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Medicine

腔内药物输送到鼠标动静脉瘘内皮

Published: March 4, 2016 doi: 10.3791/53905

Abstract

治疗剂的递送,以提高动静脉瘘(AVF)成熟可以通过腔内或外部途径给药。简单的鼠AVF模型用的药物溶液至静脉内皮同时作为瘘创建腔内施用相结合。这个模型的技术问题进行了讨论。在全身麻醉下腹部切口由和主动脉和下腔静脉(IVC)被曝光。在肾下主动脉和下腔静脉解剖夹紧。近端和远端夹紧后,穿刺部位进行曝光,将25g针头被用来穿刺主动脉并进入下腔静脉两壁。穿刺后,立即报告基因表达的病毒载体在IVC通过相同的针注入,随后温育15分钟。相比由外部给药途径腔内给药方法使能更健壮的病毒基因递送到静脉内皮。这诺夫递送l的方法将有利于研究,探索在AVF成熟内皮的作用,并能在外科手术的时间腔内给药。

Introduction

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鼠aortovenous瘘(AVF)的主动脉和下腔静脉(IVC)之间穿刺模型现在是一个既定的技术。1在该模型中,红外肾主动脉的两壁与地下25针被刺破,退出进毗邻肾下腔静脉;前主动脉入口孔被修复以简单的压缩,并且不需要缝合修复。串行随访检查采用高分辨率多普勒超声和病理分析表明,AVF有一个成熟阶段,再一个失败的阶段,扼要重述人类AVF的已知病理生理学2

探索了调节AVF成熟机制,需要用于输送治疗剂来熟化AVF内皮改进的方法。治疗剂递送至血管可以是通过血管内递送至内腔,或通过外部传递到外膜。外部递送的一个实例是玉米常用的聚醚凝胶的外膜应用。当加热到体温这种共聚物是热可逆的,并从液体到固体凝胶转化。当在体内局部施用药物在普卢兰尼克凝胶混合5,6-实现先前的研究已经表明持续的药物递送。3,4-病毒载体或siRNA与的Pluronic凝胶的外膜应用已报道是有效的血管周围递送系统,我们有还报告说,治疗由肽刺激外膜人外植隐静脉的导致内皮细胞受体蛋白的磷酸化。7

在另一方面,调查也同时使用病毒和非病毒载体腔内交付8-10犬和兔11,12车型静脉移植的。在这些报告中,静脉收获后进行基因转移体外 。伊斯拉米报道的血管内的病毒基因递送y以颈动脉原位脉,而无需创建一个旁路13 Gloverman等。在大鼠股动脉,腹壁浅静脉瘘裸DNA的报道腔内和外膜交付14梅奥组报道在小鼠颈总动脉,颈内静脉瘘外膜的药物输送15,16然而,这些先前报告的模型需要缝合吻合创造在AVF。在这份报告中,腔内给药并同时创造AVF在小鼠中的描述,使用AVF创作的缝合线少的模型。通过使用本变形鼠AVF模型可以执行用于腔内药物输送到瘘管的静脉肢的简单方法。

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Protocol

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获得批准相应的机构动物护理和使用委员会。

1.麻醉和手术前的程序

  1. 麻醉雄性C57BL / 6冰,8周龄,用汽化3%异氟醚和0.8升/分钟的氧气给予到丙烯酸感应腔室。
  2. 确认缺乏反应脚趾捏足够的麻醉。通过连续吸入3%异氟烷 - 定位在动作表鼠标仰卧和定位硅氧烷掩模递送汽化2。
  3. 腹部用化学脱毛霜去除颈部腹侧头发更低。
  4. 之前AVF手术进行多普勒超声检查在感兴趣的领域,以记录动脉和静脉流动和血管直径的基线特征。1,2
  5. 附加1ml注射器向地下25针和与所需药物加载注射器。弯针60度角约4从需要毫米乐一角。抓住一个弯针架在地下25针。

2.手术过程

  1. 准备切口部位有局部消毒剂和应用手术单。使用无菌手套和工具,以在整个手术保持无菌操作。
  2. 使一个中线腹部切口用解剖刀从下肝脏边缘水平延伸到刚好耻骨之上。
  3. 插入的牵开器以及从向右侧腹腔剔骨所有肠子。裹肠纱布用盐水浸湿。解剖连接复古腹膜和较低的结肠获得主动脉和下腔静脉的全视角膜。
  4. 从周围组织解剖肾下主动脉和下腔静脉,对近端和远端夹紧准备。
  5. 放置在这两个近端主动脉和在刚刚左肾静脉水平以下近端IVC单个显微剪辑。将第二显微剪辑跨两个为Distal主动脉和远侧IVC。
  6. 把握结缔组织围绕主动脉和内侧旋转,使得主动脉的背表面稍微露出的动脉穿刺,如先前所述。1
  7. 很快暴露穿刺部位。穿刺部位将在血管,从左肾静脉到主动脉分叉的距离的大约四分之三的尾方面。保持主动脉在一个旋转位置用左手,解剖主动脉的左侧缘,以便有充足的曝光,以允许用右手穿刺。要小心,不要主动脉和下腔静脉之间的解剖。
  8. 保持在一个旋转位置的主动脉,并使用地下25针带有附加1ml注射器含有药物溶液通过刺穿主动脉进入下腔静脉。 ( 图1A)
  9. 注入药液 - 利用左手(100 200微升)。针可以通过扩张和薄可见下腔静脉壁当透明药液置换静脉血出下腔静脉( 图1B,C)的。保持静止并保持在适当的位置的针15分钟。
  10. 移除远侧显微剪辑脱夹具仅远端主动脉和远侧IVC。
  11. 取出针再涂向上拉相邻复古腹膜组织主动脉的穿刺部位。
  12. 取出近端显微剪辑去夹紧近端主动脉和近端IVC。在去夹紧,动脉血观察流入下腔静脉,而不是深静脉血流。保持覆盖所述穿刺孔进行1分钟。
  13. 止血确认通过观察30秒,而没有压缩后,返回肠子到其自然的位置,并根据您批准的动物协议的连续缝合关闭的腹部。

3.手术后的程序

  1. 腹部闭合后,停止ANESThesia。应用术后护理包括镇痛和伤口护理按照机构动物护理和使用委员会建议的说明。镇痛我们使用丁丙诺啡在0.1毫克/千克intrasmuscularly以下的外科手术24小时,每12小时。
  2. 在手术后的第一天,进行多普勒超声检查,以确认AVF通畅。此外,衡量其他船只和串行流量特性,比较从术前基线值的变化。1,2

图1
图1(a)执行照片AVF手术中显示管腔内交货。夹紧近端和远端主动脉,以及通过施加显微剪辑IVC。利用地下25针含附加注射器药液通过穿刺进入主动脉下腔静脉。(B)几点措施她电源图像输液前刺破下腔静脉(放大4倍)。针尖通过深色静脉血遮蔽。黄色箭头表示输液后刺破下腔静脉的墙到墙直径IVC。(C)更高的功率图(放大4倍)的。针尖(黑色箭头),可通过轻轻扩张和薄墙下腔静脉(黄色箭头)作为透明药材溶液中可以看出置换静脉血。

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Representative Results

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在一系列33小鼠,在第一术后天存活率为97.0%; AVF通畅,如通过超声波来确定,为84.9%。

与传统的外部路由本血管内输送路线的基因转导效率进行比较。对于管腔内输送(ILD),在穿刺后,立即加入200μl腺病毒的GFP(广告-GFP)载体溶液(1×10 9 PFU / ml)的经穿刺针注入IVC,随后孵育15分钟时间。对照组小鼠用聚醚凝胶收到的Ad-GFP(1×10 9 PFU /毫升)下腔静脉的外膜交付(AD)。样品在暴露于腺病毒载体24小时后取出的。从用荧光显微镜,以及组织学检查内膜节用抗GFP进行了评估由烯面观察在IVC壁GFP和瘘管的表达抗体。

烯面观察显示在24小时( 图2A)中的ILD治疗的小鼠与AD相比,下腔静脉壁的GFP表达更强,与周围的瘘特性增强。 GFP表达在两组永久在转染后72小时(数据未显示)。抗GFP抗体组织学分析,下腔静脉与ILD治疗的小鼠与AD相比,内膜显示更强大和特定地点的GFP表达。 ( 图2B)。为了证实这些结果,通过AD或ILD腺病毒-GFP治疗肾下IVCS而收获的印迹。仅ILD后的GFP蛋白质表达是足够的检测,在转染后24小时,这表明通过腔内路线优越病毒药物输送到下腔静脉壁。

图2
图2.交货腺病毒GFP到AVF流明增强GFP表达。 (A)代表免疫表现在连接接收外膜交货(上)或腔内交付(底部)应用腺病毒GFP小鼠AVF内皮(24小时)的正视图。条表示25微米。(B)示出在接收由外膜输送(顶部)或管腔内输送(底部)施加腺-GFP小鼠AVF内皮(24小时)的部分代表性免疫荧光。 *表示下腔静脉管腔;条表示25微米。通过外膜或腔内航线应用于显示GFP在AVF腺病毒-GFP处理的检测(C)代表印迹。

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Discussion

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鼠AVF模型的这种修改包含在AVF创建时腔内药物递送到静脉内皮。一个AVF通过穿刺用地下25针的红外肾主动脉和延伸穿过相对的主动脉壁进入下腔静脉穿刺,随后的药物溶液注射通过同一针创建。该解决方案是维持内静脉, ,在AVF的静脉肢体,直到去夹紧。什么区别于其他鼠类AVF模型17-19这种模式是缺乏缝合或胶水可能导致管腔狭窄,急性血栓形成,并与分子分析可能的干扰。使用该刺穿主动脉同一针和IVC创建AVF也药物递送到AVF管腔的能力允许以最小的容器操纵简单递送。

有一些关键步骤和点提高该过程的成功率和一致性。公关主动脉腔静脉和oximal夹具被放置在左肾静脉下方。如果有在帧内肾IVC的上部大腰静脉,然后将这些容器下夹紧站点的修改建议通过从腰静脉逆行回到出血,以允许无需稀释药物的有效培养。主动脉腔静脉和远侧夹具被放置在髂分叉的水平,以免可能与远侧主动脉和下腔静脉的穿刺干扰。保持与弯曲缝合针夹持器的地下25针使容器穿刺期间针的最佳方向。止血是通过覆盖与相邻的复古腹膜动脉入孔来实现的。特别注意的是,以提供小心压缩,同时避免AVF闭塞和血栓形成如先前所述。1

基因转移技术的发展提供了在分子水平上,以修改手术效果的潜力。报告描述traluminal基因递送到静脉主要集中在静脉移植失败的有针对性的治疗。相比之下,这种模式允许药物输送的AVF成熟的调制。这种模式的优点包括利用小鼠模型,允许不同的鼠标遗传品系的审查。此外,15分钟腔内照射协议是很容易转移到临床手术中的设置,并可能有助于评估围手术期干预措施,防止JUXTA,吻合口狭窄,人AVF手术一般复杂。从这些初步的结果,我们表明,该方法比传统的外部路由的内皮细胞中产生更多的位点特异性基因表达。

这项研究的潜在限制是对下腔静脉扩张可变压力的作用。下腔静脉段的隔离并不在此小鼠模型中, ,侧分支(腰静脉)未结扎完美。因此,很难精确地MAINT艾因孵化过程中扩张的压力水平一致。虽然IVC轻轻手动输液胀得,胀痛较高的压力可能会导致内膜增生20,21和直接平滑肌细胞受损,11导致干扰分析。它也很难完全定量药物递送的效率,因为一些药物可以输送期间通过腰静脉丢失,以及后穿过近侧IVC夹具去除和潜在通过AVF进入主动脉。最后,该方法允许一些药物的钳除去后全身被释放;药物和站点可能防范系统性释放潮红,但药物洗脱程度的量化的撤离将需要得到证实。

总之,本技术修饰鼠AVF模型较为简单,重现性和使得能够靶向内皮药物递送到小鼠AVF。在腔内jection在AVF创建时在技术上是可行的,相比外膜递送可以成功地改善内皮病毒基因表达。此AVF的药物递送模式将不仅对调节静脉AVF肢成熟的机制解剖的有益形式,同时也为AVF成熟治疗性调节。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G Used as 30% solution in d-water
GFP antibody NOVUS BIOLOGICALS INC NB100-1770
Ad-CMV-GFP VECTOR BIOLABS 1060
0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP Baxter 2F7122
BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 BD 305122
BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip BD 309659
Scalpel Surgical Design Inc 22079707
6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting ETHICON INC 697G
Vevo 770 ultrasound machine  Visualsonics  20 - 60 Mhz scan head; RMV-704
Vascular clamp  Roboz Surgical Instrument Co. RS-5424
Clamp applying forceps  Roboz Surgical Instrument Co. RS-5410

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References

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Hashimoto, T., Yamamoto, K., Foster, T., Bai, H., Shigematsu, K., Dardik, A. Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium. J. Vis. Exp. (109), e53905, doi:10.3791/53905 (2016).More

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