Abstract
Terapötik maddelerin teslimi arteryovenöz fistül (AVF) olgunlaşması ya lümen içi ya da dış yollar ile uygulanabilir geliştirmek için. Basit bir sıçangil AVF modeli fistül oluşturulması ile aynı anda venöz endotele ilaç solüsyonu intralüminal uygulaması ile bir araya getirilmiştir. Bu modelin teknik özellikleri tartışılmıştır. Genel anestezi altında, karın kesi yapılır ve aort ve vena kava inferior (VKİ) maruz kalmaktadır. infra-böbrek aort ve IVC sıkma için disseke edilir. proksimal ve distal sıkma sonra, delinme sitesi maruz kalır ve 25 G iğne aorta ve IVC içine hem duvarları delinerek için kullanılır. Hemen delme sonra, raportör geni ifade eden viral vektörü inkübasyon 15 dakika süre ile, aynı iğne yoluyla IVC infüze edildi. intraluminal uygulama yöntemi, dış yoldan uygulamaya kıyasla venöz endotel daha sağlam viral gen teslim sağladı. bu noveTeslimat l yöntemi AVF olgunlaşma endotel rolünü araştırmak ve cerrahi operasyon sırasında intraluminal ilaç dağıtımını sağlayacak çalışmalar kolaylaştıracaktır.
Introduction
Fare aortovenous fistül (AVF) aort ve inferior vena kava (IVC) arasında delinme modeli şimdi doğru çıkan bu modelde bir tekniktir. 1, 25 G iğne ile delinir ötesi böbrek aortun her iki duvarları olduğunu infra-böbrek vena kava bitişik; Anterior aort giriş deliği basit sıkıştırma ile tamir edilir, ve dikiş onarım gerektirmez. Yüksek çözünürlüklü Doppler ultrasonografi ve histolojik analiz seri izlem muayenesi olgunlaşma evresini ve sonra başarısız faz, insan AVF bilinen patofizyolojisi yansıtan olması AVF gösterir. 2
AVF olgunlaşmasını modüle eden mekanizmaları incelemek için, olgunlaşma AVF endotele terapötik maddelerin uygulanması için geliştirilmiş yöntemlere ihtiyaç vardır. kaplara terapötik maddelerin teslimi ya endovasküler iletim yoluyla lümen veya adventisya dış iletim yoluyla olabilir. Dış teslimat bir örneği, comkip eden bacak Pluronic jel adventisya uygulama kullanılabilir. vücut sıcaklığına ısıtıldı, bu kopolimer, termo-geri ve katı jel, sıvı dönüştürülür. Pluronic jel karışık madde in vivo topik olarak uygulandığında Önceki çalışmalar göstermiştir ilaç salınımı elde edilir. Viral vektörler ya Pluronik jel siRNA'nın 3,4 Adventisyal uygulama perivasküler dağıtım sistemi olarak etkili olduğu rapor edilmiştir. 5,6 Biz Ayrıca, peptidler tarafından adventisya uyarım ile eksplante insan safen damarların tedavisi endotel reseptör protein fosforilasyonu ile sonuçlandığını rapor vardır. 7
Öte yandan, buluş sahipleri ayrıca belirtmişlerdir damar greft 8-10 köpek ve tavşan modellerinde 11,12 hem viral ve viral olmayan vektörler lümen içi teslim kullandık. Bu raporlarda, gen transferi hasat ven sonra ex vivo gerçekleştirilmiştir. Eslami ve ark., Endovasküler viral gen teslim rapory bypass yaratmadan yerinde damarları karotis için. 13 Gloverman ve ark. Sıçan femoral arter-yüzeyel epigastrik ven fistül çıplak DNA bildirdi lümen içi ve adventisyal teslim. 14 Mayo grup fare karotid arter-juguler ven fistül içinde adventisyal ilaç dağıtım bildirdi. 15,16 Ancak, bu daha önce bildirilen modeller oluşturmak için dikilmiş anastomoz gerekli AVF. Bu yazıda, farelerde aynı anda AVF oluşturulması ile lümen içi ilaç verme AVF oluşturma dikiş daha az model kullanılarak, tarif edilecektir. bu değiştirilmiş sıçangil AVF modeli kullanarak fistül venöz bacak için lümen içi ilaç verilmesi için basit bir yöntem gerçekleştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Uygun Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onay elde edilir.
1. Anestezi ve Ameliyat öncesi Prosedürleri
- akrilik indüksiyon odasına uygulanan buharlaşmış% 3 izofluran ve 0.8 L / dk oksijen ile erkek C57BL / 6 buz, yaşlı 8 hafta, uyutmak.
- ayak tutam tepki eksikliği yeterli anestezi onaylayın. Sürekli solunum yoluyla% 3 izofluran - ameliyat masasında fare yatar pozisyonda ve bir silikon maske pozisyon 2 buharlaşmış verebilen.
- kimyasal tüy dökücü krem kullanarak karın alt boyun ventral tüylerden.
- Ilgi alanları da arteriyel ve venöz akış ve damar çapının temel özelliklerini kaydetmek için önce AVF ameliyat Doppler ultrason muayenesi yapın. 1,2
- 25 G iğne bir 1 ml şırınga takın ve istenilen ilaç ile şırınga yükleyin. Viraj ihtiyaçtan 60 derecelik bir açıyla iğne yaklaşık 4 mmle ucu. kavisli iğne tutucu ile 25 G iğne kavrayın.
2. Operatif Prosedürler
- Topikal antiseptik ile kesi sitesi hazırlayın ve bir cerrahi örtü uygulayın. ameliyat boyunca aseptik teknik korumak için steril eldiven ve aletler kullanın.
- Bir neşter sadece pubis üstünde alt karaciğer kenarının seviyesinden uzanan bir orta hat karın kesi yapmak.
- retractor takın ve sağ tarafına doğru karın boşluğundan tüm bağırsakları eviscerate. serum fizyolojik ile ıslatılmış gazlı bez bağırsakları sarın. aorta ve IVC tam görünümünü elde etmek için retro periton ve alt kolon bağlantı membran teşrih.
- proksimal ve distal sıkma için hazırlanıyor, çevre dokulardan kızıl-böbrek aorta ve IVC teşrih.
- Proksimal aort ve sadece sol renal venin altında seviyesinde proksimal IVC hem genelinde tek bir mikrocerrahi klibi yerleştirin. d hem genelinde ikinci bir mikrocerrahi klip yerleştirinISTAL aort ve distal İVC.
- Aorta çevreleyen bağ dokusu kavrayın ve aort dorsal yüzeyi hafif arteriyel ponksiyon maruz böylece daha önce açıklandığı gibi, medial döndürün. 1
- Hızla Delinen bölgeyi maruz kalmaktadır. delinme sitesi damarları, aort bifürkasyon sol renal ven mesafe yaklaşık dörtte üçü kaudal olacaktır. sağ elle ponksiyon izin için yeterli maruz kalmayacak şekilde sol el ile döndürülmüş bir pozisyonda aort tutulması, aortun sol yanal marjı teşrih. aorta ve IVC arasında teşrih için dikkatli olun.
- Bir döndürülmüş pozisyonda aort korumak ve ekli 1 ml şırınga içeren ilaç solüsyonu ile 25 G iğne kullanılarak IVC içine doğru aort delinme. (Şekil 1A)
- sol elini kullanarak - (200 ul 100) ilaç çözümü demlenmeye. İğne dilate ve ince boyunca görülebilirŞeffaf ilaç solüsyon IVC (Şekil 1B, C) dışında venöz kan yerinden IVC duvar. Hala kalır ve 15 dakika boyunca bir konumda iğne korumak.
- sadece distal aorta ve distal IVC-kelepçesi de distal mikrocerrahi klibi çıkarın.
- İğneyi çıkarın ve sonra komşu retro periton dokuyu çekerek aort Delinen bölgeyi kapsamaktadır.
- proksimal aorta ve proksimal IVC de-kelepçe proksimal mikrocerrahi klibi çıkarın. de-sıkma üzerine, arter kan IVC yerine koyu venöz kan akımı akan gözlenen edilir. 1 dakika boyunca delinme delik kapsayan tutun.
- sıkıştırma olmadan 30 sn gözlem hemostaz onaylanmasından sonra, onların doğal pozisyona bağırsakları dönmek ve onaylanmış hayvan protokole göre çalışan bir sütür ile karın kapatın.
3. Post-operatif prosedürler
- Karnın kapanmasından sonra, Anest durdurmalerine. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından tavsiye edilen talimatlara uygun olarak analjezi ve yara bakımı da dahil olmak üzere post-operatif bakım uygulayın. analjezi için biz / kg intrasmuscularly 24 saat her 12 saatte cerrahi prosedürler izlenerek 0.1 mg buprenorfin kullanın.
- Ameliyattan sonra ilk gününde, AVF açıklığını onaylamak için Doppler ultrasonografi gerçekleştirin. Buna ek olarak, diğer damar ölçülmesi ve seri akış karakteristikleri ve ameliyat öncesi taban çizgisi değerlerine göre değişiklikler karşılaştırma. 1,2
AVF Cerrahi sırasında intraluminal Teslim Gösterilen Şekil 1. (A) Operatif Fotoğraf. yakın ve uzak aort, ayrıca, mikro klipleri uygulayarak IVC sıkıştırın. Ekli şırınga içeren ilaç solüsyonu ile 25 G iğne kullanılarak IVC içine doğru aort delinme. (B) higOnu Güç Resmi İnfüzyon önce Patlak IVC (4X büyütme). İğne ucu koyu renkli venöz kan altında kalmıştır. Sarı ok uçları İnfüzyon sonra Patlak IVC İVC. (C) Higher Power Resim (4X büyütme) duvar duvara çapı belirtir. İğne ucu (siyah ok) venöz kan yerinden şeffaf ilaç çözüm olarak hafifçe şişmiş ve ince İVC duvarının (sarı ok başları) aracılığıyla görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
33 farelerin bir dizi, ilk post-operatif gün hayatta kalma% 97.0 idi; ultrason ile belirlenen AVF açıklık,% 84.9 idi.
Geleneksel dış rota ile bu endovasküler teslim rotanın Gen transdüksiyon etkinliği karşılaştırıldı. Lümen içi doğum (ILD) hemen delme işlemi adenovirüs-GFP 200 ul (Ad-GFP) vektörü çözeltisi (1 x 10 9 PFU / ml) 15 dakika inkübasyon süresi ve ardından delme iğnesi ile IVC infüze edildi . Kontrol fareleri Pluronic jel kullanılarak IVC Ad-GFP (1 × 10 9 PFU / ml) adventisyal teslim (AD) aldı. Örnekler adenovirüs vektörleri maruz kaldıktan 24 saat sonra, eksplante edildi. IVC duvara GFP ve fistül ifadesi, bir anti-GFP ile bölümlerde floresan mikroskobu, hem de histolojik inceleme ile intimanın EN-yüzü gözlemle değerlendirildiantikor.
Yüz Gözlem 24 saat (Şekil 2A) fistülle çevresinde karakteristik bir büyütme ile AH ile karşılaştırıldığında ILD ile tedavi edilen farelerde IVC duvarında GFP kuvvetli ifade gösterdi En. GFP ekspresyonu transfeksiyondan 72 saat sonra, her iki grupta da kalıcı (veriler gösterilmemiştir). anti-GFP antikor ile Histolojik analiz AD ile karşılaştırıldığında ILD ile tedavi edilen farelerde IVC intimada daha sağlam ve sahaya özel GFP ekspresyonu gösterdi. (Şekil 2B). Bu sonuçları teyit etmek için, AD ya da ILD ile adenovirüs-GFP ile muamele edilmiş alt-böbrek IVCs Western blot için hasat edildi. GFP proteini ekspresyonu transfeksiyondan 24 saat sonra lümen içi yol ile IVC duvara birçok viral ilaç dağıtım işaret sadece ILD sonra tarama için yeterli idi.
AVF Lumen için Adenovirüs-GFP Şekil 2. Teslim GFP İfade artırır. (A) adventisyel doğum (üst) veya intraluminal teslim (alt) tarafından uygulanan adenovirüs-GFP alan farelerde AVF endotelde (24 saat) yüzü görünümü tr Temsilcisi immünofloresan gösteren. Bar 25 mikron belirtir. Adventisyel doğum (üst) veya intraluminal teslim (alt) tarafından uygulanan adenovirüs-GFP alan farelerde AVF endotelde (24 saat) bölümleri gösteren (B) Temsilcisi immünofloresan. * IVC lümenini gösterir; 25 bar um gösterir. adenovirüs-GFP ile tedavi AVF GFP tespiti gösteren (C) Temsilcisi Western Blot adventisya veya intraluminal yolla başvurdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
fare AVF modelinin Bu değişiklik AVF oluşturulması sırasında venöz endotel intraluminal ilaç dağıtım içermektedir. AVF 25 G iğne ile alt böbrek aort delme, aynı iğne ile ilaç çözeltisi enjekte edilerek ve ardından IVC Karşıt aort duvarı ile delik uzanan oluşturuldu. Çözelti, intra-kaval korunur yani., AVF venöz ekstremite, de-sıkma kadar. Başka hangi fare AVF modellerinde 17-19 bu modeli ayıran moleküler analizi ile darlık, akut tromboz ve olası parazitlere neden olabilir sütür veya tutkal eksikliğidir. Ayrıca AVF lümen ilaçların teslim AVF oluşturmak için aynı aort deler iğne ve IVC kullanma yeteneği en az damar manipülasyon ile basit teslimat sağlar.
prosedürün başarı oranını ve tutarlılığını artırmak için bazı kritik adımlar ve nokta vardır. PRIVC aort ve oximal kelepçe sol renal ven altına yerleştirilir. infra-böbrek IVC üst kısmında büyük lomber damarlar varsa, bu damarların altına sıkıştırma sitenin sonra değişiklik retrograd bel damarlar geri kanama ile inceltilmeden ilacın etkili inkübasyon izin önerilir. distal aort ve IVC İğne ile müdahale edebilir diye IVC aort ve distal kelepçe, iliak bifurkasyonu seviyesinde yer almaktadır. eğimli bir iğne tutucu 25 G iğne tutma kabı delme sırasında iğne uygun yönünü sağlar. Hemostaz komşu retro periton ile arteriyel giriş deliği kapsayan elde edilir. Özel dikkat daha önce açıklandığı gibi AVF tıkanıklığı ve tromboz kaçınarak dikkatli sıkıştırma sağlamak için ödenir. 1
Gen transferi teknolojisinin gelişimi moleküler düzeyde cerrahi sonuçlarını değiştirme potansiyeline sahiptir. olarak açıklayan raporlarBir damara traluminal gen teslimi esas ven greft yetmezliği hedeflenen tedavi odaklanmıştır. Bunun aksine, bu model AVF olgunlaşma modülasyonu için ilaç verme sağlar. Bu modelin avantajları fare genetik suşların çeşitli incelenmesini sağlayan bir murin modelinde kullanımını içerir. Buna ek olarak, 15 dakikalık bir lümen içi maruziyet protokolü klinik intra-operatif ayarlara kolayca devredilemez ve yaygın insan AVF cerrahisi zorlaştırmaktadır Juxta-anastomoz darlığı önlemek için peri-usul müdahaleleri değerlendirmek yardımcı olabilir. Bu ilk sonuçlardan, bu yöntem, geleneksel harici yol göre endotel olan diğer site-spesifik gen ekspresyonunu verimleri göstermektedir.
Bu çalışmanın bir potansiyel sınırlama IVC değişken şişme basıncının etkisi olduğunu. IVC segmentinde izolasyonu bu fare modelinde, yani., Yan dalları (lomber venler) lige değil de mükemmel değildir. Bu nedenle, tam olarak maint zordurinkübasyon sırasında gerilme basıncına tutarlı bir düzeyde değilim. VKİ hafifçe manuel infüzyon ile şişmiş olmasına rağmen, yüksek distending basınçları analizinde girişime lider neointimal hiperplazi 20,21 ve doğrudan düz kas hücre hasarına, 11 yol açabilir. Bazı ilaç yanı sıra aort içine AVF yoluyla potansiyel kelepçe proksimal IVC yoluyla çıkarılması ve sonrasında lomber damarlar boyunca doğum sırasında yok olabilir, tamamen, ilaç dağıtım verimliliğini ölçmek için de zordur. Son olarak, bu yöntem, sistemik kelepçe çıkarıldıktan sonra açıklanacak olan ilacın bir kısmını sağlar; ilaç ve sistemik salınımını engelleyecek sitenin kızarma, ancak ilaç arınma derecesinin ölçümü tahliyesi teyit edilmesi gerekir.
Sonuç olarak, fare AVF modeline bu teknik değişiklik nispeten basit ve tekrarlanabilir ve fare AVF endotel ilaç dağıtım hedef kılar. intraluminalAVF yaratılış sırasında jection teknik olarak mümkün ve başarılı adventisyal teslimat göre endotel viral gen ifadesini artırabilir. Bu AVF-ilaç dağıtım modeli yararlı bir venöz AVF bacak olgunlaşmasını düzenleme mekanizmaları diseksiyon için sadece yöntemi, aynı zamanda AVF olgunlaşma terapötik modülasyonu için olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | Used as 30% solution in d-water |
| GFP antibody | NOVUS BIOLOGICALS INC | NB100-1770 | |
| Ad-CMV-GFP | VECTOR BIOLABS | 1060 | |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | 2F7122 | |
| BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 | BD | 305122 | |
| BD 1 ml Syringe Tuberculin Slip Tip | BD | 309659 | |
| Scalpel | Surgical Design Inc | 22079707 | |
| 6-0 ETHILON P-1 11 mm 3/8c Reverse Cutting | ETHICON INC | 697G | |
| Vevo 770 ultrasound machine | Visualsonics | 20 - 60 Mhz scan head; RMV-704 | |
| Vascular clamp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5424 | |
| Clamp applying forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5410 |
References
- Yamamoto, K., Li, X., Shu, C., Miyata, T., Dardik, A. Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula. J. Vis. Exp. (77), e50449 (2013).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. Am. J. Physiol.: Heart Circ. Physiol. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
- Escobar-Chávez, J. J., Lòpez-Cervantes, M., Naïk, A., Kalia, Y. N., Quintanar-Guerrero, D., Ganem-Quintanar, A. Applications of thermo-reversible pluronic F-127 gels in pharmaceutical formulations. J. Pharm. Pharm. Sci. 9 (3), 339-358 (2006).
- Almeida, H., Amaral, M. H., Lobão, P., Lobo, J. M. S. Pluronic® F-127 and Pluronic Lecithin Organogel (PLO): main features and their applications in topical and transdermal administration of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 15 (4), 592-605 (2012).
- Karper, J. C., et al. Toll-like receptor 4 is involved in human and mouse vein graft remodeling, and local gene silencing reduces vein graft disease in hypercholesterolemic APOE*3Leiden mice. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 31 (5), 1033-1040 (2011).
- Redmond, E. M., Hamm, K., Cullen, J. P., Hatch, E., Cahill, P. A., Morrow, D. Inhibition of patched-1 prevents injury-induced neointimal hyperplasia. Arterioscler., Thromb., Vasc. Biol. 33 (8), 1960-1964 (2013).
- Wong, D. J., et al. Ephrin type-B receptor 4 activation reduces neointimal hyperplasia in human saphenous vein in vitro. J. Vasc. Surg. , (2014).
- Matsumoto, T., et al. Hemagglutinating virus of Japan-liposome-mediated gene transfer of endothelial cell nitric oxide synthase inhibits intimal hyperplasia of canine vein grafts under conditions of poor runoff. J. Vasc. Surg. 27 (1), 135-144 (1998).
- Petrofski, J. A., et al. Gene delivery to aortocoronary saphenous vein grafts in a large animal model of intimal hyperplasia. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 127 (1), 27-33 (2004).
- Hata, J. A., et al. Modulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling reduces intimal hyperplasia in aortocoronary saphenous vein grafts. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 129 (6), 1405-1413 (2005).
- Ohta, S., et al. Intraluminal gene transfer of endothelial cell-nitric oxide synthase suppresses intimal hyperplasia of vein grafts in cholesterol-fed rabbit: a limited biological effect as a result of the loss of medial smooth muscle cells. Surg. 131 (6), 644-653 (2002).
- Baldwin, Z. K., et al. Modulation of vascular remodeling induced by a brief intraluminal exposure to the recombinant R7020 strain of Herpes simplex-1. J. Vasc. Surg. 41 (1), 115-121 (2005).
- Eslami, M. H., et al. Gene delivery to in situ veins: differential effects of adenovirus and adeno-associated viral vectors. J. Vasc. Surg. 31 (6), 1149-1159 (2000).
- Globerman, A. S., et al. Efficient transgene expression from naked DNA delivered into an arterio-venous fistula model for kidney dialysis. J. Gene Med. 13 (11), 611-621 (2011).
- Yang, B., et al. Adventitial transduction of lentivirus-shRNA-VEGF-A in arteriovenous fistula reduces venous stenosis formation. Kidney Int. 85 (2), 289-306 (2014).
- Brahmbhatt, A., et al. The role of Iex-1 in the pathogenesis of venous neointimal hyperplasia associated with hemodialysis arteriovenous fistula. PLoS ONE. 9 (7), e102542 (2014).
- Karram, T., et al. Induction of cardiac hypertrophy by a controlled reproducible sutureless aortocaval shunt in the mouse. J. Investig. Surg. 18 (6), 325-334 (2005).
- Perry, G. J., et al. Genetic variation in angiotensin-converting enzyme does not prevent development of cardiac hypertrophy or upregulation of angiotensin II in response to aortocaval fistula. Circ. 103 (7), 1012-1016 (2001).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. J. Surg. Res. 108 (1), 112-121 (2002).
- Alexander, J. H., et al. Efficacy and safety of edifoligide, an E2F transcription factor decoy, for prevention of vein graft failure following coronary artery bypass graft surgery: PREVENT IV: a randomized controlled trial. JAMA. 294 (19), 2446-2454 (2005).
- Khaleel, M. S., et al. High-pressure distention of the saphenous vein during preparation results in increased markers of inflammation: a potential mechanism for graft failure. Ann. thorac. surg. 93 (2), 552-558 (2012).
