Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolasjon og Differensiering av adipose-avledet stamceller fra svine Subkutan fettvev

doi: 10.3791/53886 Published: March 31, 2016

Introduction

Fedme, til stede i ca 30% av befolkningen i USA, med en kroppsmasseindeks over 30, har dukket opp som en utbredt verdensomspennende fenomen en. Fedme har en tendens til å føre til relaterte komplikasjoner inkludert hjerte- og karsykdommer, type-2 diabetes og kreft 2-4. Derfor arbeider med fedme er en viktig prioritet. Fedme er manifestert av massiv utvidelse av fettvev, og skyldes overdreven matinntak og en stillesittende livsstil i det moderne samfunn. Derfor tyde transcriptional regulering av adipogenesen og lipogenese kunne holde lover å behandle fedme eller diabetes fem.

Den 3T3-L1, 3T3-F442A og andre muse adipogenic cellelinjer har blitt brukt til å studere adipogenesen eller lipogenese i løpet av fettvev utvikling. Det er imidlertid noen avvik i reguleringsmekanismer mellom cellelinjer in vitro og dyr in vivo 6. Primær adipose-derivaterVed stamceller (ADSC) i stromal-vaskulære cellefraksjon kan bli isolert direkte fra hvitt adipose vev og indusert til å differensiere. Differensiering av ADSC inn i adipocytter sammenfatter mest sannsynlig fremgangs adipogenese og lipogenese i fettvev utvikling in vivo 7.

Griser er en egnet dyremodell for å studere adipogenese og lipogenese i fettvev utvikling. Våre tidligere undersøkelser svin 8-10 demonstrerer at ekspresjon av sterol regulerende element-bindingstranskripsjonsfaktor 1c (SREBP1c), en viktig transkripsjonsfaktor er kjent for å modulere transkripsjon av lipogenic fettsyre syntase, inhiberes av flerumettede fettsyrer (PUFA) i porcin leve og fettvev. Ekspresjonen av svine-SREBP1c redusert med PUFA in vivo og in vitro er lik andre arter så som mennesker og mus 11-13. Disse gris studier in vitro er hovedsakelig i differentiated adipocytter avledet fra svin ADSC (pADSC). Derfor kan denne primære cellekultur av pADSC brukes til å tjene som et pålitelig celledelt system for å studere fettvev utvikling eller andre stamcelle anvendelser.

Protocol

Merk: Det er etablert og brukes i forskning Denne metoden rapportert tidligere 14-17 fra dette laboratoriet; over tid metodikken ble endret. Den aktuelle fremgangsmåte ble utført ved bruk av et gjennomsnitt av 60 g av svin subkutane fettvev fra en grisunge (7 til 9 dager gamle) med poding på 6-brønners vevskulturplater. Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur med mindre annet er angitt. Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved National Taiwan University.

1. Forbered Fordøyelse Medium

  1. Skaff subkutane fettvev fra nakke og rygg; 40 til 80 g pr grisunge (7 til 9 dager gamle), avhengig av størrelsen av grisene. Her bruker 60 g av subkutane fettvev hentet fra en gris.
  2. Forbered fordøyelse medium: veie kollagenase II pulver med et total på 54.000 enheter, og oppløse den i 90 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM,60 g fett) i en 100 ml flaske serologisk (900 enheter av kollagenase / 1,5 ml DMEM / g fett).
  3. Beveg lett fordøyelsen medium på et rystebord (100 rpm) i minst 15 minutter for å oppløse og deretter passere fordøyelsen medium gjennom et 0,22 um filter for sterilisering. Oppbevar ved 4 ° C før bruk.

2. dissekere Subkutan fettvev fra Pigs

  1. Sterilisere alle instrumenter, glass og plast ware og varm hele media til 37 ° C før bruk.
  2. Ofre piglet med elektrisk fantastisk og blodtapping eller ved å bruke en metode i henhold til lokale IACUC forskrifter. Utfør disseksjon nøye og umiddelbart etter grisunger blir ofret.
  3. Legg den piglet på et rent kirurgisk tabell (tilbake vender opp og magen ned). Barbere bort håret fra Nøff tilbake fjerne alt hår fra nakken til halen og på begge sider ned til midtlinjen.
  4. Skrubb gris rygghuden med 7,5% povidone-jod tre ganger (med tre nye selvstendige-skrubber), og deretter tillate at jod til å sitte på overflaten av huden i omtrent 10 min.
  5. Fjern povidon-jod med flere spray av 70% etanol. Bruk gasbind pads eller vev papirer inneholdende 70% etanol for å tørke huden i en retning, gjentatt inntil ingen åpenbare fargen av povidon-jod er observert.
  6. Bruke en skalpell for å skille den porcine ryggfettlaget av subkutane fettvev sammen med de vedlagte hudlaget fra muskler samtidig holder opp fett og huden ved hjelp av tang.
  7. Umiddelbart senke fettlaget av subkutane fettvev med vedlagte hud i en sterilisert begerglass (200 ml) inneholdende serumfritt DMEM.
  8. Spray utsiden av begeret som inneholder den fett-lag med 70% etanol, og plasser i en laminær strømningshette cellekultur. Plasser en stor (40 cm x 30 cm) sterilisert trippel-lag dekkfolie i panseret. [En trelags brukes for å sikre kontinuerlig integritet.]
  9. Plasservev med huden vendt ned på dekkfolie.
  10. Trim de resterende muskelvev ut av fettvev ved hjelp av pinsett og saks for å unngå forurensning med muskelvev.
  11. Skjær fettet i firkantede biter (~ 7 cm x 7 cm) med en skalpell eller saks. Sette disse delene av fettlaget inn i en ny sterilisert begerglass (200 ml) inneholdende serumfritt DMEM.
  12. Still et tilpasset stykke holder på dekkfolie sammen med et karbonstål slicer blad (figur 1). Ta en bit av fett ut av begeret og plassere den på høvelen (huden lag på toppen og fettlaget under).
  13. Skjær fettet lag med subkutane fettvev i ca 1 mm tykke stykker. Skjær fettlaget fra huden så nær som mulig, men unngå å skjære huden.
  14. Finhakk skiver fettvev med saks så fin som mulig.
  15. Legg filtrert fordøyelse medium som inneholder kollagenase til en 250 ml Erlenmeyer-kolbe eller en serologisk flaske med hakketfettvev (54.000 enheter av kollagenase / 90 ml DMEM / 60 g fett).
  16. Inkuber og virvle Erlenmeyer-kolbe ved 45 rpm i en orbital-rystemaskin i 90 min ved 37 ° C for å tillate at kollagenase å fordøye vev.
    Merk: Kontroller hver 15 til 30 minutter for å unngå over-fordøyelsen. Fordøyelsesprosessen er fullført dersom fordøyelse mediet er en oppslemming uten betydelige vev klumper.
  17. Legge til et like stort volum (lik fordøyelse medium) av dyrkningsmedium inneholdende DMEM / F12 med 10% føtalt bovint serum (FBS) for å stoppe den collagenase fordøyelsen.

Figur 1
Figur 1. En tilpasset slicer brukes til isolering av pADSC. Dissekert fettvev fra svin rygg subkutane adipose vev er sammensatt av fett laget med vedlagt hudlagene. En slicer er nødvendig for å skjære fettet lag ca 1 mm tykk med unngåelse av over-skjære inn i hudlagene. Fra venstre til høyre: skive holder, slicer pad, karbonstål slicer blad, og skruer. Slicer bladet er satt inn mellom skive holder og høvelen pad når montert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Innsamling av pADSC fra stromal-vaskulære Fraksjon

  1. Bestå fordøyelse medium inneholdende de fordøyde adipose vev gjennom et enkelt lag av chiffon inn i en ren steriliserte 250 ml Erlenmeyer-kolbe eller en 250 ml serologisk flaske. Bruk en pinsett til å trykke ned midt i chiffon for å veilede og bistå passering av fordøye.
  2. Hell av vannet og vri chiffon med en tang for å fullføre passasje.
  3. Fordel fordøyelsen medium inn i fire 50 ml koniske sentrifugerør (~ 40 ml medium per rør).
  4. Sentrifuger ved 700 xg i 10 minutter for å samle pellet av stromale-vaskulære celler.
  5. Sentrifuger ved 700 xg i 6 min. Dekanter supernatanten.
  6. Tilsett 10 ml ACK lyseringsbuffer og deretter resuspender pelleten ved pipettering. La det stå i 7 minutter (5 til 10 minutter) ved romtemperatur for å lysere røde blodceller i stromal-vaskulære fraksjon.
  7. Legg like mengder av DMEM (10 ml) for å stoppe reaksjonen med forsiktig risting av røret, og deretter sentrifuger ved 700 xg i 10 min.
  8. Dekanter supernatanten, tilsett 10 ml DMEM i hvert rør, resuspender pelleten med gjentatt pipettering, og sentrifuger ved 700 xg i 6 min. Gjenta to ganger.
  9. Samle og passerer DMEM (totalt 40 ml DMEM fra 4 rør som representerer 60 g fett) med suspenderte cellene gjennom en 100 mikrometer sil inn i en ny 50 ml konisk tube.
  10. Forsiktig pipette medium flere ganger for å blande frisk og delmengde 20 ul celle-inneholdende medium blandet med 180 ul av 0,4% trypanblått-oppløsning (1:10 fortynning) i et nytt 1,5 ml Eppendorf-rør.
  11. Tell cellene med et hemocytometer, og deretter frø pADSC ved en tetthet på 60.000 celler / cm2 på en ønsket størrelse på kulturskål eller plate med kulturmedium inneholdende DMEM / F12, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika av penicillin -streptomycin-amfotericin B-løsning (P / S / A). Vanligvis seedet pADSC på seks-brønns vevskulturplater for adipocyte eller osteocyte differensiering. Seed den pADSC på 10 cm retter til markør overflaten farging av stamceller eller chondrocyttransplantasjon differensiering.
  12. Inkuber platene eller skålene i 37 ° C inkubator i luft med 5% CO2 for å tillate cellebinding til platene.

4. Identifisering stamcelleoverflatemarkører av pADSC ved flowcytometri

  1. Etter 24 timer fjerne mediet helt, vaske the 10-cm tallerken to ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS), og høste celler med 1 ml av 0,25% trypsin-EDTA i 5 minutter ved 37 ° C.
  2. Nøytralisere trypsin-EDTA med like mengder av kulturmedium (1 ml), samle celler i en ny 15-ml konisk rør, og deretter sentrifuger ved 400 x g i 7 min.
  3. Dekanter supernatanten. Vask pelleten to ganger i 3 ml iskald FCS-vaskebuffer (PBS inneholdende 10% FBS) ved hjelp av re-suspensjonen ved pipettering kombinert med sentrifugering ved 400 x g i 7 min.
  4. Resuspender, telle, og justere pADSC 10 6 celler / ml i iskald FCS-vaskebuffer. Plasser-celler (100 ul / hvert rør) i flere nye 15 ml koniske rør og inkuberes rør inneholdende pADSC ved 4 ° C i 30 min med antistoffer mot enten fykoerytrin-konjugert CD4a (CD4a-PE), CD29-PE, CD31-PE , CD44-PE, CD45-PE, CD90-PE, MHC i-PE eller MHC II-PE for direkte farging. Stopp reaksjonen ved vasking av cellene to ganger i 10 ml FCS-vaskebuffer kombinert med 400 x g centrifugation for 7 min.
  5. Fiks og resuspender celler i fikseringsbuffer (PBS med 0,01% FBS og 1% formaldehyd) for flowcytometri i henhold til produsentens instruksjoner og vår forrige publisering 18.

5. Differensiering av pADSC inn Adipocytter, osteocytter og Chondrocytter

  1. Differensiering av pADSC i adipocytter
    1. Forbered adipocyte induksjon medium og adipocyte vedlikehold medium
      1. For adipocyttdifferensiering induksjon medium, fremstille 1 liter serumfritt DMEM / F12 (sammen med antibiotika av 1% P / S / A) som inneholdt følgende: 1 ml insulin lager (10 mg / ml HEPES-buffer, pH 8), sluttkonsentrasjon = 10 ug / ml; 1 pl T3 lager (3,3 ', 5-trijod-L-thyronin, 1 mM i DMSO), sluttkonsentrasjon = 1 nM; 200 ul transferrin lager (50 mg / ml dobbeltdestillert H2O), sluttkonsentrasjon = 10 ug / ml; 100 ul deksametason lager (10 mM i etanol), sluttkonsentrasjon = 1 mikrometer; 100 ul rosiglitazon lager (10 mM i DMSO), slutt kons= 1 mikrometer.
      2. Forbered adipocyte vedlikehold medium med de samme tilleggene som induksjon medium, men med utelatelse av deksametason.
    2. Differensiering prosess for adipocytter
      Merk: Etter såing pADSC på seks-brønns plater, vil pADSC bli konfluente innen 72 timer.
      1. Etter 3 dager, fjerne mediet helt og tilsett 3 ml adipocyte induksjon medium i hver brønn. Gå tilbake platene til inkubatoren. Dette er dag null av differensiering.
      2. Etter 3 dager, fjerner fettceller induksjon medium helt og erstatte med 3 ml adipocyte vedlikehold medium hver tredje dag. Eldre adipocytter vil bli terminalt differensiert etter om 9 dager. Over 90% av adipocytter er godt differensiert ved hjelp av denne protokollen. Disse adipocytter er klar for Oil Red O farging.
  2. Differensiering av pADSC inn osteocytter
    1. Forbered osteocyte induksjon medium: komplett kultur medium (DMEM / F12 med 10% FBS og 1% P / S / A) inneholdende 1 uM deksametason, 10 mM β-glycerofosfat og 50 ug / ml askorbat-2-fosfat.
    2. Differensiering prosess for osteocytter
      Merk: Etter såing pADSC på seks-brønns plater, vil pADSC bli konfluente innen 72 timer.
      1. Etter 3 dager, fjerne mediet helt og tilsett 3 ml osteocyte induksjon medium i hver brønn. Gå tilbake platene til 37 ° C inkubator. Dette er dag null av differensiering.
      2. Erstatt med osteocyte induksjon medium hver tredje dag. Modne osteocytter vil dannes etter 14 dager med differensiering. Disse osteocytter er klar for Alizarin Red S farging.
  3. Differensiering av pADSC inn chondrocytes
    1. Forbered chondrocyttransplantasjon induksjon medium: aMEM inneholdende 1% FBS, 6,25 ug / ml insulin, 50 ug / ml askorbat-2-fosfat, og 10 ng / ml transformerende vekstfaktor-β1.
    2. Differensiering prosess for chondrocytes Etter utsåing pADSC på 10 cm kulturskåler i 24 timer, fjerne dyrkningsmedium og fullstendig vaske to ganger med PBS.
    3. Trypsineres pADSC med 1 ml av 0,25% trypsin-EDTA i 5 min, og deretter nøytralisere med 1 ml kulturmedium. Samle, telle og justere pADSC i 15 ml koniske rør med en tetthet på 2,5 x 10 5 celler per rør. Bruk en hemocytometer å telle cellene.
    4. Etter sentrifugering ved 400 x g i 7 minutter, kaste supernatanten uten å forstyrre pelleten og tilsett 1 ml kondrocytt induksjon medium i et 15 ml rør. Røret blir returnert til 37 ° C inkubator. Dette er dag null av differensiering.
    5. Sett på chondrocyttransplantasjon induksjonsmediet etter tre dager uten å fjerne celler på bunnen. Eldre chondrocytes vil danne i ca 14 dager. Disse kondrocytter er klar for toluidinblått O-farging.

6. Farging av differensiert Adipocytter, Osteocytes og Chondrocytter

  1. Olje Red O farging for differensierte adipocytter
    1. På dag 9, fjerne adipocytt opprettholdelsesmedium i 6-brønners kulturplater med differensierte adipocytter og deretter platen vaskes to ganger med PBS. [I de følgende trinnene, legger nok utpekt reagenser til å dekke hver brønn på seks-brønns plate.]
    2. Løs adipocytter med 10% formalinløsning i minst 10 min.
    3. Fjern det 10% formalin løsning og platen vaskes to ganger med dobbeltdestillert vann.
    4. Etter to vaskinger, tilsett 100% propylenglykol til kulturplaten og la stå i 1 min.
    5. Fjern det 100% propylenglykol og deretter legge Oil Red O-løsning (0,5% i propylenglykol) til kulturplaten. La stå i minst 10 minutter på en riste rocker med forsiktig omrøring (100 rpm).
    6. Fjern Oil Red O-løsning og deretter erstatte med 60% propylenglykol. La det stå i 1 min.
    7. Fjern det 60% propylenglykol og deretter platen vaskes to ganger med double-destillert vann.
    8. Bytt ut med 10% formalin løsning. De fargede lipiddråper innsiden av adipocytter er klare for observasjon ved lysmikroskopi.
    9. Kvantifisering av intracellulær Oil Red O (valgfritt trinnene nedenfor): Etter mikroskopisk observasjon, fjerne 10% formalinløsning og vask platen to ganger med dobbelt destillert vann.
    10. Tapp platen helt og tilsett 500 ul av isopropanol til 6-brønns plate.
    11. La isopropanol stå i 6-brønns plate i en svak vipperister (100 rpm) i minst 10 min for å oppløse fargestoffet med Oil Red O.
    12. Aspirer isopropanol inneholder Oil Red O og fordele på en 96-brønns plate. Kvantifisere hentet Oil Red O bruker en spektrofotometrisk avlesning ved 510 nm.
  2. Alizarin Red S farging for differensiert osteocytter
    1. Ved dag 14, fjerne osteocyte induksjonsmedium fra 6-brønns plater med differensierte osteocytter og vaskes platene to ganger med PBS. [I following trinn, legge nok utpekt reagenser til å dekke hver brønn på seks-brønns plate.]
    2. Fix osteocytter i 10% formalinløsning i minst 10 min.
    3. Fjern det 10% formalin løsning fra hver brønn og platen vaskes to ganger med dobbeltdestillert vann.
    4. Etter to vasker, tilsett 2% Alizarin Red S-løsning (pH = 4,1-4,3) til seks-brønns plate og la stå i minst 15 minutter på en svak rocker rister (100 rpm).
    5. Fjern det Alizarin Red S-løsning og deretter platen vaskes to ganger med dobbeltdestillert vann.
    6. Bytt ut med 10% formalin løsning. Osteocytter er klare for observasjon ved lysmikroskopi.
  3. Toluidinblått O farging for differensierte chondrocytes
    1. Ved dag 14 aspirere kondrocytt induksjonsmedium fra 15 ml konisk rør uten å fjerne sedimentene fra differensiert kondrocytter i bunnen av røret og vaske røret to ganger med PBS. [I de følgende trinnene, legger nok utpekt reagenser til vikr kondrocytter i bunnen av røret eller på den delen lysbildet.]
    2. Fix chondrocytes i 10% formalinløsning i minst 10 min.
    3. Fjern det 10% formalinoppløsning fra hvert rør og vaske røret to ganger med dobbeltdestillert vann.
    4. Etter to vaskinger bygge inn pellets i oktober forbindelse og seksjon med en kryostat med en tykkelse på 5 um.
    5. Flekk raset av kryostatsnitt med toluidinblått O-løsning (0,1% med pH 4,1).
    6. Fjern toluidinblått O-løsning og deretter vaske den delen to ganger med dobbeltdestillert vann.
      Merk: Chondrocytter på lysbildene er klar for observasjon ved lysmikroskopi.

Representative Results

Den pADSC avledet fra gris dorsal subkutant fett ble sådd ut på kulturplater eller retter og vist i figur 2. Morfologien av pADSC avledet fra stromal-vaskulære fraksjon er lik mus eller humant ADSC. Tjuefire timer etter såing, er Subkonfluente pADSC holdt og har en utvidet fibroblast-lignende morfologi (figur 2A). Den pADSC blir sammenflytende i løpet av 72 timer og er klar for adipocyttdifferensiering eller andre mesenchymale-type differensiering (figur 2B). pADSC utviser sterk adipogenic potensial etter kjemisk induksjon og modne adipocytter kan observeres etter 9 dager med differensiering med over 90% av de pADSCs viser adipogenic differensiering (figur 2C).

For å møte de karakteristikkene av pADSC utledet i denne protokollen, ble overflatemarkører pADSC vurderes av flowcytometri analysis. Som vist i figur 3, overflatemarkører for stamceller, inkludert CD29, CD44, CD90 og MHC-I (eller HLA I), ble sterkt uttrykt. Negative overflatemarkører, for eksempel CD4a, CD31, CD45 og MHC II (eller HLA II) var knapt synlig i pADSC utledet i protokollen (figur 3). Disse resultatene viser at disse pADSC utstillings mesenchymale-type stamcelleegenskaper uten vesentlig endothelial eller hematopoetisk stamcelle forurensning, inkludert myeloide eller lymfoide stamceller.

For ytterligere å bekrefte at pADSC representere stamceller ble multipotency av pADSC undersøkt av differensiering i adipocytter, osteocytter og chondrocytes. Disse adipocytter, osteocytter og chondrocytes ble farget av spesifikke fargestoffer, olje Red O, Alizarin rød S, og toluidinblått O, henholdsvis (figur 4). Disse dataene indikerer at denne protokollen generert pADSC som beholdt multipotency med full egenskaper som ligner mesenchymale-type stamceller.

Figur 2
Figur 2. Morfologi av pADSC fra svine tilbake fett region. (A) Subkonfluente pADSC klebet og ekspandert etter 24 h poding på en 6-brønners kulturplate. (B) pADSC ble konfluente etter 72-h seeding på en 6-brønn kultur plate. (C) Eldre adipocytter ble observert etter 9 dager med adipogenic differensiering fra pADSC. Bilder ble tatt på 100 x forstørrelse ved hjelp av fasekontrastmikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Identifisering av stamcelleoverflatemarkører for pADSC. 1 x 10 5 av pADSC ble omsatt med spesifikke antistoffer og analysert med hensyn på stamcellemarkører ved flowcytometri analyse. Tallene angir prosentandelen av fargede celler i populasjonen (rød) sammenlignet med de ufargede kontroll. X-aksen representerer den relative fluorescensintensitet. Y-aksen representerer befolkningen i cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. multipotente differensiering av pADSC. Multipotency av pADSC ble bestemt ved å skille pADSC inn (A) adipocytter, (B) osteocytter (C) chondrocytes og farget av representative fargestoffer, olje Red O, Alizarin rød S, og toluidinblått O, henholdsvis . ImaGES ble tatt på (A) 100 x, (B) 200 x, og (C) 100 x forstørrelse ved hjelp av fasekontrastmikroskop, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her presenterer vi en pålitelig mobilsystemet til å studere fettvev utvikling i primærcellekultur av pADSC. Sammenlignet med andre udødeliggjorte cellelinjer, gir denne fremgangsmåte en praktisk måte å isolere store mengder av høy kvalitet voksne stamceller som kan brukes til å studere differensieringsprosesser av adipocytter og andre mesenchymale linjene relatert til dyr utvikling in vivo. Den kritiske modifiserte trinnet i denne protokollen er at vi utlede pADSC ved hjelp av en 7- til 9-dagers gamle grisunge fordi det er lett å håndtere de små grisunge sammenlignet med eldre griser og lignende til andre arter 19,20, utbyttet og multipotency av pADSC avtar når grisen alderen 21.

Potensielle stamcelle kilder inkluderer embryonale stamceller (ESC), induserte pluripotente stamceller (IPSC) og postnatal voksne stamceller. Begrensningen av ADSC, klassifisert som voksne multipotente stamceller, er at multipotency av voksne stamcelleri differensiere divergerende linjer er relativt begrenset sammenlignet med ESC eller IPSC. Men etiske problemstillinger angående avledning av MGP og onkogene egenskaper IPSC begrense anvendelsen av ESC og IPSC 22,23. Derfor har mange etterforskere fokusert på voksne stamceller med innsats for å styrke pluripotency. Den vanligste kilden til voksne stamceller (MSC), som lenge har vært studert, er benmargavledede stamceller 24. Imidlertid er høsting benmargs betraktet som et relativt smertefull prosedyre. En annen bekymring er at utbyttet av stamceller fra benmargen er endelig. Benmarg aspirater, hvilket ga et gjennomsnitt på 6 x 10 6 kjerneinneholdende celler pr ml, og MSC bare utgjør 0,001 til 0,01% av alle de kjerneinneholdende cellene. Etter å ha vurdert disse ulempene, er ADSC foreslått som en mindre påtrengende kilde til å få multipotent stamceller 25,26.

Begrensninger i bruk av ADSC i regenerative legemiddel er avhengig i stor grad av celle-utbytte og kvalitet. Derfor er det av betydning å anvende griser for å isolere ADSC i denne protokoll til dannelse av en stor mengde av høykvalitets voksne stamceller. Grisen er et nyttig dyr modell som representerer mennesker på grunn av sammenlign orgel størrelse og mange fysiologiske og biokjemiske likheter mellom artene 27-30. Anskaffelse hADSC fra kommersielle selskaper er dyrt og i mange tilfeller cellene har blitt manipulert, passaged eller cryopreserved. Anskaffelse av kliniske prøver er relativt vanskelig på grunn av etiske problemstillinger og produksjon av ADSC er begrenset. Vi utlede ca 6 x 10 5 hADSC per g fett etter collagenase fordøyelsen. Med 100 g kvinnelige bryst fettvev (et gjennomsnitt sampling), kan totalt 6 x 10 7 celler høstes. Ved hjelp av en individuell mus, er utbyttet enda mer begrenset. Totalt 1 x 10 6 celler kan høstes fra 0,4 g av underhudsfett mus inguinal fettvev fra begge bena på en voksen FVB mus (6-8 uker gamle). Men i en individuell grise (7 til 9 dager gamle), totalt 2 x 10 8 celler lett kan høstes fra 60 g av subkutane fettvev erholdt fra ryggfettdepot. Den pADSC utledet i denne protokollen har full mesenchymale-type multipotency og passende mesenchymale stamcellemarkører. Derfor pADSC er en gunstig kilde for å oppnå store mengder av voksne stamceller uten at det går stamcelle kvalitet.

Anvendelsen av pADSC er ikke begrenset til å tyde adipocyttdifferensiering inkludert adipogenese og lipogenese. Nylig ADSC har blitt en populær kilde til stamceller innen regenerativ medisin 22,31,32. Sammenlignet med andre stilk cellekilder, ADSC beholde en unik fordel av å være lett tilgjengelige og rikelig, og deres robuste multipotency har vist seg å være et lovende kilde for stamcelleterapi og vev engineering 22,33,34. Lett tilgjengelighet av fettvev gjør ADSC en av de minst påtrengende måter å få multipotente stamceller. Nylig har vi differensiert pADSC til glukose-responsive insulin-sekresjon klynger, noe som indikerer at pADSC ikke er begrenset til mesenchymale differensiering (upubliserte data). Andre har også blitt vist at ADSC kan bli differensiert i mange celletyper avledet fra andre bakterie lag som endodermal hepatocytter (fra hADSC 35 eller pADSC 36) eller ectodermal nevroner (fra hADSC 37 eller pADSC 38). Således pADSC kunne brukes for high-throughput medikament eller biomateriale screening ved å lede celler til avvikende differensieringsprosesser for å gi ønskede linjene. Derfor pADSC utledet i denne protokollen har potensiell anvendelse i stamcelleterapi og vev transplantasjon for regenerativ medisin forskning.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til alle lab medlemmer for omfattende diskusjon og teknikk støtter i denne protokollen. Forskning utført i laboratoriet ble støttet med tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi (MOST 103-2314-B-002-126 og MOST 102-2313-B-002-026-My3) og med tilskudd fra Aim for Top Universitetet Plan (104R350144) av National University, Taiwan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Collagenase, Type II Sigma-Aldrich C6885
DMEM, high glucose, pyruvate Life Technologies 11995-040
DMEM/F-12, HEPES Life Technologies 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS)  Biological Industries 04-001-1  
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution Biological Industries 03-033-1 For antibiotics and antimycotic usage
αMEM, no nucleosides  Life Technologies 12561-049
ACK lysis buffer  Life Technologies A10492-01
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Life Technologies 25200072
CD4a-PE Sigma-Aldrich SAB4700063
CD29-PE Sigma-Aldrich SAB4700398
CD31-PE Sigma-Aldrich SAB4700467
CD44-PE Sigma-Aldrich SAB4700183
CD45-PE Sigma-Aldrich SAB4700483
CD90-PE Sigma-Aldrich SAB4700686
HLA Class I-PE (MHC I)  Sigma-Aldrich SAB4700640
HLA-DR-PE (MHC II)  Sigma-Aldrich SAB4700662
Insulin  Sigma-Aldrich I9278
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) Sigma-Aldrich T6397
Transferrin  Sigma-Aldrich T2036
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich I7018
Dexamethasone  Sigma-Aldrich D4902
Rosiglitazone Cayman 71740
β-Glycerophosphate  Sigma-Aldrich G9422
2-Phospho-L-ascorbic acid  Sigma-Aldrich 49752
TGFB1 Recombinant Human Protein  R&D Systems  240-B-002
Oil Red O  Sigma-Aldrich O0625
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich 198161
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Carbon Steel Blades Thomas Scientific 6727C18
Falcon 100 µm cell strainer Corning  352360
Falcon 6-well plate Corning  353046
Falcon 100 mm  dish Corning  353003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farese, R. V., Zechner, R., Newgard, C. B., Walther, T. C. The Problem of Establishing Relationships between Hepatic Steatosis and Hepatic Insulin Resistance. Cell Metab. 15, 570-573 (2012).
  2. Taubes, G. Cancer research. Unraveling the obesity-cancer connection. Science. 335, (28), 30-32 (2012).
  3. Apovian, C. M., Gokce, N. Obesity and cardiovascular disease. Circulation. 125, 1178-1182 (2012).
  4. Glass, C. K., Olefsky, J. M. Inflammation and lipid signaling in the etiology of insulin resistance. Cell Metab. 15, 635-645 (2012).
  5. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nature. 444, 847-853 (2006).
  6. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4, 263-273 (2006).
  7. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells. J Vis Exp. (2013).
  8. Hsu, J. M., Ding, S. T. Effect of polyunsaturated fatty acids on the expression of transcription factor adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 and of lipogenic and fatty acid oxidation enzymes in porcine differentiating adipocytes. Brit J Nutr. 90, 507-513 (2003).
  9. Hsu, J. M., Wang, P. H., Liu, B. H., Ding, S. T. The effect of dietary docosahexaenoic acid on the expression of porcine lipid metabolism-related genes. J Anim Sci. 82, 683-689 (2004).
  10. Liu, B. H., Kuo, C. F., Wang, Y. C., Ding, S. T. Effect of docosahexaenoic acid and arachidonic acid on the expression of adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1 in differentiating porcine adipocytes. J Anim Sci. 83, 1516-1525 (2005).
  11. Ou, J. F., et al. Unsaturated fatty acids inhibit transcription of the sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) gene by antagonizing ligand-dependent activation of the LXR. P Natl Acad Sci USA. 98, 6027-6032 (2001).
  12. Sekiya, M., et al. Polyunsaturated fatty acids ameliorate hepatic steatosis in obese mice by SREBP-1 suppression. Hepatology. 38, 1529-1539 (2003).
  13. Xu, J., Nakamura, M. T., Cho, H. P., Clarke, S. D. Sterol regulatory element binding protein-1 expression is suppressed by dietary polyunsaturated fatty acids - A mechanism for the coordinate suppression of lipogenic genes by polyunsaturated fats. J Biol Chem. 274, 23577-23583 (1999).
  14. Ding, S. T., McNeel, R. L., Mersmann, H. J. Conjugated linoleic acid increases the differentiation of porcine adipocytes in vitro. Nutr Res. 20, 1569-1580 (2000).
  15. Ding, S., Mersmann, H. J. Fatty acids modulate porcine adipocyte differentiation and transcripts for transcription factors and adipocyte-characteristic proteins. J Nutr Biochem. 12, 101-108 (2001).
  16. Liu, L. R., et al. Serum amyloid A induces lipolysis by downregulating perilipin through ERK1/2 and PKA signaling pathways. Obesity (Silver Spring. 19, 2301-2309 (2011).
  17. Chen, Y. J., et al. Docosahexaenoic acid suppresses the expression of FoxO and its target genes. J Nutr Biochem. 23, 1609-1616 (2012).
  18. Lin, Y. Y., et al. Modulation of glucose and lipid metabolism by porcine adiponectin receptor 1-transgenic mesenchymal stromal cells in diet-induced obese mice. Cytotherapy. 15, 971-978 (2013).
  19. Schipper, B. M., Marra, K. G., Zhang, W., Donnenberg, A. D., Rubin, J. P. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 60, 538-544 (2008).
  20. Efimenko, A., et al. Adipose-Derived Mesenchymal Stromal Cells From Aged Patients With Coronary Artery Disease Keep Mesenchymal Stromal Cell Properties but Exhibit Characteristics of Aging and Have Impaired Angiogenic Potential. Stem Cell Transl Med. 3, 32-41 (2014).
  21. Akanbi, K. A., Brodie, A. E., Suryawan, A., Hu, C. Y. Effect of age on the differentiation of porcine adipose stromal-vascular cells in culture. J Anim Sci. 72, 2828-2835 (1994).
  22. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise Review: Adipose-Derived Stem Cells as a Novel Tool for Future Regenerative Medicine. Stem Cells. 30, 804-810 (2012).
  23. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Cir Res. 100, 1249-1260 (2007).
  24. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived Stem Cells: Current Findings and Future Perspectives. Discov Med. 57, 160-170 (2011).
  25. Baer, P. C. Adipose-Derived Stem Cells and Their Potential to Differentiate into the Epithelial Lineage. Stem Cell Dev. 20, 1805-1816 (2011).
  26. Kakudo, N., et al. Adipose-derived regenerative cell (ADRC)enriched fat grafting: optimal cell concentration and effects on grafted fat characteristics. J Transl Med. 11, (2013).
  27. Lunney, J. K. Advances in swine biomedical model genomics. Int J Biol Sci. 3, 179-184 (2007).
  28. Prather, R. S., Lorson, M., Ross, J. W., Whyte, J. J., Walters, E. Genetically Engineered Pig Models for Human Diseases. Annu Rev Anim Biosci. 1, 203-219 (2013).
  29. Vodicka, P., et al. The miniature pig as an animal model in biomedical research. Ann Ny Acad Sci. 1049, 161-171 (2005).
  30. Wolf, E., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Transgenic Res. 20, 1150-1150 (2011).
  31. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The Potential of Adipose Stem Cells in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 7, 269-291 (2011).
  32. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circ Res. 100, 1249-1260 (2007).
  33. Cignarelli, A., et al. Human adipose tissue stem cells: relevance in the pathophysiology of obesity and metabolic diseases and therapeutic applications. Expert Rev Mol Med. 14, (2012).
  34. Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. Adipose tissue stem cells: the great WAT hope. Trends Endocrinol Metab. 23, 270-277 (2012).
  35. Banas, A., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a source of human hepatocytes. Hepatology. 46, 219-228 (2007).
  36. Bruckner, S., et al. A fat option for the pig: hepatocytic differentiated mesenchymal stem cells for translational research. Exp Cell Res. 321, 267-275 (2014).
  37. Anghileri, E., et al. Neuronal Differentiation Potential of Human Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Dev. 17, 909-916 (2008).
  38. Huang, T. T., He, D. S., Kleiner, G., Kuluz, J. Neuron-like differentiation of adipose-derived stem cells from infant piglets in vitro. J Spinal Cord Med. 30, S35-S40 (2007).
Isolasjon og Differensiering av adipose-avledet stamceller fra svine Subkutan fettvev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).More

Chen, Y. J., Liu, H. Y., Chang, Y. T., Cheng, Y. H., Mersmann, H. J., Kuo, W. H., Ding, S. T. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (109), e53886, doi:10.3791/53886 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter