This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.
Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.
Fetma, förekommer i cirka 30% av befolkningen i USA, med ett body mass index över 30, har dykt upp som ett utbrett globalt fenomen 1. Fetma tenderar att leda till komplikationer inklusive hjärt- och kärlsjukdomar, typ 2-diabetes och cancer 2-4. Därför behandlar fetma är en viktig prioritering. Fetma manifesteras genom massiv expansion av fettvävnad, och tillskrivs överdriven konsumtion mat och en stillasittande livsstil i det moderna samhället. Därför dechiffrera transkriptionsreglering av adipogenes och lipogenes kunde hålla lovar att behandla fetma eller diabetes 5.
3T3-L1, 3T3-F442A och andra mus adipogena cellinjer har använts för att studera adipogenes eller lipogenes under fettvävnad utveckling. Det finns dock vissa skillnader i regleringsmekanismer mellan cellinjer in vitro och djur in vivo 6. Primära adipos-Derived stamceller (ADSC) i stromala-kärlcellfraktionen kan isoleras direkt från vita fettvävnad och induceras att differentiera. Differentiering av ADSC i adipocyter troligen rekapitulerar processen för adipogenes och lipogenes i fettvävnad utveckling in vivo 7.
Grisar är en lämplig djurmodell för att studera adipogenes och lipogenes i fettvävnad utveckling. Våra tidigare porcina studier 8-10 demonstrerar att uttryck av sterol regulatoriskt element-bindande transkriptionsfaktor 1c (SREBP1c), en viktig transkriptionsfaktor känd för att modulera transkription av lipogen fettsyrasyntas, inhiberas av fleromättade fettsyror (PUFA) i svinlever och fettvävnad. Uttrycket av porcint SREBP1c minskade med PUFA in vivo och in vitro liknar andra arter såsom människor och möss 11-13. Dessa gris studier in vitro är främst i differentiated adipocyter härledda från svin-ADSC (pADSC). Därför kan användas här primär cellkultur pADSC för att tjäna som en pålitlig cellulärt system för att studera fettvävnad utveckling eller andra stamcellstillämpningar.
Här presenterar vi ett pålitligt cellulärt system för att studera fettvävnad utveckling i primärcellkultur pADSC. Jämfört med andra odödliggjorda cellinjer, ger denna metod ett bekvämt sätt för att isolera stora mängder av högkvalitativa vuxna mesenkymala stamceller som kan tillämpas för att studera differentieringsprocesser av adipocyter eller andra mesenkymala härstamningar relaterade till djurutveckling in vivo. Det kritiska modifierade steg i detta protokoll är att vi härleda pADSC använder en 7- till 9 dagar gamla spädgris eftersom det är lätt att hantera den lilla griskulting jämfört med äldre grisar och liknar andra arter 19,20, utbytet och multipotens av pADSC minskar när gris åldrar 21.
Potentiella stamcellskällor inkluderar embryonala stamceller (ESC), inducerade pluripotenta stamceller (IPSC) och postnatal adulta stamceller. Begränsningen av ADSC, klassificeras som vuxna multipotenta stamceller, är att multipotens av adulta stamcelleratt skilja olika linjer är relativt begränsad jämfört med ESC eller iPSC. Men etiska frågor om härledning av ESC och onkogena egenskaper iPSC hindra tillämpningen av ESC och iPSC 22,23. Därför har många forskare fokuserat på vuxna stamceller med insatser för att öka pluripotens. Den vanligaste källan av vuxna mesenkymala stamceller (MSC), som länge har studerats, är benmärgshärledda mesenkymala stamceller 24. Dock är skörde benmärg betraktas som en relativt smärtsam procedur. Ett annat bekymmer är att utbytet av stamceller från benmärgen är ändlig. Benmärgsaspirat ge ett genomsnitt på 6 x 10 6 kärnförsedda celler per ml, och MSC endast representerar 0,001-0,01% av alla de kärnförsedda cellerna. Efter att ha beaktat dessa nackdelar är ADSC föreslagits som en mindre påträngande källa för att få multi stamceller 25,26.
Begränsningar av användningen av ADSC i regenerativ medicin är beroende till stor utsträckning på cellutbyte och kvalitet. Därför är betydelsen av att använda grisar för att isolera ADSC i detta protokoll för att ge en stor mängd högkvalitativa adulta stamceller. Grisen är en användbar djurmodell som representerar människor på grund av den jämförbara organstorlek och många fysiologiska och biokemiska likheter mellan arterna 27-30. Förvärva hADSC från kommersiella företag är dyrt och i många fall cellerna har manipulerats, passerats eller frysförvarade. Förvärva humana kliniska prover är relativt svårt på grund av etiska frågor och produktion av ADSC är begränsad. Vi härleda cirka 6 x 10 5 hADSC per g fett efter kollagenas matsmältningen. Med 100 g kvinnliga bröst fettvävnad (i genomsnitt provtagning), kan totalt 6 x 10 7 celler skördas. Använda en enskild mus, är avkastningen ännu mer begränsad. Totalt 1 x 10 6 celler kan skördas från 0,4 g subkutan mus inguinal fettvävnad från båda benen av en vuxen FVB mus (6-8 veckor gamla). Men i en individuell pig (7 till 9 dagar gamla), totalt 2 x 10 8 celler lätt kan skördas från 60 g av subkutan fettvävnad erhållen från den dorsala fettdepån. Den pADSC härleds i detta protokoll har full mesenkymala-typ multipotens och lämpliga mesenkymala stamceller markörer. Därför pADSC är en gynnsam källa för att erhålla stora kvantiteter av vuxna stamceller utan att kompromissa med stamcells kvalitet.
Tillämpningen av pADSC är inte begränsad till att dechiffrera adipocytdifferentiering inklusive adipogenes och lipogenes. Nyligen har ADSC blivit en populär källa för stamceller inom området regenerativ medicin 22,31,32. Jämfört med andra stamcellskällor, ADSC behålla en unik fördel av att vara lättillgängligt och riklig och deras robusta multipotens har visat sig vara en lovande källa för stamcellsterapi och vävnads engineering 22,33,34. Det enkla tillgängligheten av fettvävnad gör ADSC en av de minst påträngande sätt att få multi stamceller. Nyligen, differentierade vi pADSC till glukoskänsliga insulin-utsöndrande kluster, vilket indikerar att pADSC inte är begränsade till mesenkymala differentiering (opublicerade data). Andra har också visats att ADSC kan differentieras till många celltyper härledda från andra groddblad såsom endodermala hepatocyter (från hADSC 35 eller pADSC 36) eller ektodermala neuroner (från hADSC 37 eller pADSC 38). Således pADSC kan användas för hög genomströmning läkemedel eller biomaterial screening genom att rikta celler till olika differentieringsprocesser för att ge önskade linjerna. Därför pADSC härrör i detta protokoll har potentiell tillämpning i stamcellsterapi och vävnadstransplantation för regenerativ medicin forskning.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill uttrycka tacksamhet till alla lab medlemmar för omfattande diskussion och teknik stöder i detta protokoll. Forskning som utförs i labbet har finansierats med bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (MOST 103-2314-B-002-126 och MEST 102-2313-B-002-026-My3) och med bidrag från sikta mot toppen University planen (104R350144) av National University, Taiwan.
Reagents | |||
Collagenase, Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-040 | |
DMEM/F-12, HEPES | Life Technologies | 11330-032 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-001-1 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B (P/S/A) solution | Biological Industries | 03-033-1 | For antibiotics and antimycotic usage |
αMEM, no nucleosides | Life Technologies | 12561-049 | |
ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Life Technologies | 25200072 | |
CD4a-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700063 | |
CD29-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700398 | |
CD31-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700467 | |
CD44-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700183 | |
CD45-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700483 | |
CD90-PE | Sigma-Aldrich | SAB4700686 | |
HLA Class I-PE (MHC I) | Sigma-Aldrich | SAB4700640 | |
HLA-DR-PE (MHC II) | Sigma-Aldrich | SAB4700662 | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | |
3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Rosiglitazone | Cayman | 71740 | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
2-Phospho-L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 49752 | |
TGFB1 Recombinant Human Protein | R&D Systems | 240-B-002 | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Carbon Steel Blades | Thomas Scientific | 6727C18 | |
Falcon 100 µm cell strainer | Corning | 352360 | |
Falcon 6-well plate | Corning | 353046 | |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 |