This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.
Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.
Fedme, til stede i omkring 30% af befolkningen i USA, med et body mass index over 30, har vist sig som en fremherskende verdensomspændende fænomen 1. Fedme tendens til at føre til relaterede komplikationer, herunder hjertekarsygdomme, type 2 diabetes og kræft 2-4. Derfor beskæftiger sig med fedme er en vigtig prioritet. Fedme er manifesteret ved massiv udbygning af fedtvæv, og tilskrives overdreven indtagelse mad og en stillesiddende livsstil i det moderne samfund. Derfor decifrere den transkriptionelle regulering af adipogenese og lipogenese kunne holde lover til behandling af fedme eller diabetes 5.
3T3-L1, 3T3-F442A og andre muse adipogenisk cellelinier er blevet anvendt til at studere adipogenese eller lipogenese under fedtvæv udvikling. Men der er nogle uoverensstemmelser i reguleringsmekanismer mellem cellelinjer in vitro og dyr in vivo 6. Primær adipøst-Deriaba stamceller (ADSC) i det stromale-kar cellefraktion kan isoleres direkte fra hvide fedtvæv og induceret til at differentiere. Differentiering af ADSC til adipocyter sandsynligvis rekapitulerer processen med adipogenese og lipogenese i fedtvæv udvikling in vivo 7.
Grise er en egnet dyremodel til undersøgelse af adipogenese og lipogenese i fedtvæv udvikling. Vores tidligere porcine studier 8-10 viser, at ekspression af sterol regulatorisk element-bindende transkriptionsfaktor 1c (SREBP1c), en vigtig transkriptionsfaktor vides at modulere transkription af lipogenisk fedtsyresyntase, inhiberes af polyumættede fedtsyrer (PUFA) i svinelever og fedtvæv. Ekspressionen af porcin SREBP1c faldt med PUFA in vivo og in vitro ligner andre arter, såsom mennesker og mus 11-13. Disse svin studier in vitro er primært i differentiated adipocyter afledt fra porcint ADSC (pADSC). Derfor kan dette primær cellekultur af pADSC anvendes til at tjene som et pålideligt cellulært system til at studere fedtvæv udvikling eller andre stamcelle applikationer.
Her præsenterer vi et pålideligt cellulært system til at studere fedtvæv udvikling i primær cellekultur af pADSC. Sammenlignet med andre udødeliggjorte cellelinier, tilvejebringer denne fremgangsmåde en bekvem måde at isolere store mængder af høj kvalitet voksen mesenchymstamceller, der kan anvendes til at studere differentieringsprocesser af adipocyter eller andre mesenkyme slægter i forbindelse med dyrs udvikling in vivo. Den kritiske modificerede skridt i denne protokol er, at vi udlede pADSC anvendelse af en 7- til 9-dages gamle gris, fordi det er let at håndtere den lille gris i forhold til ældre grise og lignende til andre arter 19,20, udbyttet og multipotency af pADSC falder som svine- aldre 21.
Potentielle stamceller cellekilder omfatter embryonale stamceller (ESC), inducerede pluripotente stamceller (IPSC) og postnatal voksne stamceller. Den begrænsning af ADSC, der er klassificeret som voksne multipotente stamceller, er, at multipotency af voksne stamcelleri differentiere divergerende slægter er relativt begrænset sammenlignet med ESC eller iPSC. Men etiske aspekter i forbindelse afledning af ESC og onkogene egenskaber iPSC begrænse anvendelsen af ESC og iPSC 22,23. Derfor har mange forskere fokuseret på voksne stamceller med bestræbelserne på at forbedre pluripotens. Den mest almindelige kilde til voksne mesenchymstamceller (MSC), som længe har været undersøgt, er knoglemarv-afledte mesenchymal-stamceller 24. Imidlertid er høst knoglemarv betragtet som et relativt smertefuld procedure. En anden bekymring er, at udbyttet af stamceller fra knoglemarven er begrænset. Knoglemarvsaspirater opnåelse gennemsnitligt 6 × 10 6 kerneholdige celler per ml, og MSC kun udgør 0,001 til 0,01% af alle celler med kerne. Efter at disse ulemper er ADSC foreslået som en mindre skæmmende kilde til at opnå multipotente stamceller 25,26.
Begrænsninger i brugen af ADSC i regenerativ medicin afhænger i vid udstrækning af celle udbytte og kvalitet. Derfor er betydningen af anvendelse af svin for at isolere ADSC i denne protokol er at give en stor mængde af høj kvalitet voksne stamceller. Grisen er en nyttig dyremodel, der repræsenterer mennesker på grund af den sammenlignelige orgel størrelse og mange fysiologiske og biokemiske ligheder mellem arterne 27-30. Erhvervelse hADSC fra kommercielle virksomheder er dyrt og i mange tilfælde cellerne er blevet manipuleret, passerede eller kryokonserveret. Erhvervelse humane kliniske prøver er relativt vanskelig på grund af etiske spørgsmål og produktion af ADSC er begrænset. Vi udleder ca. 6 x 10 5 hADSC pr g fedt efter kollagenasefordøjelse. Med 100 g kvindelige bryst fedtvæv (et gennemsnit prøveudtagning), kan høstes i alt 6 x 10 7 celler. Ved anvendelse af en individuel mus er udbyttet endnu mere begrænset. I alt 1 x 10 6 celler kan høstes fra 0,4 g subkutane mus inguinal fedtvæv fra begge ben af en voksen FVB mus (6-8 uger gamle). Men i én enkelt svin (7 til 9 dage gamle), i alt 2 x 10 8 celler kan let høstes fra 60 g subkutane fedtvæv opnået fra den dorsale fedt depot. Den pADSC afledt i denne protokol har fuld mesenchymale-typen multipotency og passende mesenkymale stamceller markører. Derfor pADSC er en positiv kilde at opnå store mængder af voksne stamceller uden at kompromittere stamcelle kvalitet.
Anvendelsen af pADSC er ikke begrænset til at dechifrere adipocytdifferentiering herunder adipogenese og lipogenese. For nylig har ADSC blevet en populær kilde til stamceller inden for regenerativ medicin 22,31,32. Sammenlignet med andre stamceller cellekilder, ADSC bevarer en unik fordel at være let tilgængelig og rigelig, og deres robuste multipotency har vist sig at være en lovende kilde til stamceller terapi og væv engineering 22,33,34. Den nemme adgang til fedtvæv gør ADSC en af de mindst indgribende måder at få multipotente stamfædre. For nylig har vi opdelte pADSC til glucose-responsive insulin-udskillende klynger, hvilket indikerer, at pADSC ikke er begrænset til mesenchymale differentiering (upublicerede data). Andre har også påvist, at ADSC kan opdeles i mange celletyper afledt fra andre kim lag såsom endodermale hepatocytter (fra hADSC 35 eller pADSC 36) eller ektodermale neuroner (fra hADSC 37 eller pADSC 38). Således kunne pADSC bruges til high-throughput lægemiddel eller biomateriale screening ved at dirigere celler til divergerende differentieringsprocesser at give de ønskede slægter. Derfor pADSC stammer i denne protokol har potentiel anvendelse i stamcelleterapi og vævstransplantation for regenerativ medicin forskning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne udtrykke taknemmelighed over for alle de lab medlemmer for den omfattende diskussion og teknik støtter denne protokol. Forskning udført i laboratoriet blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MEST 103-2314-B-002-126 og MEST 102-2313-B-002-026-MY3) og ved tilskud fra Aim for Top University Plan (104R350144) på National University, Taiwan.
Reagents | |||
Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-001-1 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution | Biological Industries | 03-033-1 | For antibiotics and antimycotic usage |
αMEM, no nucleosides | Life Technologies | 12561-049 | |
ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Life Technologies | 25200072 | |
CD4a-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700063 | |
CD29-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700398 | |
CD31-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700467 | |
CD44-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700183 | |
CD45-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700483 | |
CD90-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700686 | |
HLA Class I-PE (MHC I) | Sigma-Aldrich | SAB4700640 | |
HLA-DR-PE (MHC II) | Sigma-Aldrich | SAB4700662 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | |
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Rosiglitazone | Cayman | 71740 | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
2-Phospho-L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 49752 | |
TGFB1 Recombinant Human Protein | R&D Systems | 240-B-002 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Carbon Steel Blades | Thomas Scientific | 6727C18 | |
Falcon 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
Falcon 6-well plate | Corning | 353046 | |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 |