Summary
Atuais modelos in vitro para avaliação de lentes de contacto (CLS) e outras aplicações relacionadas com o olho são severamente limitados. A plataforma apresentada ocular simula o fluxo lacrimal fisiológico, o volume lacrimal, de exposição ao ar e desgaste mecânico. Este sistema é altamente versátil e pode ser aplicado a várias análises in vitro com o CLS.
Introduction
Duas áreas significativas de interesse dentro da arena lente de contato (CL) incluem desconforto e o desenvolvimento de aplicações CL novos. Elucidar os mecanismos subjacentes CL desconforto é um problema que iludiu o campo durante décadas. 8 O desenvolvimento do romance, o CLS funcionais, tais como dispositivos de entrega de drogas 1,3,9 e biossensores, 10-12 é uma área de interesse crescente, com mercados potenciais substanciais. Em ambas as circunstâncias, um sofisticado modelo in vitro poderá fornecer informações relevantes para ajudar com a seleção de materiais de lentes ou características de design apropriado durante a fase de desenvolvimento. Infelizmente, atual em modelos in vitro para avaliar o CLS e outras aplicações relacionadas oculares são relativamente bruto e sem sofisticação. Tradicionalmente, os estudos in vitro que avaliam CL deposição do filme lacrimal ou entrega da droga são realizadas em frascos de volume estáticos, contendo um grande volume de fluido fixo, que excelenTLY excede valores fisiológicos. Além disso, este modelo simples falta a componente de fluxo natural das lágrimas e o reflexo de piscar, ambas as quais são factores de definir o meio ocular.
O desenvolvimento de um "modelo" sofisticado, fisiologicamente relevante olho exigirá uma abordagem multidisciplinar e exigem substancial na validação vivo. Por estas razões, o quadro fundamental para o nosso modelo in vitro olho é altamente versátil, de modo que o modelo pode ser melhorado continuamente por meio de upgrades e modulações futuras. Até à data, o modelo é capaz de simular o volume lacrimal, do fluxo lacrimal, o desgaste mecânico e exposição ao ar. O objectivo é o de criar um modelo in vitro que irá fornecer resultados significativos, que é complementar ao preditivo e in vivo e ex vivo observações.
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Protocol
Todos os experimentos foram preenchidos em conformidade e cumprimento de todas as orientações pertinentes delineadas pelo comité de ética pesquisa animal da Universidade de Waterloo de. Os olhos de bovinos são generosamente doados a partir de um matadouro local.
1. Modelo de Olho
- Concepção e produção de moldes de 13
- Design os modelos de olho de acordo com as dimensões médias de fisiológicas olhos humanos adultos. 13
- Deixe um espaço de 250 mm entre o globo ocular e as peças da pálpebra do olho modelo. Projetar os respectivos moldes usando software assistida por computador (CAD).
- Criar novo arquivo .cad ou arquivo .sldprt com o AutoCAD ou Solidworks. Criar modelos 3D do globo ocular / pálpebra humana. Criar moldes dos modelos e salvar os moldes como arquivos .stl.
- Importar arquivos .stl em software da impressora 3D (por exemplo, makeware para replicator2). Especificar parâmetros da impressão (localização, sparseness, escala, orientação, suavidade, etc. 13.
- Salve o arquivo como arquivo G-código para impressoras 3D para ler. Seleccionar materiais tais como PLA (ácido poliláctico), ABS (acrilonitrilo butadieno estireno), PC (policarbonato), ou uma combinação dos mesmos, para imprimir os moldes 13.
- Instalar filamento desejado do material de escolha. Importar o arquivo G-código na impressora 3D para ler. Imprimir o molde.
NOTA: Como alternativa, produzir os moldes do olho usando um numérico computadorizado (CNC) máquina controlada, se uma superfície mais lisa do modelo de olho é desejada. Para a produção de moldes CNC, materiais para moldes já não estão limitados aos plásticos térmicos, mas estender-se a metal, cerâmica, polímeros e química resistivas, como politetrafluoretileno. - Abrir a interface de software do CNC que está ligado a uma broca de corte. Construção de moldes em 3D de acordo com frontal, superior, lateral e vistas em perspectiva dos previamente construídos moldes modelo globo ocular / pálpebra na interface do software de controle. Selecione os parâmetros apropriados para ousinagem (tamanho do bit, material de substrato, espessura do material) e prossiga para cortar o molde.
- Síntese de Oculares Utilizando PDMS
- Usando uma seringa, medir 10 ml de volume de PDMS base (polidimetilsiloxano) e preenchê-lo em um tubo de centrífuga de 15-50 ml. Adicionar 10% w / v da solução de elastómero em peso total de PDMS. Usando uma vareta de agitação, misturar as soluções bem.
- Despeje a solução PDMS no globo ocular e das pálpebras moldes. Permitir que o PDMS de resolver à TA S / N (ou, pelo menos, 12 h) para iniciar a polimerização e para permitir que as bolhas de dissolver o polímero para fora da.
NOTA: Verifique se não há bolhas deixadas no PDMS que possam subir ou expandir. - Subsequentemente, colocar os moldes num forno de 75 ° C (167 ° F) durante 1 h, ou de 150 ° C (302 ° F) durante 5 min. Para um gel suave, deixe as PDMS sentar-se à temperatura ambiente durante pelo menos 48 horas para polimerizar completamente.
- Coloque as amostras num congelador durante alguns minutos; isso vai diminuir o PDMS e simplificara remoção das amostras dos moldes. Extrair as oculares dos moldes utilizando uma espátula fina.
- Para a entrega da solução para dentro do espaço entre o globo ocular ea pálpebra peças, ligar um "x 1/8" tubo de politetrafluoretileno 16/01 com um conector do tubo de perna acoplador igual 1/16 "e anexar à parte da peça pálpebra no furo de tubagem .
- Síntese do globo ocular peça com Agarose
NOTA: A peça ocular podem ser sintetizados utilizando outros polímeros, tais como agarose. O procedimento seguinte pode também ser modificado para produzir peças oculares a partir de uma variedade de tipos de ágar, como PDA (Agar de Dextrose de batata) ou SDA (Sabouraud agar de dextrose).- Para produzir um gel de 2% (2 g / 100 ml), medida de 2 g de agarose e misturar-se com 100 ml de água ultrapura. Levar a solução à ebulição (100 ° C) de tal forma que a agarose se dissolve completamente. Deixe a solução esfriar por 5 min.
- Verter a solução para dentro do molde globo ocular e deixar a solução arrefecer para 30 min à temperatura ambiente. Retire os pedaços globo ocular com uma espátula. Armazenar o agar globo ocular em um -20 Congelador ° C para uso posterior. Para os estudos de microbiologia, esterilizar os moldes globo ocular por autoclave e / ou radiação UV.
- Incorporação de Bovinos Cornea em PDMS Eyeball
NOTA:. Este protocolo foi adaptado de Parekh et al 14- Realizar a dissecção e incorporação das córneas de bovinos em condições estéreis sob uma capela de fluxo laminar. Adquirir os olhos e dissecar-los no mesmo dia.
- Ligue a câmara de fluxo por 10 min antes da utilização e higienizar álcool com etanol a 70%. Certifique-se de que todos os materiais e instrumentos são estéreis por autoclavagem a 273 ° F / 133 ° C durante 45 min, e posicionada de não menos do que 4 polegadas a partir da câmara de fluxo de entrada.
- Mergulha-se o olho de bovino num copo contendo uma solução de povidona-iodo diluída, durante 2 min. Lavar o olho numa proveta contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS) PH 7,4. Utilizando uma pinça coloque suavemente o olho em uma placa de Petri de vidro, córnea face para cima.
- Remover o excesso de tecido adiposo e muscular, cortando nos pontos de fixação da esclera com tesouras de dissecação romba final. Elimine o excesso de tecido para um copo estéril designado para resíduos animais.
- Utilizando micro-tesoura, remover a conjuntiva do olho. Enrole a olho com gaze estéril, mantendo uma distância de pelo menos 1 cm a partir do limbo.
- Utilizando um escalpelo, incisão na esclera aproximadamente 2 mm a partir da região do limbo e superficialmente, de modo a evitar a penetração da coróide e vítreo subjacente. Cuidadosamente estender a incisão por 360 ° utilizando um bisturi ou dissecção tesoura sem deformar a córnea a partir de sua curvatura natural.
- Com uma pinça fina, remover a córnea do olho. Utilizando uma pinça, retire cuidadosamente qualquer tecido uveal aderindo e enxaguar córnea com PBS.
- Armazenar a córnea a 31ºC em um recipiente estéril com a culturamédio (tais como Meio 199) contendo 3% de Soro Fetal Bovino a manter a humidade nos tecidos e nutrição celular.
- Antes da experimentação, descansar da córnea transplantada no globo ocular PDMS, e prenda as duas peças juntas com um clip-on especializada.
2. Blink-plataforma
- Concepção e produção do Blink-plataforma
NOTA: O blink-plataforma é composta de três partes funcionais: Modelo de olho (descrito na seção 1), sistema de engrenagem, e do sistema eletrônico.- Concepção e fabrico da plataforma piscar usando CAD 3D e de impressão, semelhante ao descrito para o modelo de olho (secção 1.1). Projetar o sistema de engrenagem de tal forma que se traduz simples rotação de motores para os movimentos laterais e rotacionais das oculares. 15
- Usando o pinhão e mecanismo de engrenagem, traduzir o movimento rotacional de um motor de passo para o movimento lateral de um carreto, que está ligada às peças de pálpebra.
- usando osistema de engrenagem conjugado, amplificar um movimento de rotação de um motor de passo em três (ou mais) movimentos de rotação por três partes diferentes do globo ocular.
- Alinhar os dois sistemas de engrenagem, uma para a pálpebra e para um globo ocular, de modo que a distância entre os dois são constantes. Monte o sistema eletrônico com um microcontrolador, protetor do motor, e dois motores.
NOTA: Use dois motores de passo para fornecer motores rotativos, que é traduzido pelo sistema de engrenagem em um movimento de piscar. - Ligar os dois motores de passo com um sistema constituído por uma blindagem do motor empilhados no microcontrolador. Conectar e configurar os componentes electrónicos para trabalhar com produtos de software de fonte aberta.
- Programar o sistema para controlar os parâmetros do motor, tais como rotações por minuto (RPM), número de rodadas para a frente, número de rodadas para trás, e estilo de viragem.
NOTA: Consulte o "arquivo de código Arduino" complementar para detalhes. - Faça o download do software do sistema do mawebsite 'nufacturers.
- Instalar o software e abri-lo. Escrever o código para controlar motores de passo na configuração desejada. Ligar o sistema com uma fonte para fornecer energia ao sistema electrónico de modo a que os motores movem na forma desejada, tal como definido pelo pesquisador.
NOTA: Consulte o "arquivo de código Arduino" complementar.
- Montagem com microfluídica (solução de lágrimas artificiais)
- Tome o globo ocular sintetizados e peças pálpebra e deslizá-los em seus correspondentes clip-ons para o olho-modelo. Conecte o tubo que se une com uma seringa e posicionado na bomba microfluídico com a peça de pálpebra (ponto 1.2.5). Teste de executar a plataforma e verificar se há movimento consistente.
- Primeiro o tubo e verificar se há um fluxo constante de solução de lágrima artificial (ATS). A receita para o ATS foi relatada anteriormente. 16
- mover manualmente as partes do olho-modelo em conjunto num plano horizontal, de tal modo que o globo ocular e o olhotampa estão em contato. Definir a taxa de fluxo da bomba de microfluidos para os valores desejados. Definir taxas de fluxo fisiológicos para 1-1,5 mL / min. 17
- Comece a bomba e os atuadores para começar a experiência. Para experiências de administração de medicamentos, coloque a lente de contato que contém o medicamento na peça globo ocular.
- Permita que o fluido de fluxo para escorrer para uma placa de 12 poços. A intervalos de tempo definidos desejados, quantificar a concentração do analito ou de drogas usando métodos de detecção comuns, tais como espectroscopia de UV-Vis ou fluorescência. 1,4,18
- Para estudos que avaliaram a deposição de componentes de lágrima em lentes de contato, coloque a lente de contato na peça "globo ocular". Recolhe-se o fluido de fluxo, a qual pode ser descartada.
- Após os intervalos de tempo desejados, remova a lente de contato da peça globo ocular e preparar a lente para análise posterior, como a microscopia confocal.
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Representative Results
Os moldes olho sintetizados obtidos a partir da loja de máquinas de impressão e 3-D são apresentados na Figura 1. Esses moldes podem ser usados com uma variedade de polímeros, tais como PDMS e de agarose, para produzir oculares com as propriedades desejadas. O conjunto de gesto da plataforma de modelo de olho com uma bomba de seringa de microfluidos é mostrado na Figura 2. A plataforma simula o desgaste mecânico através da rotação da peça ocular, e de exposição ao ar através da lateral, dentro e fora de movimento da peça de pálpebra. fluido lacrimal é infundida na pálpebra de uma bomba de microfluidos com o caudal desejado, e o fluido de escoamento pode ser recolhido numa placa de 12 poços.
O procedimento para a dissecação de uma lente de bovino, e a montagem sobre uma ocular PDMS é representado na Figura 3. Os tecidos em excesso são separados a partir do olho e descartados, seguida da remoçãoda conjuntiva. A remoção da córnea começa com uma incisão na esclera perto do limbo. A Figura 4 mostra a variedade de oculares, que pode ser usado para várias análises in vitro. As peças globo ocular montado apresentados são sintetizados a partir de PDMS, agar, e uma ex-vivo córnea bovina montado sobre uma peça ocular PDMS.
A Figura 5 descreve um estudo de avaliação da libertação de um antibiótico, moxifloxacina, do CLs. 18, medida no modelo tradicional frasco, a libertação do fármaco ocorre nas primeiras 2 horas seguido por uma fase de patamar. Em contraste, o novo modelo de olho mostra a libertação do fármaco a ser lento e sustentável durante até 24 horas. 18 Um estudo avaliar a deposição de colesterol em CLs é mostrado na Figura 6. O colesterol no estudo foi fluorescentemente marcado na forma de NBD -colesterol (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il-colesterol), e DEPOSsição foi fotografada usando laser scanning microscopia confocal. Os resultados indicam que não há diferenças substanciais quando os estudos de deposição são realizadas num frasco, em comparação com o modelo de olho.
Figura 1. moldes ocular. (A) molde peça do globo ocular da oficina mecânica. (B) Eye tampa do molde de impressão 3-D. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Uma plataforma ocular in vitro. (A) Movimento circular simula o desgaste mecânico. (B) o movimento lateral produz ar intermitenteexposição. (C) a infusão de fluido lacrimal para pálpebra. (D) Coleta de placa bem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Dissecção e incorporação de córnea bovina. (A) A remoção do excesso de tecido. (B) A remoção da conjuntiva. (C) incisão na região do limbo. (D) A córnea transplantada pode ser armazenado ou montado em um pedaço globo ocular PDMS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. oculares de exemplo. Amostra de parte do olho PDMS com uma lente de contato, uma parte do olho agar e ex vivo córnea bovina ocular montado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. entrega da droga usando a plataforma vitro ocular in. Lançamento de moxifloxacina de lentes de contato descartáveis diárias a partir de (A) um frasco estática de grande volume e (B) o modelo de olho (Re-impressão com a permissão da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia). 18 Todos os dados são apresentados como média ± desvio padrão. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. deposição de colesterol usando a plataforma ocular in vitro. Imagens confocais mostrando uma secção transversal de etafilcon A, Nelfilcon A, nesofilcon A, ocufilcon B, delefilcon A, somofilcon A, narafilcon A após 4 horas de incubação com NBD-colesterol no frasco e modelo de olho. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há três passos críticos no âmbito do protocolo que requerem atenção especial: concepção e produção de moldes (seção 1.1), a montagem da plataforma (seção 2.2.1-2.2.3), e acompanhamento do funcionamento experimental (seção 2.2.4-2.2.7 ). Em termos de concepção e produção de moldes (seção 1.1), a peça globo ocular deve ser projetado de acordo com as dimensões de uma córnea humana. No entanto, pode exigir vários protótipos do molde antes de uma peça do globo ocular pode ser criado que se encaixa perfeitamente uma lente de contato comercial (CL). Além disso, os 250 um tem de ser mantida quando o globo ocular ea pálpebra peça estão em contacto para assegurar o fluido lacrimal flui suavemente ao longo de todo o modelo de olho quando um CL está presente. Esta distância pode ser alterado nas iterações futuras, mas não deve ser inferior a 150 um para permitir o espaçamento suficiente para caber uma CL. A montagem da plataforma (seção 2.2.1-2.2.3) requer muita atenção de tal forma que o globo ocular e um pedaço da pálpebra entrar em Contact durante o movimento de piscar. Se as oculares não estão em contacto perfeito, então a simulação de uma pálpebra fechada e fricção mecânica falha. O operador deve observar a plataforma em movimento por alguns ciclos para garantir que tanto o globo ocular e das pálpebras estão em contato, e que fricção ocorre como programado. A plataforma atual é projetado para ser executado continuamente mais de um mês, mas um operador deve sempre verificar a estabilidade do sistema a cada 24 horas durante a execução de um experimento (secção 2.2.4-2.2.7). Isto é importante porque a plataforma atual não possuir uma temperatura ou umidade controle, e as flutuações nestes parâmetros poderia secar o CLS. Se isto ocorrer, colocar o olho modelo dentro de uma câmara de humidade e temperatura controlada. Além disso, para as experiências de libertação de fármacos, o fluido de fluxo recolhido deverá ser analisado ou armazenado, pelo menos, a cada 2 horas para evitar uma evaporação significativa da amostra.
Atualmente existem duas limitações do apresentadomodelo de olho. A primeira limitação é em relação à exposição ao ambiente circundante. Actualmente, porque as peças oculares não são colocadas numa câmara controlada, alterações tais como a temperatura e a humidade na área de trabalho vai influenciar vários aspectos das experiências. Por exemplo, se o ambiente é muito seco, em seguida, o CLS secar-se mais rápido e pode separar-se da peça ocular, ou o fluido de fluxo pode evaporar. Para resolver este problema, iterações futuras vai abrigar o modelo de olho em uma câmara de temperatura e humidade controladas. A segunda limitação diz respeito à peça de complexidade globo ocular. Atualmente, as oculares são simples, consistindo de PDMS ou de agarose, nenhuma das quais representa verdadeiramente propriedades da superfície da córnea. O trabalho futuro terá como objectivo para produzir modelos de olho que imita mais estreitas as estruturas de superfície da córnea.
In vitro pesquisa ocular é geralmente visto como a fase de testes anterior à pesquisa in vivo. Contudo,é importante ter em mente que a investigação in vitro também podem ser complementares aos dados in vivo, fornecendo insights críticos que de outra forma não podem ser alcançados a partir de estudos in vivo sozinho. Lamentavelmente, a corrente modelos in vitro para CLs testes são rudimentares e não têm vários componentes-chave para imitar adequadamente o ambiente in vivo. Por exemplo, estudos in vitro CL são realizadas em frascos contendo 2-5 ml de solução salina tamponada com fosfato, que excede em muito 1-6 volumes de rasgo fisiológicas em 7,0 ± 2 ul. 7 Além disso, dois factores importantes de o meio ocular, de fluxo natural das lágrimas eo reflexo de piscar, estão ausentes do modelo frasco estático simples. As limitações do modelo convencional frasco ter sido reconhecido pelos investigadores, e têm sido feitas tentativas para criar único em modelos de olho in vitro que simulam o ambiente ocular, através da inclusão de um componente de lágrima reabastecimento de microfluidos 20-24 e / ou exposição ao ar intermitente. 25,26 Não surpreendentemente, os resultados obtidos a partir destas experiências são muito diferentes do que aqueles obtidos com o modelo frasco convencional, e pode assemelhar-se mais estreitamente dados in vivo. 20-25 Assim, o desenvolvimento de um intrincados no olho modelo in vitro para analisar CLs irá fornecer novos insights sobre a interacção de materiais de lentes com a superfície ocular, e ajudar a facilitar o desenvolvimento de novos materiais e novas aplicações para CLs nas próximas décadas.
Sem dúvida, um dos aspectos mais debatidos do modelo in vitro de olho é se o olho se assemelha a um dissipador de infinito, que é particularmente importante quando se trata de entrega da droga para o CLS. Sob condições de imersão infinita, o volume da solução circundante é significativamente maior do que o volume de saturação da droga, de tal modo que a libertação do fármaco não é afectada pela solubilidade do fármaco. 27 advogados para o frasco como uma Acceolho modelo ptable argumentam que a córnea, conjuntiva e circundante tecidos oculares juntas funcionam como um dissipador infinito. Embora, em teoria, isto pode ser verdade, o medicamento deve dissolver-se em primeiro lugar o fluido lacrimal. Este passo limitante da velocidade não é provavelmente uma condição pia, e será dependente tanto o volume de lágrima e fluem como simulado pelo nosso modelo.
A identidade única do modelo apresentado reside na sua capacidade de imitar o filme lacrimal. Ao adotar um design de duas peças, uma seção do globo ocular "da córnea / escleral" e um "pálpebra", é possível criar uma camada fina uniformemente distribuído de filme lacrimal em toda a parte do globo ocular quando ambas as partes entram em contacto. Para simular ainda mais a superfície ocular, o desgaste mecânico e exposição ao ar está incorporada no modelo por meio de dois actuadores mecânicos. Como a peça pálpebra se move lateralmente, ele simula o fechamento do olho e exposição ao ar intermitente. A rotação do globo ocular simula o desgaste mecânico produzido durang piscar. O sistema está acoplado com uma bomba de microfluidos, que infunde o modelo de olho com o fluido lacrimal a uma taxa de fluxo fisiológico ou qualquer outra taxa de fluxo desejada. A película lacrimal é formado sempre que as duas peças entrar em contacto, e o rasgo ruptura ocorre quando as duas peças separadas.
O objectivo é o de criar uma plataforma universal de ensaios para avaliar CLs para várias análises in vitro. A fim de ser versátil, as peças globo ocular pode ser sintetizada a partir de vários polímeros, tais como o polidimetilsiloxano (PDMS) ou ágar. Para estudos oculares simples, esses polímeros, que representam as superfícies hidrofóbicas e hidrofílicas, respectivamente, será suficiente. Contudo, como são necessárias mais análises complexas, por exemplo, a penetração da droga ocular ou toxicidade estudos, as peças oculares terá de ser adicionalmente modificados. Estas modificações adicionais ao modelo, tais como a inclusão de uma córnea ex vivo, como mostrado, são relativamente viável. No entanto, mais estudos de validaçãosão necessárias, e trabalho futuro terá como objectivo melhorar a validade deste modelo, comparando-a com modelos in vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer a nossa fonte de financiamento NSERC 20/20 Rede para o Desenvolvimento da Advanced Materials oftalmológica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arduino Uno R3 (Atmega328 - assembled) | Adafruit | 50 | Board |
| Stepper motor | Adafruit | 324 | Motor and Motor shield |
| Equal Leg Coupler 1.6mm 1/16" | VWR | CA11009-280 | 50 pcs of tube connector |
| Tubing PT/SIL 1/16"x1/8" | VWR | 16211-316 | Case of 50feet |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation | |
| Agarose, Type 1-A, low EEO | Sigma-Aldrich | A0169-25G | |
| PHD UltraTM | Harvard Apparatus | 703006 | MicroFluidic Pump |
| Bovine cornea | Cargill, Guelph/ON | ||
| Soldidworks | Dassault Systemes | Software | |
| 3-D printing | University of Waterloo - 3D Print Centre | ||
| Dissection tools | Fine Science Tools | General dissection tools | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | Culture medium storage for cornea | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher | Add to culture medium, 3% total volume |
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