This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.
Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.
Fedme, til stede i ca 30% av befolkningen i USA, med en kroppsmasseindeks over 30, har dukket opp som en utbredt verdensomspennende fenomen en. Fedme har en tendens til å føre til relaterte komplikasjoner inkludert hjerte- og karsykdommer, type-2 diabetes og kreft 2-4. Derfor arbeider med fedme er en viktig prioritet. Fedme er manifestert av massiv utvidelse av fettvev, og skyldes overdreven matinntak og en stillesittende livsstil i det moderne samfunn. Derfor tyde transcriptional regulering av adipogenesen og lipogenese kunne holde lover å behandle fedme eller diabetes fem.
Den 3T3-L1, 3T3-F442A og andre muse adipogenic cellelinjer har blitt brukt til å studere adipogenesen eller lipogenese i løpet av fettvev utvikling. Det er imidlertid noen avvik i reguleringsmekanismer mellom cellelinjer in vitro og dyr in vivo 6. Primær adipose-derivaterVed stamceller (ADSC) i stromal-vaskulære cellefraksjon kan bli isolert direkte fra hvitt adipose vev og indusert til å differensiere. Differensiering av ADSC inn i adipocytter sammenfatter mest sannsynlig fremgangs adipogenese og lipogenese i fettvev utvikling in vivo 7.
Griser er en egnet dyremodell for å studere adipogenese og lipogenese i fettvev utvikling. Våre tidligere undersøkelser svin 8-10 demonstrerer at ekspresjon av sterol regulerende element-bindingstranskripsjonsfaktor 1c (SREBP1c), en viktig transkripsjonsfaktor er kjent for å modulere transkripsjon av lipogenic fettsyre syntase, inhiberes av flerumettede fettsyrer (PUFA) i porcin leve og fettvev. Ekspresjonen av svine-SREBP1c redusert med PUFA in vivo og in vitro er lik andre arter så som mennesker og mus 11-13. Disse gris studier in vitro er hovedsakelig i differentiated adipocytter avledet fra svin ADSC (pADSC). Derfor kan denne primære cellekultur av pADSC brukes til å tjene som et pålitelig celledelt system for å studere fettvev utvikling eller andre stamcelle anvendelser.
Her presenterer vi en pålitelig mobilsystemet til å studere fettvev utvikling i primærcellekultur av pADSC. Sammenlignet med andre udødeliggjorte cellelinjer, gir denne fremgangsmåte en praktisk måte å isolere store mengder av høy kvalitet voksne stamceller som kan brukes til å studere differensieringsprosesser av adipocytter og andre mesenchymale linjene relatert til dyr utvikling in vivo. Den kritiske modifiserte trinnet i denne protokollen er at vi utlede pADSC ved hjelp av en 7- til 9-dagers gamle grisunge fordi det er lett å håndtere de små grisunge sammenlignet med eldre griser og lignende til andre arter 19,20, utbyttet og multipotency av pADSC avtar når grisen alderen 21.
Potensielle stamcelle kilder inkluderer embryonale stamceller (ESC), induserte pluripotente stamceller (IPSC) og postnatal voksne stamceller. Begrensningen av ADSC, klassifisert som voksne multipotente stamceller, er at multipotency av voksne stamcelleri differensiere divergerende linjer er relativt begrenset sammenlignet med ESC eller IPSC. Men etiske problemstillinger angående avledning av MGP og onkogene egenskaper IPSC begrense anvendelsen av ESC og IPSC 22,23. Derfor har mange etterforskere fokusert på voksne stamceller med innsats for å styrke pluripotency. Den vanligste kilden til voksne stamceller (MSC), som lenge har vært studert, er benmargavledede stamceller 24. Imidlertid er høsting benmargs betraktet som et relativt smertefull prosedyre. En annen bekymring er at utbyttet av stamceller fra benmargen er endelig. Benmarg aspirater, hvilket ga et gjennomsnitt på 6 x 10 6 kjerneinneholdende celler pr ml, og MSC bare utgjør 0,001 til 0,01% av alle de kjerneinneholdende cellene. Etter å ha vurdert disse ulempene, er ADSC foreslått som en mindre påtrengende kilde til å få multipotent stamceller 25,26.
Begrensninger i bruk av ADSC i regenerative legemiddel er avhengig i stor grad av celle-utbytte og kvalitet. Derfor er det av betydning å anvende griser for å isolere ADSC i denne protokoll til dannelse av en stor mengde av høykvalitets voksne stamceller. Grisen er et nyttig dyr modell som representerer mennesker på grunn av sammenlign orgel størrelse og mange fysiologiske og biokjemiske likheter mellom artene 27-30. Anskaffelse hADSC fra kommersielle selskaper er dyrt og i mange tilfeller cellene har blitt manipulert, passaged eller cryopreserved. Anskaffelse av kliniske prøver er relativt vanskelig på grunn av etiske problemstillinger og produksjon av ADSC er begrenset. Vi utlede ca 6 x 10 5 hADSC per g fett etter collagenase fordøyelsen. Med 100 g kvinnelige bryst fettvev (et gjennomsnitt sampling), kan totalt 6 x 10 7 celler høstes. Ved hjelp av en individuell mus, er utbyttet enda mer begrenset. Totalt 1 x 10 6 celler kan høstes fra 0,4 g av underhudsfett mus inguinal fettvev fra begge bena på en voksen FVB mus (6-8 uker gamle). Men i en individuell grise (7 til 9 dager gamle), totalt 2 x 10 8 celler lett kan høstes fra 60 g av subkutane fettvev erholdt fra ryggfettdepot. Den pADSC utledet i denne protokollen har full mesenchymale-type multipotency og passende mesenchymale stamcellemarkører. Derfor pADSC er en gunstig kilde for å oppnå store mengder av voksne stamceller uten at det går stamcelle kvalitet.
Anvendelsen av pADSC er ikke begrenset til å tyde adipocyttdifferensiering inkludert adipogenese og lipogenese. Nylig ADSC har blitt en populær kilde til stamceller innen regenerativ medisin 22,31,32. Sammenlignet med andre stilk cellekilder, ADSC beholde en unik fordel av å være lett tilgjengelige og rikelig, og deres robuste multipotency har vist seg å være et lovende kilde for stamcelleterapi og vev engineering 22,33,34. Lett tilgjengelighet av fettvev gjør ADSC en av de minst påtrengende måter å få multipotente stamceller. Nylig har vi differensiert pADSC til glukose-responsive insulin-sekresjon klynger, noe som indikerer at pADSC ikke er begrenset til mesenchymale differensiering (upubliserte data). Andre har også blitt vist at ADSC kan bli differensiert i mange celletyper avledet fra andre bakterie lag som endodermal hepatocytter (fra hADSC 35 eller pADSC 36) eller ectodermal nevroner (fra hADSC 37 eller pADSC 38). Således pADSC kunne brukes for high-throughput medikament eller biomateriale screening ved å lede celler til avvikende differensieringsprosesser for å gi ønskede linjene. Derfor pADSC utledet i denne protokollen har potensiell anvendelse i stamcelleterapi og vev transplantasjon for regenerativ medisin forskning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til alle lab medlemmer for omfattende diskusjon og teknikk støtter i denne protokollen. Forskning utført i laboratoriet ble støttet med tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST 103-2314-B-002-126 og MOST 102-2313-B-002-026-My3) og med tilskudd fra Aim for Top Universitetet Plan (104R350144) av National University, Taiwan.
Reagents | |||
Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-001-1 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution | Biological Industries | 03-033-1 | For antibiotics and antimycotic usage |
αMEM, no nucleosides | Life Technologies | 12561-049 | |
ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Life Technologies | 25200072 | |
CD4a-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700063 | |
CD29-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700398 | |
CD31-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700467 | |
CD44-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700183 | |
CD45-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700483 | |
CD90-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700686 | |
HLA Class I-PE (MHC I) | Sigma-Aldrich | SAB4700640 | |
HLA-DR-PE (MHC II) | Sigma-Aldrich | SAB4700662 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | |
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Rosiglitazone | Cayman | 71740 | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
2-Phospho-L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 49752 | |
TGFB1 Recombinant Human Protein | R&D Systems | 240-B-002 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Carbon Steel Blades | Thomas Scientific | 6727C18 | |
Falcon 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
Falcon 6-well plate | Corning | 353046 | |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 |