange tijd onderzocht, is beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen 24. Echter, het oogsten beenmerg beschouwd als een relatief pijnlijke procedure. Een andere zorg is dat de opbrengst aan stamcellen uit het beenmerg eindig. Beenmergaspiraten verkregen gemiddeld 6 x 10 6 kernhoudende cellen per ml en MSC vertegenwoordigen slechts 0,001-0,01% van alle kernhoudende cellen. Na bestudering van deze nadelen is voorgesteld ADSC als minder opvallend bron multipotente stamcellen 25,26 verkrijgen.

Beperkingen op het gebruik van ADSC in regeneratietieve geneesmiddel afhankelijk, grotendeels over de mobiele opbrengst en kwaliteit. Daarom is de betekenis van het gebruik varkens ADSC isoleren dit protocol is een grote hoeveelheid hoge kwaliteit volwassen stamcellen verkregen. Het varken is een nuttig dier model die de mens als gevolg van de vergelijkbare orgel grootte en de vele fysiologische en biochemische overeenkomsten tussen de soorten 27-30. HADSC verwerven van commerciële bedrijven is duur en in veel gevallen zijn de cellen gemanipuleerd, passage of gecryopreserveerd. Het verwerven van menselijke klinische monsters is relatief moeilijk als gevolg van ethische kwesties en de productie van ADSC is beperkt. We leiden ongeveer 6 x 10 5 hADSC per g vet na collagenase spijsvertering. Met 100 g vrouwelijke borst vetweefsel (gemiddeld bemonstering), kan een totaal van 6 x 10 7 cellen worden geoogst. Met een individuele muis, de opbrengst nog beperkter. Een totaal van 1 x 10 6 cellen kunnen worden geoogst uit 0,4 g subcutane muis inguinal vetweefsel uit beide benen van een volwassene FVB muizen (6-8 weken oud). Echter in een individueel varken (7-9 dagen oud), een totaal van 2 x 10 8 cellen kunnen gemakkelijk worden geoogst uit 60 g onderhuidse vetweefsel verkregen uit het dorsale vet depot. De pADSC afgeleid in dit protocol hebben volledige mesenchymale-type multipotentie en passende mesenchymale stamcellen markers. Daarom pADSC een gunstig bron van grote hoeveelheden volwassen stamcellen te verkrijgen zonder verlies stamcel kwaliteit.

De toepassing van pADSC is niet beperkt tot het ontcijferen adipocytdifferentiatie waaronder adipogenese en lipogenese. Onlangs hebben ADSC een populaire bron van stamcellen in het gebied van regeneratieve geneeskunde 22,31,32 worden. Vergeleken met andere stamcellen bronnen ADSC behouden een unieke voordeel dat gemakkelijk toegankelijk en overvloedig, en hun robuuste multipotent is aangetoond een veelbelovende bron voor celtherapie en weefsels zijn engineering 22,33,34. De goede bereikbaarheid van vetweefsel maakt ADSC één van de minst ingrijpende manieren om multipotente voorlopercellen te krijgen. Onlangs hebben we gedifferentieerd pADSC in glucose reagerende insuline uitscheidende clusters aangeeft dat pADSC niet beperkt tot mesenchymale differentiatie (ongepubliceerde gegevens). Anderen hebben ook aangetoond dat ADSC kan worden onderverdeeld in verschillende celtypen afkomstig uit andere kiemen lagen zoals endodermale hepatocyten (van hADSC 35 of pADSC 36) of ectodermale neuronen (van hADSC 37 of pADSC 38). Aldus zou pADSC worden gebruikt voor high-throughput screening van geneesmiddelen of biomateriaal door het richten cellen uiteenlopende differentiatieprocessen gewenste lineages verkregen. Daarom pADSC afgeleid in dit protocol hebben potentiële toepassing in stamceltherapie en weefseltransplantatie regeneratieve geneeskunde onderzoek.

Acknowledgments

De auteurs willen graag dank uitspreken aan alle lab leden voor de uitgebreide discussie en techniek ondersteunt in dit protocol. Onderzoek uitgevoerd in het lab werd ondersteund door subsidies van het ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST 103-2314-B-002-126 en MOST 102-2313-B-002-026-my3) en door subsidies van Aim for the Top University Plan (104R350144) van de Nationale Universiteit van Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-040
DMEM/F-12, HEPES Life Technologies 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biological Industries 04-001-1  
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution Biological Industries 03-033-1 For antibiotics and antimycotic usage
αMEM, no nucleosides  Life Technologies 12561-049
ACK lysis buffer  Life Technologies A10492-01
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Life Technologies 25200072
CD4a-PE Sigma-Aldrich SAB4700063
CD29-PE Sigma-Aldrich SAB4700398
CD31-PE Sigma-Aldrich SAB4700467
CD44-PE Sigma-Aldrich SAB4700183
CD45-PE Sigma-Aldrich SAB4700483
CD90-PE Sigma-Aldrich SAB4700686
HLA Class I-PE (MHC I)  Sigma-Aldrich SAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II)  Sigma-Aldrich SAB4700662
Insulin  Sigma-Aldrich I9278
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T6397
Transferrin  Sigma-Aldrich T2036
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich I7018
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D4902
Rosiglitazone Cayman 71740
β-Glycerophosphate  Sigma-Aldrich G9422
2-Phospho-L-ascorbic acid  Sigma-Aldrich 49752
TGFB1 Recombinant Human Protein  R&D Systems  240-B-002
Oil Red O  Sigma-Aldrich O0625
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Carbon Steel Blades Thomas Scientific 6727C18
Falcon 100 µm cell strainer Corning  352360
Falcon 6-well plate Corning  353046
Falcon 100 mm  dish Corning  353003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
  2. Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335, (28), 30-32 (2012).
  3. Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
  4. Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
  5. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
  6. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
  7. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. (2013).
  8. Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
  9. Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
  10. Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
  11. Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
  12. Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
  13. Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
  14. Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
  15. Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
  16. Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
  17. Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
  18. Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
  19. Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
  20. Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
  21. Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
  22. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
  23. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
  24. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
  25. Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
  26. Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
  27. Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
  28. Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
  30. Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
  31. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
  32. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
  33. Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
  34. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
  35. Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
  36. Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
  37. Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
  38. Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).
Isolatie en differentiatie van vetcellen afgeleide stamcellen uit Porcine Onderhuids vetweefsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).More

Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter