Abstract
動静脈瘻を強化する治療薬の送達（AVF）成熟のいずれか腔内または外部の経路を介して投与することができます。簡単なマウスAVFモデルは、瘻の作成と同時に静脈内皮への薬液の管腔内投与と組み合わせました。このモデルの技術的な側面が議論されています。全身麻酔下で、腹部切開が行われ、大動脈と下大静脈（IVC）が露出しています。赤外線腎大動脈とIVCをクランプするために解剖されています。近位および遠位のクランプ後、穿刺部位が露出され、25 G針を大動脈およびIVCに両方の壁を穿刺するために使用されます。すぐに穿刺した後、レポーター遺伝子を発現するウイルスベクターは、インキュベーションの15分間、続いて、同じ針を介しIVCに注入しました。腔内投与方法は、外部の経路による投与に比べて静脈内皮へのより強固なウイルス遺伝子送達を可能にしました。このノーブ配信lの方法は、AVFの成熟における内皮の役割を探求し、手術時の管腔内薬物送達を可能にする研究を促進します。
Introduction
大動脈と下大静脈（IVC）の間ネズミaortovenous瘻（AVF）穿刺モデルが確立された技術である。このモデルでは1、赤外線腎大動脈の両方の壁がに出た、25 G針で穿刺されています赤外線腎大静脈に隣接します。前方大動脈エントランスホールは、単純な圧縮で修復され、縫合糸の修理を必要としません。高解像度のドップラー超音波および組織学的分析によりシリアルフォローアップ検査は、AVFは人間のAVFの既知の病態生理を反復する、成熟期、その後、失敗の位相を持つように示している。2
AVFの成熟を調節する機構を調査するために、成熟AVF内皮への治療剤の送達のための改良された方法が必要とされています。血管への治療薬の送達は、内腔への血管内送達を介して、または外膜の外部の送達を介してのいずれかであることができます。外部配信の一例は、comのですmonlyプルロニックゲルの外膜のアプリケーションを使用していました。この共重合体は、熱可逆性であり、体温に暖めたとき、固体ゲルを液体から変換されました。以前の研究は、プルロニックゲルで混合し、薬剤がインビボで局所的に適用されたときに持続的薬物送達が達成される。プルロニックゲルを有するウイルスベクターまたはsiRNAの3,4-外膜アプリケーションは血管周囲送達システムとして有効であることが報告されている示されている。5,6我々また、ペプチドによる外膜の刺激による外植人間の伏在静脈の治療は、内皮受容体タンパク質のリン酸化をもたらしたことを報告している。7
一方、研究者らはまた、静脈グラフトの8月10日 、イヌおよびウサギ11,12モデルにおけるウイルスおよび非ウイルスベクターの両方の管腔内配信を使用しています。これらの報告では、遺伝子導入は、静脈収穫後ex vivoで実施しました。 Eslami らは、血管内のウイルス遺伝子が提供する報告しましたyはバイパスを作成せずにその場で静脈を頸動脈にする。13 Glovermanら。ラット大腿動脈、浅腹壁静脈瘻における裸のDNAの管腔内および外膜の配信を報告した。14メイヨー・グループは、マウス頸動脈-頚静脈瘻における外膜の薬物送達を報告した。15,16しかし、これらの以前に報告されたモデルが作成する縫合吻合を必要とAVF。この報告書では、マウスでの同時AVFの作成と管腔内薬物送達は、AVF作成の縫合レスモデルを用いて、記載されています。この修正されたマウスAVFモデルを用いて瘻孔の静脈血肢に管腔内薬物送達のための簡単な方法を行うことができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
適切な制度的動物実験委員会の承認が得られます。
1.麻酔と手術前の手順
- 気化した3％のイソフルラン及びアクリル誘導チャンバ内に投与0.8リットル/分の酸素と雄のC57BL / 6氷、8週齢を、麻酔。
- つま先のピンチに反応の欠如によって、十分な麻酔を確認してください。位置操作テーブル上でマウスを仰臥位と気化2配信するためにシリコーンマスクを配置 - 連続吸入により3％のイソフルランを。
- 化学脱毛クリームを使用して、腹部下に首から腹の毛を削除します。
- 関心のある分野で動脈および静脈の流れと血管径のベースライン特性を記録する前にAVF手術にドップラー超音波検査を行う。1,2
- 25 G針に1mlシリンジを取り付け、所望の薬物と注射器をロードします。ベンド必要性から60度の角度に針が約4ミリメートルル先端。湾曲した針ホルダと25 G針をつかみます。
2.手術の手順
- 局所消毒で切開部位を準備し、外科用ドレープを適用します。手術を通して無菌技術を維持するために、滅菌手袋や楽器を使用してください。
- メスはちょうど恥骨の上に下肝縁のレベルから延びるとともに腹部正中切開を行います。
- 開創器を挿入し、右側に向けて腹腔からすべての腸を骨抜き。生理食塩水に浸したガーゼで腸ラップ。大動脈とIVCの完全なビューを得るために、レトロ腹膜および下部結腸を結ぶ膜を解剖。
- 近位および遠位のクランプの準備を、周囲の組織からの赤外線腎大動脈とIVCを解剖。
- 近位大動脈とちょうど左腎静脈下のレベルでの近位IVCの両方にまたがる単一マイクロサークリップを配置します。 Dの両方を横切って第二のマイクロサークリップを配置しますistal大動脈および遠位IVC。
- 前述したように、大動脈の周囲の結合組織をつかみ、大動脈の背側表面はやや動脈穿刺のた めに露出されるように内側に回転させます。1
- 速やかに穿刺部位を露出させます。穿刺部位は、血管、大動脈分岐に左腎静脈からの距離の約四分の三の尾側の側面になります。右手で穿刺を可能にするために十分な曝露があるように左手で回転した位置に大動脈を維持する、大動脈の左横の余白を分析。大動脈とIVCの間で解剖しないように注意してください。
- 回転位置に大動脈を維持し、薬液を含む添付1mlシリンジで25 G針を使用して、IVCへを通して大動脈を穿刺。 （ 図1A）
- 左手を使用して - （200μlの100）薬液を注入。針は拡張と薄いを通して見ることができます透明な薬液がIVC（ 図1B、C）のうち、静脈血を変位IVC壁。まだ残っていると15分の位置に針を維持します。
- 唯一の遠位大動脈および遠位IVCをクランプを解除するために、遠位顕微クリップを削除します。
- 針を外し、隣接するレトロ腹膜組織を引き上げて、大動脈の穿刺部位をカバーしています。
- 近位大動脈および近位IVCを解除クランプする近位顕微クリップを削除します。非クランプ時に、動脈血の代わりに暗い静脈血流のIVCに流入観察されます。 1分間の穿刺孔を覆って保管してください。
- 圧縮せずに30秒間観察による止血を確認した後、彼らの自然な位置に腸を戻って承認された動物プロトコルに従って実行されている縫合糸で腹部を閉じます。
3.術後の手順
- 腹部の閉鎖後、ANESTを中止hesia。施設内動物管理使用委員会が推奨する指示に従い、鎮痛および創傷ケアなどの術後ケアを適用します。鎮痛のために我々は/ kgをintrasmuscularly 24時間ごとに12時間は、手術の手順に従って0.1ミリグラムでブプレノルフィンを使用します。
- 操作後の最初の日に、AVFの開通性を確認するために、ドップラー超音波検査を行います。また、直列に他の容器と流動特性を測定し、手術前のベースライン値からの変化を比較します。1,2
AVF手術中に管内送出を表示図1（A）手術写真。顕微クリップを適用することにより、近位および遠位大動脈と同様に、IVCをクランプします。取り付けられたシリンジを含む薬液25 G針を用いてIVCにを通じて大動脈を穿刺（B）HIGを注入前のパンクIVCの彼女のパワーピクチャー（4X倍率）。針の先端は暗色の静脈血によって隠されています。黄色の矢印が注入後のパンクIVCのIVC。（C）Aより高い電力ピクチャー（4X倍率）の壁から壁の直径を表します。針先（黒矢印）静脈血を変位透明な薬液として穏やかに膨張及び薄いIVC壁（黄色矢印）を介して見ることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
33匹のマウスのシリーズでは、最初の術後日目の生存率は97.0％でした。 AVFの開通性は、超音波によって決定されるように、84.9％でした。
従来の外部ルートと、この血管内送達経路の遺伝子導入効率を比較しました。管腔内配信（ILD）の場合は、すぐに穿刺した後、アデノウイルス-GFP（AD-GFP）ベクター溶液（1×10 9 PFU / ml）を200μlの15分間のインキュベーション時間に続いて、穿刺針を介しIVCに注入しました。対照マウスには、プルロニックゲルを用いたIVCへのAd-GFP（1×10 9 PFU / ml）を外膜デリバリー（AD）を受けました。標本は、アデノウイルスベクターへの曝露後24時間で、外植しました。 IVC壁でのGFPの発現と瘻孔を蛍光顕微鏡で内膜からエン顔観察により評価しただけでなく、抗GFPを使用してセクションの組織学的検査抗体。
顔観察専用24時間（ 図2A）で瘻孔付近に特徴的な増強で、ADと比較しILDで処置したマウスにおけるIVC壁にGFPの強い発現を示しました。 GFP発現は、トランスフェクション後72時間で、両群において持続的であった（データは示さず）。抗GFP抗体を用いた組織学的分析は、ADと比較ILDで処置したマウスにおけるIVCの内膜で、より堅牢で、部位特異的GFP発現を示しました。 （ 図2B）。これらの結果を確認するために、ADまたはILDによってアデノウイルス-GFPで処理された赤外線腎IVCSは、ウェスタンブロットのために回収しました。 GFPタンパク質の発現は、トランスフェクション後24時間で、管腔内経路を介してIVC壁に優れたウイルスの薬物送達を示唆し、唯一のILD後の検出のために十分でした。
AVFルーメンへのアデノウイルス-GFPの図2.配信は、GFPの発現を増強します。 （A）外膜の配信（上）によって、あるいは腔内配信（下）によって適用されたアデノウイルス-GFPを受けたマウスにおけるAVF内皮（24時間）の顔ビューアン代表的免疫蛍光示します。バーは25μmで示している。外膜の配達（上）によって、あるいは腔内配信（下）によって適用されたアデノウイルス-GFPを受けたマウスにおけるAVF内皮（24時間）のセクションを示す（B）代表免疫蛍光。 * IVCの内腔を示し、バーは25μmで示している。アデノウイルス-GFPで処理されたAVFにおけるGFPの検出を示す（C）代表ウエスタンブロットは、外膜または腔内経路を介して適用しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ネズミAVFモデルのこの変更は、AVFの作成時に静脈内皮への管腔内薬物送達を内蔵しています。 AVFは25 G針で赤外線腎動脈を穿刺し、同じ針を介して薬液の注入に続いてIVCへの反対大動脈壁を通って穿刺を拡張することによって作成されました。解決策は、イントラ大静脈維持されている、すなわち 。、AVFの静脈手足に、デクランプまで。何17-19他のネズミAVFモデルからこのモデルを区別することは、狭窄、急性血栓症、および分子解析で可能な干渉を引き起こす可能性が縫合糸または接着剤の欠如です。また、AVFの内腔に薬物を送達するためにAVFを作成するために、同じ大動脈を穿刺針とIVCを使用する能力は、最小限の血管操作と簡単な送達を可能にします。
手順の成功率と一貫性を向上させるためにいくつかの重要なステップとポイントがあります。広報IVC大動脈およびoximalクランプ、左腎静脈の下に配置されています。大腰椎静脈が赤外線腎IVCの上部に存在する場合、これらの血管以下にクランプサイトの変更は、腰椎静脈からの後方出血逆行によって希釈することなく、薬剤の効率的なインキュベーションを可能にすることをお勧めします。それは、遠位大動脈とIVCの針穿刺を妨害する可能性がないように大動脈と下大静脈の遠位クランプは、腸骨分岐のレベルに配置されています。湾曲した針ホルダと25 G針を保持することは、血管穿刺時の針の最適な方向を可能にします。止血は、隣接するレトロ腹膜と動脈入口穴を被覆することによって達成されます。特別な注意が前述したようにAVF閉塞および血栓症を回避しながら慎重に圧縮を提供するために支払われます。1
遺伝子導入技術の開発は、分子レベルでの手術成績を変更する可能性を提供しています。で記述したレポート静脈へtraluminal遺伝子送達は、主に静脈グラフト不全の標的治療に焦点を当てています。対照的に、このモデルは、AVFの成熟を調節するための薬物送達を可能にします。このモデルの利点は、マウスの遺伝系統を変えるの検査を可能にするマウスモデルの使用を含みます。加えて、15分間の管腔内照射プロトコルは、臨床術中の設定に簡単に転送可能であり、一般に人間のAVF手術を複雑傍吻合部狭窄を防ぐために、周囲の手続きの介入を評価するに役立つことがあります。これらの初期の結果から、我々は、この方法は、従来の外部ルートに比べて内皮細胞内の複数の部位特異的な遺伝子発現をもたらすことを示しています。
この研究の潜在的な制限は、IVC上の可変膨張圧力の影響です。 IVCのセグメントの単離は、このマウスモデル、 すなわち 、側枝（腰椎静脈）がライゲーションされていなかったで完璧ではありません。したがって、正確のmaintすることは困難ですインキュベーション中の膨満圧の一貫したレベルをAINの。 IVCを穏やかに手動注入によって膨張しているが、高い膨らませる圧力は11が分析における干渉につながる、新生内膜過形成20,21と直接平滑筋細胞の損傷を引き起こす可能性があります。いくつかの薬剤が大動脈に近位IVCを通して、潜在的にAVFを通じて腰椎静脈を介して、同様にクランプを除去した後に配信中に失われることがありますように、完全に薬物送達の効率を定量化することも困難です。最後に、この方法は、薬物の一部は、クランプを除去した後に全身放出されることを可能にします。サイトの薬物およびフラッシングの避難は、全身放出を防止するかもしれないが、薬物ウォッシュアウトの程度の定量化を確認する必要があります。
結論として、マウスAVFモデルにこの技術的な修正は比較的単純かつ再現性があり、マウスAVFにターゲットを絞った内皮の薬物送達を可能にします。内腔内AVFの作成時のジェクションは技術的に可能であり、正常に外膜の配達に比べ内皮におけるウイルス遺伝子発現を向上させることができます。このAVF-薬物送達モデルは、静脈AVF肢成熟を制御する機構の解剖のためだけでなく、AVF成熟の治療的調節のためだけでなく、有用なモダリティとなります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | Used as 30% solution in d-water |
| GFP antibody | NOVUS BIOLOGICALS INC | NB100-1770 | |
| Ad-CMV-GFP | VECTOR BIOLABS | 1060 | |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | 2F7122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | BD | 305122 | |
| BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | |
| Scalpel | Surgical Design Inc | 22079707 | |
| 6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting | ETHICON INC | 697G | |
| Vevo 770 ultrasound machine | Visualsonics | 20 - 60 Mhz scan head; RMV-704 | |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5424 | |
| Clamp applying forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 |
References
- Yamamoto, K., Li, X., Shu, C., Miyata, T., Dardik, A. Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula. J. Vis. Exp. (77), e50449 (2013).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. Am. J. Physiol.: Heart Circ. Physiol. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
- Escobar-Chávez, J. J., Lòpez-Cervantes, M., Naïk, A., Kalia, Y. N., Quintanar-Guerrero, D., Ganem-Quintanar, A. Applications of thermo-reversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations. J. Pharm. Pharm. Sci. 9 (3), 339-358 (2006).
- Almeida, H., Amaral, M. H., Lobão, P., Lobo, J. M. S. Pluronic® F-127 and Pluronic Lecithin Organogel (PLO): main features and their applications in topical and transdermal administration of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 15 (4), 592-605 (2012).
- Karper, J. C., et al. Toll-like receptor 4 is involved in human and mouse vein graft remodeling, and local gene silencing reduces vein graft disease in hypercholesterolemic APOE*3Leiden mice. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 31 (5), 1033-1040 (2011).
- Redmond, E. M., Hamm, K., Cullen, J. P., Hatch, E., Cahill, P. A., Morrow, D. Inhibition of patched-1 prevents injury-induced neointimal hyperplasia. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 33 (8), 1960-1964 (2013).
- Wong, D. J., et al. Ephrin type-B receptor 4 activation reduces neointimal hyperplasia in human saphenous vein in vitro. J. Vasc. Surg. , (2014).
- Matsumoto, T., et al. Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene transfer of endothelial cell nitric oxide synthase inhibits intimal hyperplasia of canine vein grafts under conditions of poor runoff. J. Vasc. Surg. 27 (1), 135-144 (1998).
- Petrofski, J. A., et al. Gene delivery to aortocoronary saphenous vein grafts in a large animal model of intimal hyperplasia. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 127 (1), 27-33 (2004).
- Hata, J. A., et al. Modulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling reduces intimal hyperplasia in aortocoronary saphenous vein grafts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 129 (6), 1405-1413 (2005).
- Ohta, S., et al. Intraluminal gene transfer of endothelial cell-nitric oxide synthase suppresses intimal hyperplasia of vein grafts in cholesterol-fed rabbit: a limited biological effect as a result of the loss of medial smooth muscle cells. Surg. 131 (6), 644-653 (2002).
- Baldwin, Z. K., et al. Modulation of vascular remodeling induced by a brief intraluminal exposure to the recombinant R7020 strain of Herpes simplex-1. J. Vasc. Surg. 41 (1), 115-121 (2005).
- Eslami, M. H., et al. Gene delivery to in situ veins: differential effects of adenovirus and adeno-associated viral vectors. J. Vasc. Surg. 31 (6), 1149-1159 (2000).
- Globerman, A. S., et al. Efficient transgene expression from naked DNA delivered into an arterio-venous fistula model for kidney dialysis. J. Gene Med. 13 (11), 611-621 (2011).
- Yang, B., et al. Adventitial transduction of lentivirus-shRNA-VEGF-A in arteriovenous fistula reduces venous stenosis formation. Kidney Int. 85 (2), 289-306 (2014).
- Brahmbhatt, A., et al. The role of Iex-1 in the pathogenesis of venous neointimal hyperplasia associated with hemodialysis arteriovenous fistula. PLoS ONE. 9 (7), e102542 (2014).
- Karram, T., et al. Induction of cardiac hypertrophy by a controlled reproducible sutureless aortocaval shunt in the mouse. J. Investig. Surg. 18 (6), 325-334 (2005).
- Perry, G. J., et al. Genetic variation in angiotensin-converting enzyme does not prevent development of cardiac hypertrophy or upregulation of angiotensin II in response to aortocaval fistula. Circ. 103 (7), 1012-1016 (2001).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. J. Surg. Res. 108 (1), 112-121 (2002).
- Alexander, J. H., et al. Efficacy and safety of edifoligide, an E2F transcription factor decoy, for prevention of vein graft failure following coronary artery bypass graft surgery: PREVENT IV: a randomized controlled trial. JAMA. 294 (19), 2446-2454 (2005).
- Khaleel, M. S., et al. High-pressure distention of the saphenous vein during preparation results in increased markers of inflammation: a potential mechanism for graft failure. Ann. thorac. surg. 93 (2), 552-558 (2012).
