Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering og differentiering af adipøst afledte stamceller fra Porcine subkutane fedtvæv

doi: 10.3791/53886 Published: March 31, 2016

Introduction

Fedme, til stede i omkring 30% af befolkningen i USA, med et body mass index over 30, har vist sig som en fremherskende verdensomspændende fænomen 1. Fedme tendens til at føre til relaterede komplikationer, herunder hjertekarsygdomme, type 2 diabetes og kræft 2-4. Derfor beskæftiger sig med fedme er en vigtig prioritet. Fedme er manifesteret ved massiv udbygning af fedtvæv, og tilskrives overdreven indtagelse mad og en stillesiddende livsstil i det moderne samfund. Derfor decifrere den transkriptionelle regulering af adipogenese og lipogenese kunne holde lover til behandling af fedme eller diabetes 5.

3T3-L1, 3T3-F442A og andre muse adipogenisk cellelinier er blevet anvendt til at studere adipogenese eller lipogenese under fedtvæv udvikling. Men der er nogle uoverensstemmelser i reguleringsmekanismer mellem cellelinjer in vitro og dyr in vivo 6. Primær adipøst-Deriaba stamceller (ADSC) i det stromale-kar cellefraktion kan isoleres direkte fra hvide fedtvæv og induceret til at differentiere. Differentiering af ADSC til adipocyter sandsynligvis rekapitulerer processen med adipogenese og lipogenese i fedtvæv udvikling in vivo 7.

Grise er en egnet dyremodel til undersøgelse af adipogenese og lipogenese i fedtvæv udvikling. Vores tidligere porcine studier 8-10 viser, at ekspression af sterol regulatorisk element-bindende transkriptionsfaktor 1c (SREBP1c), en vigtig transkriptionsfaktor vides at modulere transkription af lipogenisk fedtsyresyntase, inhiberes af polyumættede fedtsyrer (PUFA) i svinelever og fedtvæv. Ekspressionen af porcin SREBP1c faldt med PUFA in vivo og in vitro ligner andre arter, såsom mennesker og mus 11-13. Disse svin studier in vitro er primært i differentiated adipocyter afledt fra porcint ADSC (pADSC). Derfor kan dette primær cellekultur af pADSC anvendes til at tjene som et pålideligt cellulært system til at studere fedtvæv udvikling eller andre stamcelle applikationer.

Protocol

Bemærk: Der er etableret Denne metode, og anvendes i forskning tidligere rapporteret 14-17 fra dette laboratorium; over tid metoden blev ændret. Den nuværende fremgangsmåde blev udført under anvendelse af et gennemsnit på 60 g porcine subkutane fedtvæv fra en gris (7 til 9 dage gamle) med podning på 6-brønds vævskulturplader. Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet. Alle forsøgene dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved National Taiwan University.

1. Forbered Fordøjelse Medium

  1. Opnå subkutane fedtvæv fra nakke og ryg; 40 til 80 g pr gris (7 til 9 dage gamle), afhængigt af størrelsen af ​​grisene. Her bruge 60 g subkutane fedtvæv opnået fra en gris.
  2. Forbered fordøjelsen medium: Afvej collagenase II pulver med i alt 54.000 enheder og opløse den i 90 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM,til 60 g fedt) i en 100 ml serologisk flaske (900 enheder af collagenase / 1,5 ml DMEM / g fedt).
  3. omrystes forsigtigt, fordøjelsen medium på et rystebord (100 rpm) i mindst 15 minutter for at opløse og derefter passere fordøjelsen medium gennem et 0,22 um filter til sterilisering. Opbevar ved 4 ° C før brug.

2. Dissekere Subkutan fedtvæv fra svin

  1. Sterilisere alle instrumenter, glas og plast ware og varm alle medier til 37 ° C før brug.
  2. Sacrifice pattegris med elektrisk bedøvelse og forblødning eller ved hjælp af en metode i overensstemmelse med de lokale IACUC regler. Udfør dissektion omhyggeligt og umiddelbart efter smågrise aflives.
  3. Læg pattegris på en ren kirurgisk bord (tilbage opad og mave ned). Barbere håret fra grisen tilbage fjerne alle hår fra nakken til halen og på begge sider ned med midterlinjen.
  4. Skrub grisens dorsale hud med 7,5% povidone-jod tre gange (med tre nye uafhængige-scrubs) og derefter lade jod til at sidde på overfladen af ​​huden i ca. 10 min.
  5. Fjern povidon-iod med flere sprays af 70% ethanol. Brug gaze puder eller væv papirer indeholdende 70% ethanol til at tørre huden i én retning, gentaget, indtil der observeres ingen indlysende farve povidon-iod.
  6. Brug en skalpel til at adskille det porcine dorsale fedt lag af subkutane fedtvæv sammen med vedhæftede hudlag fra musklerne, mens forhaler fedt og hud ved hjælp af pincet.
  7. Umiddelbart fordybe fedtet lag af subkutane fedtvæv med vedhæftede hud i en steriliseret bægerglas (200 ml) indeholdende serumfrit DMEM.
  8. Spray ydersiden af ​​bægeret indeholdende fedtlaget med 70% ethanol og anbringes i en laminar strømning cellekultur hætte. Placer en stor (40 cm x 30 cm) steriliseret triple-lags cover folie i hætten. [En tredobbelt lag bruges til at sikre kontinuerlig integritet.]
  9. Placervæv med huden vendende ned på dækfolien.
  10. Trimme det resterende muskelvæv off af fedtvæv ved hjælp af pincet og saks til at undgå kontaminering med muskelvæv.
  11. Skær fedt til firkantede stykker (~ 7 cm x 7 cm) med en skalpel eller saks. Sæt disse stykker af fedtlaget i en ny steriliseret bægerglas (200 ml) indeholdende serumfrit DMEM.
  12. Indstil en tilpasset skive holder på dækfolien samlet med en kulstofstål pålægsmaskine klinge (figur 1). Tag et stykke fedt ud af bægerglasset og placer den på opskæringsmaskinen (hudlag oven og fedtlaget nedenfor).
  13. Skær fedtet lag af subkutane fedtvæv i ca. 1 mm tykke stykker. Skær fedtlaget fra huden så tæt som muligt, men undgå at skære huden.
  14. Mince skiver fedtvæv med en saks som fine som muligt.
  15. Tilføj filtreret fordøjelse medium indeholdende collagenase til en 250 ml Erlenmeyer-kolbe eller en serologisk flaske med hakketfedtvæv (54.000 enheder af collagenase / 90 ml DMEM / 60 g fedt).
  16. Inkuber og hvirvel Erlenmeyer kolbe ved 45 rpm i en orbitalryster i 90 min ved 37 ° C for at tillade collagenasen at fordøje væv.
    Bemærk: Kontroller hver 15 til 30 minutter for at undgå over-fordøjelse. Fordøjelsesprocessen udfyldes, hvis fordøjelsen mediet er en slam uden væsentlige væv klumper.
  17. Tilsættes samme mængde (svarende til fordøjelsen medium) i dyrkningsmedium indeholdende DMEM / F12 med 10% føtalt bovint serum (FBS) for at stoppe collagenasefordøjelse.

figur 1
Figur 1. En skræddersyet slicer anvendes til isolering af pADSC. Dissekerede fedtvæv fra porcin dorsale subkutane fedtvæv er sammensat af fedtlaget med vedhæftede hudlag. En slicer er påkrævet for at skære fedtlaget ca. 1 mm tyk med undgåelse af over-udskæring i hudlagene. Fra venstre til højre: slice holder, pålægsmaskine pad, kulstofstål slicer klinge, og skruer. Indsættes Slicer klinge mellem skive holder og pålægsmaskine pad når de er samlet. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Indsamling af pADSC fra Stromal-kar fraktion

  1. Passere fordøjelsen medium indeholdende de fordøjede fedtvæv gennem et enkelt lag af chiffon i en ren steriliseret 250 ml Erlenmeyer-kolbe eller en 250 ml serologisk flaske. Brug en pincet til at nedtrykke midten af ​​chiffon at vejlede og hjælpe passage af fordøjelsen.
  2. Hæld vandet fra og sno chiffon med en pincet til at fuldføre passage.
  3. Fordel fordøjelsen medium i fire 50 ml koniske centrifugerør (~ 40 ml medium pr rør).
  4. Centrifuger ved 700 xg i 10 min for at indsamle pellet af stromale-kar celler.
  5. Centrifuger ved 700 xg i 6 min. Dekanteres.
  6. Tilsæt 10 ml ACK-lysepuffer og derefter pellet resuspenderes ved pipettering. Lad det stå i 7 minutter (5 til 10 min) ved stuetemperatur for at lysere røde blodlegemer i det stromale-kar fraktion.
  7. Tilføj lige store mængder af DMEM (10 ml) for at standse reaktionen med forsigtig omrystning af røret centrifugeres ved 700 xg i 10 min.
  8. Dekanteres, tilsættes 10 ml DMEM i hvert rør, pellet resuspenderes med gentagen pipettering, og centrifuger ved 700 xg i 6 min. Gentag to gange.
  9. Indsamle og passere DMEM (i alt 40 ml DMEM fra 4 rør, der repræsenterer 60 g fedt) med suspenderede celler gennem en 100 um si i en ny 50 ml konisk rør.
  10. Forsigtigt pipette medium flere gange at opblande og aliquot 20 pi celleholdige medium blandet med 180 pi 0,4% trypanblåt-opløsning (1:10 fortynding) i en ny 1,5 ml Eppendorf-rør.
  11. Tæl cellerne med et hæmocytometer og derefter frø pADSC ved en densitet på 60.000 celler / cm2 på en ønsket størrelse af dyrkningsskålen eller plade med dyrkningsmedium indeholdende DMEM / F12, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika penicillin -streptomycin-amphotericin B-opløsning (P / S / A). Generelt frø den pADSC på 6-brønds vævsdyrkningsplader til adipocyt eller osteocyt differentiering. Frø af pADSC den 10-cm retter til overfladen markør farvning af stamceller eller chondrocyt differentiering.
  12. Inkubér plader eller retter i 37 ° C inkubator i luft med 5% CO2 for at tillade cellebinding til pladerne.

4. Identifikation Stem-celleoverflademarkører af pADSC ved flowcytometri

  1. Efter 24 timer, fjerne mediet helt, vaske the 10-cm skål to gange med phosphatbufret saltvand (PBS), og høst celler med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA i 5 minutter ved 37 ° C.
  2. Neutraliser trypsin-EDTA med lige store mængder af dyrkningsmedium (1 ml), indsamle celler i en ny 15-ml konisk rør, og derefter centrifugeres ved 400 x g i 7 min.
  3. Dekanteres. Vask pelleten to gange i 3 ml iskold FCS-vaskebuffer (PBS indeholdende 10% FBS) ved anvendelse resuspension ved pipettering kombineret med centrifugering ved 400 x g i 7 min.
  4. Resuspender, tælle, og juster pADSC til 10 6 celler / ml i iskold FCS-vaskebuffer. Place celler (100 pl / hvert rør) i flere nye 15 ml koniske rør og inkuberes rør indeholdende pADSC ved 4 ° C i 30 minutter med antistoffer mod enten phycoerythrin-konjugeret CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC i-PE eller MHC II-PE til direkte farvning. Reaktionen standses ved vask af cellerne to gange i 10 ml FCS-vaskebuffer kombineret med 400 x g centrifugation i 7 min.
  5. Fix og resuspender cellerne i fiksering buffer (PBS med 0,01% FBS og 1% formaldehyd) til flowcytometri ifølge producentens instruktioner og vores tidligere publikation 18.

5. Differentiering af pADSC til adipocyter, osteocytter og Chondrocytter

  1. Differentiering af pADSC i adipocytter
    1. Forbered adipocyt induktionsmedium og adipocyt vedligeholdelsesmedium
      1. For adipocyt induktion medium, forberede 1 L serumfrit DMEM / F12 (med antibiotika på 1% P / S / A) indeholdende følgende: 1 ml insulin-stamopløsning (10 mg / ml HEPES-buffer, pH 8), slutkoncentration = 10 ug / ml; 1 pi T3 lager (3,3 ', 5-triiod-L-thyronin, 1 mM i DMSO), slutkoncentration = 1 nM; 200 pi transferrin stamopløsning (50 mg / ml dobbelt destilleret H2O), slutkoncentration = 10 ug / ml; 100 pi dexamethason lager (10 mM i ethanol), endelig konc = 1 uM; 100 pi rosiglitazon lager (10 mM i DMSO), slutkoncentration= 1 uM.
      2. Forbered adipocyt vedligeholdelsesmedium med de samme tilsætninger som induktion medium, men med udeladelse af dexamethason.
    2. Differentiering fremgangsmåde til adipocytter
      Bemærk: Efter såning pADSC den 6. brønde, vil pADSC blive sammenflydende inden 72 timer.
      1. Efter 3 dage fjernes mediet fuldstændigt og derefter tilsættes 3 ml adipocyt induktion medium i hver brønd. Retur pladerne til inkubatoren. Dette er dag nul differentiering.
      2. Efter 3 dage, fjerne fedtcellerne induktion medium helt og erstatte med 3 ml adipocyt vedligeholdelse medium hver tredje dag. Modne adipocytter bliver terminalt differentieret ved omkring 9 dage. Over 90% af fedtceller er godt differentieret ved hjælp af denne protokol. Disse adipocytter er klar til Oil Red O-farvning.
  2. Differentiering af pADSC i osteocytter
    1. Forbered osteocyt induktion medium: komplet kultur medium (DMEM / F12 med 10% FBS og 1% P / S / A) indeholdende 1 uM dexamethason, 10 mM β-glycerophosphat og 50 ug / ml ascorbat-2-phosphat.
    2. Differentiering fremgangsmåde til osteocytter
      Bemærk: Efter såning pADSC den 6. brønde, vil pADSC blive sammenflydende inden 72 timer.
      1. Efter 3 dage fjernes mediet fuldstændigt, og der tilsættes 3 ml osteocyt induktion medium i hver brønd. Retur pladerne til 37 ° C inkubator. Dette er dag nul differentiering.
      2. Udskift med osteocyt induktion medium hver tredje dag. Modne osteocytter vil danne med 14 dages differentiering. Disse osteocytter er klar til alizarinrødt S-farvning.
  3. Differentiering af pADSC til chondrocytter
    1. Forbered chondrocyt induktion medium: aMEM indeholdende 1% FBS, 6,25 ug / ml insulin, 50 pg / ml ascorbat-2-phosphat og 10 ng / ml transformerende vækstfaktor-β1.
    2. Differentiering fremgangsmåde til chondrocytter Efter podning pADSC på 10 cm dyrkningsskåle i 24 timer, fjern dyrkningsmedium fuldstændigt og vaske retter to gange med PBS.
    3. Trypsinisér pADSC med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA i 5 minutter, og derefter neutraliseres med 1 ml dyrkningsmedium. Collect tælle og justere pADSC i 15 ml koniske rør med en densitet på 2,5 x 10 5 celler pr rør. Brug et hæmocytometer at tælle cellerne.
    4. Efter centrifugering ved 400 x g i 7 min, supernatanten fjernes uden at forstyrre bundfaldet, og der tilsættes 1 ml chondrocytter induktion medium i et 15 ml rør. Røret returneres til 37 ° C inkubator. Dette er dag nul differentiering.
    5. Erstat chondrocyt induktion medium hver tredje dag uden at fjerne celler på bunden. Modne chondrocytter vil danne i cirka 14 dage. Disse chondrocytter er klar til toluidinblåt O-farvning.

6. Farvning af differentieret Adipocyter, Osteocytes og Chondrocytter

  1. Oil Red O farvning for differentierede adipocytter
    1. På dag 9, fjerne adipocyt vedligeholdelsesmedium i 6-brønds dyrkningsplader med differentierede adipocytter og derefter vaske pladen to gange med PBS. [I de følgende trin, tilføje nok udpegede reagenser til at dække hver brønd på 6-brønds plade.]
    2. Fix adipocyter med 10% formalin opløsning i mindst 10 min.
    3. Fjern 10% formalinopløsning og vask pladen to gange med dobbeltdestilleret vand.
    4. Efter to vaske, tilsættes 100% propylenglycol til dyrkningspladen og lad stå i 1 min.
    5. Fjern 100% propylenglycol og derefter tilføje Oil Red O-opløsning (0,5% i propylenglycol) til kulturen plade. Lad det stå i mindst 10 minutter på en rocker rysteapparat med forsigtig omrøring (100 rpm).
    6. Fjern Oil Red O-opløsning og derefter erstatte med 60% propylenglycol. Lad det stå i 1 min.
    7. Fjern 60% propylenglycol og derefter vaske pladen to gange med double-destilleret vand.
    8. Udskift med 10% formalin løsning. De farvede lipiddråber inde i adipocytter er klar til observation ved lysmikroskopi.
    9. Kvantificering af intracellulær Oil Red O (valgfrit trin nedenfor): efter mikroskopisk observation, fjerne 10% formalinopløsning og vask pladen to gange med dobbeltdestilleret vand.
    10. Drain pladen helt og tilsæt 500 pi isopropanol til 6-brønds plade.
    11. Lad isopropanol stå i 6-brønds plade på en blid rocker rysteapparat (100 rpm) i mindst 10 min for at opløse farvestoffet i Oil Red O.
    12. Aspirer isopropanol indeholdende Oil Red O og distribuere på en plade med 96 brønde. Kvantificere det ekstraherede Oil Red O under anvendelse af en spektrofotometrisk aflæsning ved 510 nm.
  2. Alizarinrødt S farvning for differentieret osteocyter
    1. På dag 14, fjernes osteocyt induktion medium fra 6-brønds plader med differentierede osteocytter og vaske pladerne to gange med PBS. [I following trin, tilsættes nok udpegede reagenser til at dække hver brønd i 6-brønds plade.]
    2. Fix osteocytter i 10% formalinopløsning i mindst 10 min.
    3. Fjern 10% formalinopløsning fra hver brønd og vask pladen to gange med dobbeltdestilleret vand.
    4. Efter to vaske, tilsættes 2% alizarinrødt S opløsning (pH = 4,1-4,3) til 6-brønds plade og lad stå i mindst 15 minutter på en blid rocker rysteapparat (100 rpm).
    5. Fjern alizarinrødt S-opløsning og derefter vaske pladen to gange med dobbeltdestilleret vand.
    6. Udskift med 10% formalin løsning. Osteocyter er klar til observation ved lysmikroskopi.
  3. Toluidine Blå O farvning for differentierede chondrocytter
    1. På dag 14 aspireres chondrocytter induktion medium fra 15 ml konisk rør uden fjernelse sedimenter af differentierede chondrocytter i bunden af ​​røret og vask røret to gange med PBS. [I de følgende trin, tilføje nok udpegede reagenser til coveR chondrocytter i bunden af ​​røret eller på snitpræparat.]
    2. Fix chondrocytter i 10% formalinopløsning i mindst 10 min.
    3. Fjern 10% formalinopløsning fra hvert rør og vask røret to gange med dobbeltdestilleret vand.
    4. Efter to vaske, integrere pellets i OCT Compound og sektion med en kryostat i en tykkelse på 5 um.
    5. Farv objektglasset af cryostatsnit med toluidinblåt O-opløsning (0,1% med pH 4,1).
    6. Fjern toluidinblåt O-opløsning og derefter vaske afsnittet to gange med dobbeltdestilleret vand.
      Bemærk: Chondrocytter på dias er klar til observation ved lysmikroskopi.

Representative Results

Den pADSC afledt fra svin dorsale subkutant fedt blev podet på dyrkningsplader eller fade og vist i figur 2. Morfologien af pADSC afledt af det stromale-kar fraktion ligner mus eller mennesker ADSC. Fireogtyve timer efter podning, er subkonfluent pADSC klæbet og har en udvidet fibroblastlignende morfologi (figur 2A). Den pADSC bliver sammenflydende inden for 72 timer og er klar til adipocyt eller anden mesenchymal-typen differentiering (figur 2B). pADSC udviser stærk adipogenisk potentiale efter kan observeres kemisk induktion og modne adipocytter efter 9 dages differentiering med over 90% af de pADSCs viser adipogenisk differentiering (figur 2C).

For at løse de særlige kendetegn ved pADSC stammer i denne protokol, blev overflademarkører af pADSC evalueret af flowcytometri analysis. Som vist i figur 3, overflademarkører for mesenchymstamceller, herunder CD29, CD44, CD90 og MHC I (eller HLA I), blev stærkt udtrykt. Negative overflademarkører, såsom CD4a, CD31, CD45 og MHC II (eller HLA II) var knap påviselige i pADSC afledt i protokollen (figur 3). Disse resultater viser, at disse pADSC udviser mesenchymal-type stamcelle egenskaber uden væsentlig endotel- eller hæmatopoietisk kontaminering stamcelle, herunder myeloide eller lymfoide progenitorer.

For yderligere at bekræfte, at pADSC repræsenterer mesenkymale stamceller blev multipotency af pADSC undersøgt af differentiering i adipocytter, osteocytter og chondrocytter. Disse adipocytter, osteocytter og chondrocytter blev farvet med specifikke farvestoffer, Oil Red O, Alizarin Red S, og toluidinblåt O, (figur 4). Disse data indikerer, at denne protokol genereret pADSC der beholdt multipotency med fuld karakteristika ligner mesenchymale-type stamceller.

Figur 2
Figur 2. morfologi pADSC fra porcin tilbage fedt region. (A) Subkonfluente pADSC klæbet og udvides efter 24-h podning på en 6-brønds dyrkningsplade. (B) pADSC blev sammenflydende efter 72-h podning på en 6-brønds dyrkningsplade. (C) Ældre adipocytter blev observeret efter 9 dages adipogenisk differentiering fra pADSC. Billeder blev taget ved 100 x forstørrelse med anvendelse fasekontrast mikroskopi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Identifikation af stamcelleroverflademarkører for pADSC. 1 x 10 5 i pADSC blev omsat med specifikke antistoffer og analyseret for stamcellemarkører ved flowcytometri analyse. Tal angiver procentdelen af ​​farvede celler i populationen (rød) sammenlignet med den ufarvede kontrol. X-aksen repræsenterer den relative fluorescens intensitet. Y-aksen repræsenterer populationen af celler. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. multipotente differentiering af pADSC. Multipotency af pADSC blev bestemt ved at differentiere pADSC i (A) adipocytter, (B) osteocytter (C) chondrocytter og farves af repræsentative farvestoffer, Oil Red O, Alizarin Red S, og toluidinblåt O, henholdsvis . ImaGES blev taget ved (A) 100 x (B) 200 x, og (C) 100 x forstørrelse med anvendelse fasekontrast mikroskopi, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her præsenterer vi et pålideligt cellulært system til at studere fedtvæv udvikling i primær cellekultur af pADSC. Sammenlignet med andre udødeliggjorte cellelinier, tilvejebringer denne fremgangsmåde en bekvem måde at isolere store mængder af høj kvalitet voksen mesenchymstamceller, der kan anvendes til at studere differentieringsprocesser af adipocyter eller andre mesenkyme slægter i forbindelse med dyrs udvikling in vivo. Den kritiske modificerede skridt i denne protokol er, at vi udlede pADSC anvendelse af en 7- til 9-dages gamle gris, fordi det er let at håndtere den lille gris i forhold til ældre grise og lignende til andre arter 19,20, udbyttet og multipotency af pADSC falder som svine- aldre 21.

Potentielle stamceller cellekilder omfatter embryonale stamceller (ESC), inducerede pluripotente stamceller (IPSC) og postnatal voksne stamceller. Den begrænsning af ADSC, der er klassificeret som voksne multipotente stamceller, er, at multipotency af voksne stamcelleri differentiere divergerende slægter er relativt begrænset sammenlignet med ESC eller iPSC. Men etiske aspekter i forbindelse afledning af ESC og onkogene egenskaber iPSC begrænse anvendelsen af ESC og iPSC 22,23. Derfor har mange forskere fokuseret på voksne stamceller med bestræbelserne på at forbedre pluripotens. Den mest almindelige kilde til voksne mesenchymstamceller (MSC), som længe har været undersøgt, er knoglemarv-afledte mesenchymal-stamceller 24. Imidlertid er høst knoglemarv betragtet som et relativt smertefuld procedure. En anden bekymring er, at udbyttet af stamceller fra knoglemarven er begrænset. Knoglemarvsaspirater opnåelse gennemsnitligt 6 × 10 6 kerneholdige celler per ml, og MSC kun udgør 0,001 til 0,01% af alle celler med kerne. Efter at disse ulemper er ADSC foreslået som en mindre skæmmende kilde til at opnå multipotente stamceller 25,26.

Begrænsninger i brugen af ​​ADSC i regenerativ medicin afhænger i vid udstrækning af celle udbytte og kvalitet. Derfor er betydningen af ​​anvendelse af svin for at isolere ADSC i denne protokol er at give en stor mængde af høj kvalitet voksne stamceller. Grisen er en nyttig dyremodel, der repræsenterer mennesker på grund af den sammenlignelige orgel størrelse og mange fysiologiske og biokemiske ligheder mellem arterne 27-30. Erhvervelse hADSC fra kommercielle virksomheder er dyrt og i mange tilfælde cellerne er blevet manipuleret, passerede eller kryokonserveret. Erhvervelse humane kliniske prøver er relativt vanskelig på grund af etiske spørgsmål og produktion af ADSC er begrænset. Vi udleder ca. 6 x 10 5 hADSC pr g fedt efter kollagenasefordøjelse. Med 100 g kvindelige bryst fedtvæv (et gennemsnit prøveudtagning), kan høstes i alt 6 x 10 7 celler. Ved anvendelse af en individuel mus er udbyttet endnu mere begrænset. I alt 1 x 10 6 celler kan høstes fra 0,4 g subkutane mus inguinal fedtvæv fra begge ben af ​​en voksen FVB mus (6-8 uger gamle). Men i én enkelt svin (7 til 9 dage gamle), i alt 2 x 10 8 celler kan let høstes fra 60 g subkutane fedtvæv opnået fra den dorsale fedt depot. Den pADSC afledt i denne protokol har fuld mesenchymale-typen multipotency og passende mesenkymale stamceller markører. Derfor pADSC er en positiv kilde at opnå store mængder af voksne stamceller uden at kompromittere stamcelle kvalitet.

Anvendelsen af ​​pADSC er ikke begrænset til at dechifrere adipocytdifferentiering herunder adipogenese og lipogenese. For nylig har ADSC blevet en populær kilde til stamceller inden for regenerativ medicin 22,31,32. Sammenlignet med andre stamceller cellekilder, ADSC bevarer en unik fordel at være let tilgængelig og rigelig, og deres robuste multipotency har vist sig at være en lovende kilde til stamceller terapi og væv engineering 22,33,34. Den nemme adgang til fedtvæv gør ADSC en af ​​de mindst indgribende måder at få multipotente stamfædre. For nylig har vi opdelte pADSC til glucose-responsive insulin-udskillende klynger, hvilket indikerer, at pADSC ikke er begrænset til mesenchymale differentiering (upublicerede data). Andre har også påvist, at ADSC kan opdeles i mange celletyper afledt fra andre kim lag såsom endodermale hepatocytter (fra hADSC 35 eller pADSC 36) eller ektodermale neuroner (fra hADSC 37 eller pADSC 38). Således kunne pADSC bruges til high-throughput lægemiddel eller biomateriale screening ved at dirigere celler til divergerende differentieringsprocesser at give de ønskede slægter. Derfor pADSC stammer i denne protokol har potentiel anvendelse i stamcelleterapi og vævstransplantation for regenerativ medicin forskning.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne udtrykke taknemmelighed over for alle de lab medlemmer for den omfattende diskussion og teknik støtter denne protokol. Forskning udført i laboratoriet blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MEST 103-2314-B-002-126 og MEST 102-2313-B-002-026-MY3) og ved tilskud fra Aim for Top University Plan (104R350144) på ​​National University, Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-040
DMEM/F-12, HEPES Life Technologies 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biological Industries 04-001-1  
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution Biological Industries 03-033-1 For antibiotics and antimycotic usage
αMEM, no nucleosides  Life Technologies 12561-049
ACK lysis buffer  Life Technologies A10492-01
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Life Technologies 25200072
CD4a-PE Sigma-Aldrich SAB4700063
CD29-PE Sigma-Aldrich SAB4700398
CD31-PE Sigma-Aldrich SAB4700467
CD44-PE Sigma-Aldrich SAB4700183
CD45-PE Sigma-Aldrich SAB4700483
CD90-PE Sigma-Aldrich SAB4700686
HLA Class I-PE (MHC I)  Sigma-Aldrich SAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II)  Sigma-Aldrich SAB4700662
Insulin  Sigma-Aldrich I9278
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T6397
Transferrin  Sigma-Aldrich T2036
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich I7018
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D4902
Rosiglitazone Cayman 71740
β-Glycerophosphate  Sigma-Aldrich G9422
2-Phospho-L-ascorbic acid  Sigma-Aldrich 49752
TGFB1 Recombinant Human Protein  R&D Systems  240-B-002
Oil Red O  Sigma-Aldrich O0625
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Carbon Steel Blades Thomas Scientific 6727C18
Falcon 100 µm cell strainer Corning  352360
Falcon 6-well plate Corning  353046
Falcon 100 mm  dish Corning  353003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
  2. Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335, (28), 30-32 (2012).
  3. Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
  4. Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
  5. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
  6. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
  7. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. (2013).
  8. Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
  9. Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
  10. Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
  11. Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
  12. Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
  13. Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
  14. Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
  15. Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
  16. Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
  17. Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
  18. Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
  19. Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
  20. Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
  21. Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
  22. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
  23. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
  24. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
  25. Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
  26. Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
  27. Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
  28. Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
  30. Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
  31. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
  32. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
  33. Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
  34. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
  35. Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
  36. Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
  37. Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
  38. Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).
Isolering og differentiering af adipøst afledte stamceller fra Porcine subkutane fedtvæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).More

Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter