Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج

Published: March 27, 2016 doi: 10.3791/53909
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Introduction

فيروس الانفلونزا (IAV) هو فيروس يلفها وينتمي إلى عائلة فيروسات مخاطية قويمة. يتم ترميز جيناته على مجزأة، السلبي، بمعنى واحد الذين تقطعت بهم السبل جينوم الحمض النووي الريبي. في البشر، IAV يسبب التهابات الجهاز التنفسي، والتي تحدث في تفشي وباء الموسمية ويحمل احتمالات الأوبئة العالمية 1. على الربط إلى بقايا حمض اللعابي على سطح الخلية المضيفة 2، والمنضوية IAV بواسطة الإلتقام تعتمد على بالكلاذرين ومسارات مستقلة بالكلاذرين 3-8. الوسط الحمضي (درجة الحموضة <5.5) في فجوات التقامي يتسبب في تغيير متعلق بتكوين رئيسيا في IAV ارتفاع بروتين سكري هيماغلوتينين (HA)، مما يؤدي إلى انصهار الفيروسية والراحل endosomal غشاء 9. مرة واحدة قفيصة IAV (كما يشار إليها هنا ب "الأساسية" الفيروسي) قد فر من الإندوسومات أواخر (ليه)، وغير المصقول في العصارة الخلوية تليها النقل من ribonucleoproteins الفيروسية (vRNPs) في نواة - موقع ستكاثر الفيروس و والنسخ 10-13. قبل تفعيل حمض HA الفيروس يواجه انخفاض تدريجي في درجة الحموضة في النظام التقامي، الذي يعبي الأساسية للتفكك اللاحق 14-16. في هذا "فتيلة" خطوة القنوات الأيونية M2 في الغشاء الفيروسي توسط في تدفق البروتونات وK +10،14،16. التغير في تركيز الأيونية في الداخل فيروس يزعج التفاعلات تراكم من البروتين مصفوفة الفيروسي M1 وحزمة vRNP ثمانية، ويسهل IAV uncoating في السيتوبلازم التالية الغشاء الانصهار 10،14-17.

وقد أعاق تحليل مباشر والكمي للخطوة فتيلة من حقيقة أن الإندوسومات يصعب الوصول تجريبيا. كانت عملية الإدخال، وعلاوة على ذلك، إلى حد كبير غير متزامن. وبالإضافة إلى ذلك، المقايسات نقطة النهاية، مثل QRT-PCR RNA من القياسات أو العدوى الفيروسية المفرج عنهم، لا تقدم صورة تفصيلية عن الحالة البيوكيميائية للcapsi الفيروسيةد في أي خطوة معينة من الدخول. في حين اضطراب الإندوسومات من سيرنا أو العلاج من تعاطي المخدرات ساهم بشكل كبير في فهم دخول IAV 18-20، صقل صعب وعرضة لآثار جانبية غير محددة في برنامج الاندوسوم النضج لرقابة مشددة.

لتجنب هذه المشاكل، ونحن تكيفت لفي المختبر بروتوكول سبق وضعها على أساس استخدام سرعة التدرج الطرد المركزي 17. وعلى النقيض من المحاولات الأخرى 21،22، 23،24، التي استندت في معظمها على مزيج من انشقاق بروتين والعلاج المنظفات تليها تحليل EM، مكن هذا النهج نتيجة قابلة للقياس بسهولة. الطرد المركزي من خلال طبقات متدرجة مختلفة يسمح الجسيمات المترسبة إلى أن تتعرض لوتتفاعل مع الظروف المتغيرة في الطريقة التي تسيطر عليها. في بروتوكول المعروضة، IAV المستمدة من السوائل السقاء توضيح أو الجسيمات الفيروسية النقاء والرسوبية إلى الجلسرين من طبقتينالتدرج التي تحتوي الطبقة السفلى المنظفات غير الأيونية NP-40 (الشكل 1). كما يدخل الفيروس الثانية، طبقة التي تحتوي على مواد التنظيف، وبالفاعلات والفيروسية المغلف الدهون والبروتينات السكرية المغلف بلطف وتركت وراءها. جوهر، ويتألف من vRNP حزمة ثمانية ومحاطة بطبقة مصفوفة والرواسب بمثابة هيكل مستقر في جزء بيليه. البروتينات الأساسية الفيروسية، مثل M1 والبروتين النووي المرتبطة vRNP (NP)، يمكن تحديدها في بيليه بواسطة SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ. على وجه الخصوص، والاستفادة من المواد الهلامية التدرج المتاحة تجاريا وتلطيخ مع الغروية حساسة للغاية Coomassie 25، وتمكن عالية الدقة وكشف حتى كميات صغيرة من البروتينات المرتبطة الأساسية الفيروسية.

هذا يضع أساسا لاختبار ما إذا كانت الظروف مختلفة مثل درجة الحموضة، تركيز الملح، والعوامل uncoating المفترضة لها آثار على سلوك الترسيب من المكونات الأساسية وSTABIL الأساسية إيتي. لتحقيق هذا الهدف، يتم تعديل فقط، الطبقة السفلى التي تحتوي على مواد التنظيف في التدرج الجلسرين عن طريق إدخال عامل أو شرط من الفائدة. وكانت هذه التقنية قيمة خاصة في التحقيق في تأثير القيم الرقم الهيدروجيني وتركيز الملح مختلفة على سلامة جوهر IAV 16. يمكن رصد الخطوات الوسيطة من IAV uncoating بما في ذلك تفكك طبقة المصفوفة في درجة الحموضة الحمضية أقل ما يقال (<6.5)، يليه vRNP التفكك في الرقم الهيدروجيني 5.5 وانخفاض 16،17 (الشكل 1). وتعززت الخطوة الأخيرة أبعد من ذلك وجود ارتفاع K + التركيز في طبقة الجلسرين، والتي تعكس بيئة التقامي أواخر 16. وبالتالي، بأنه الفيروس وجوهر الرسوبية من خلال التدرج أنها شهدت بيئة المتغيرة التي يحاكي الظروف في الإندوسومات. وكانت النتيجة التفكيك التدريجي للالأساسية الفيروسي في المختبر، واستكمال النتائج المستمدة من المقايسات بيولوجيا الخلية.

ر "> وقد مكن الطريقة المعروضة هنا سريع وتحليل تكرار للغاية من IAV (X31) و (A / WSN / 33) وIBV (B / لي / 40) uncoating الناجمة عن الحامضية وزيادة K +16،17 فضلا عن التفكيك من النوى الفيروسة المخاطانية على قلوية درجة الحموضة تعرض 17. فمن المتصور أن النهج يمكن أن تتكيف مع الفيروسات يلفها أخرى لاكتساب نظرة ثاقبة الخصائص الكيميائية الحيوية للهيكل قفيصة الفيروسية والتفكيك القفيصة أثناء دخول الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد المخازن المؤقتة والحلول المالية

  1. إعداد العازلة MNT (20 ملي زارة التربية والعلم، 30 ملي تريس و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم) عن طريق إذابة 470 ملغ تريس هيدروكلوريد، 390 ملغ MES هيدرات و 580 ملغ كلوريد الصوديوم في 80 مل ده 2 O. ضبط المخزن المؤقت إلى 7.4 درجة الحموضة وإحضاره إلى الحجم النهائي من 100 مل مع DDH 2 O.
  2. إعداد ثلاثة حلول متطابقة من 500 عازلة ملي زارة التربية والعلم عن طريق إذابة 9.76 ز MES هيدرات في 80 مل O 2 درهم لكل منهما. ضبط مخازن لدرجة الحموضة 5.8، 5.4، و 5.0، على التوالي، من خلال المعايرة مع تركيز هيدروكسيد الصوديوم. جلب كل المخزن المؤقت إلى الحجم النهائي من 100 مل مع DH 2 O.
  3. إعداد حلين متطابقة من 500 عازلة ملي تريس عن طريق إذابة 7.88 ز تريس هيدروكلوريد في 80 مل O 2 درهم لكل وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 و 6.4، على التوالي، من خلال المعايرة مع المركز HCI. جلب المخزن المؤقت إلى الحجم النهائي من 100 مل مع DH 2 O.
  4. تجهيز 50٪ من محلول الجلسرين في DH 2 O ويقلب جيدا حتى glycإيرول هو مختلط متجانس. تصفية حل من خلال وحدة تصفية Steritop (0.22 حجم ميكرون المسام) في زجاجة.
  5. إعداد 10٪ NP-40 حل و 1 M كلوريد الصوديوم في DH 2 O.
  6. إعداد 25X تتركز مثبط البروتياز عن طريق إذابة قرصين في 4 مل ده 2 O.

2. إعداد الجلسرين التدرجات

  1. إعداد 5 مل المنظفات مزيج عازلة الرئيسي (300 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2٪ NP-40، وتتركز 2X مثبط البروتياز) الحل لكل حالة الحموضة إلى اختبار (الرقم الهيدروجيني 7.4، 6.4، 5.8، 5.4، و 5.0). لهذا الغرض، خلط 9 مل من 1 M كلوريد الصوديوم، 6 مل من 10٪ NP-40، و 2.4 مل من الأسهم المانع 25X الأنزيم البروتيني، و 9 مل ده 2 0.
  2. لكل حالة الماصة درجة الحموضة 4.4 مل من مزيج الرئيسي إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  3. للحصول على قيم درجة الحموضة فوق 5.8 إضافة 0.6 مل للتعديل درجة الحموضة حل 500 سهم ملي تريس منها إلى الأنبوب. الرقم الهيدروجيني 5.8 وأقل إضافة 0.6 مل من 500 ملي زارة التربية والعلم محلول المخزون منها، تعديل درجة الحموضة.
  4. جعل 5مل من محلول العازلة التي تحتوي على 300 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2X مثبط البروتياز، 60 ملي تريس تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 و ده 2 O. وهذا سيكون بمثابة المخزن المؤقت وحة التحكم في التدرج خالية من المنظفات.
  5. إذا لزم الأمر، ودفع غرامة ضبط درجة الحموضة من الحلول لدرجة الحموضة 7.4، 6.4، 5.8، 5.4، و 5.0 عن طريق إضافة تتركز HCI أو هيدروكسيد الصوديوم الحلول، على التوالي.
  6. إضافة 5 مل من الأسهم الجلسرين 50٪ إلى 5 مل من خليط العازلة التي تحتوي على مواد التنظيف وخالية من المنظفات مما أسفر عن ستة مختلفة حلول الجلسرين 25٪. تحقق من قيم الرقم الهيدروجيني باستخدام شرائط مؤشر الرقم الهيدروجيني.
    ملاحظة: في حالة تختلف درجة الحموضة قياسها بشكل كبير من القيمة المطلوبة، ينبغي إعداد الحلول منها مرة أخرى.
  7. إعداد 15٪ من محلول الجلسرين عن طريق خلط 50٪ الأسهم الجلسرين مع DH 2 O في نسبة 3: 7.

3. تنبيذ فائق من IAV

  1. إضافة 3 مل 15٪ الحل الجلسرين في أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوح (13.2 مل، 14 ملم × 89 ملم) باستخدام حقنة 5 مل ونيDLE (21 G، 9 سم). لا تترك قطرات في الجدار الداخلي للأنبوب لأن ذلك قد يزعج سلامة التدرج. كرر هذا ليصبح المجموع ستة أنابيب الطرد المركزي، واحدة لكل من ظروف الأس الهيدروجيني خمسة لاختبار واحد للعينة السيطرة.
  2. وضع بعناية 3.4 مل 25٪ الحل الجلسرين تحت طبقة الجلسرين 15٪ باستخدام حقنة مل 5 و إبرة طويلة. الحرص على عدم خلط طبقتين. كرر هذا لجميع الشروط الستة لاختبار مع الحلول الجلسرين كل المعدلة درجة الحموضة.
    ملاحظة: العمل في الدرجة الثانية الوزراء للسلامة الأحيائية للخطوات التالية.
  3. تراكب بلطف التدرجات الجلسرين مع 30 ميكرولتر أوضح السوائل السقاء تحتوي على IAV (X31، H3N2) المخفف في 1 مل العازلة MNT (يناظر حوالي 20-30 ميكروغرام من البروتين الكلي الفيروسي) لكل التدرج.
  4. التوازن معارضة الأنابيب ووضعها في تنبيذ فائق الدوار SW41. الطرد المركزي لمدة 150 دقيقة، في 55000 x ج، و 12 درجة مئوية.
  5. بعد الطرد المركزي، بعنايةإزالة طاف، أي كل من طبقات الجلسرين باستخدام ماصة باستور نظيفة والشافطة. Resuspend وبيليه في 40 ميكرولتر (1X) غير الحد عينة العازلة LDS. ومن المهم أن الماصة صعودا وهبوطا عدة مرات بحل بيليه تماما. نقل العينة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.

4. SDS-PAGE من بيليه الكسور وCoomassie تلطيخ

  1. حرارة جميع العينات في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. عند هذه النقطة يمكن أن يتم تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى يتم تحليلها بواسطة SDS-PAGE.
  2. تحميل 20 ميكرولتر من الكريات المنحل على التدرج مسبقة الصب (4-12٪) مكرر تريس هلام صغيرة وتشغيل لمدة 1 ساعة على 200 V في 1X اجتماعات الأطراف SDS العازلة على التوالي.
  3. جعل حل التثبيت مع 40٪ الميثانول وحمض الخليك 10٪ الجليدية في ده 2 O.
  4. احتضان الجل في حل التثبيت لمدة 1 ساعة وصمة عار بين عشية وضحاها في 15 سم طبق ثقافة الخلية مع حجم كاف من الغروية حل Coomassie بينما بلطفاهتزاز في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: من المهم لإغلاق طبق من أجل تجنب التبخر من الحل تلطيخ.
  5. يزيل اللون هلام في ده 2 O. استبدال ده 2 O كل 15-20 دقيقة حتى يصبح خلفية جل واضحة. تخزين هلام في ده 2 O في 4 درجات مئوية حتى يتم مسحها لتقدير الفرقة.
  6. مسح هلام بدقة عالية واستخدام البرامج المتاحة أو حسب الطلب تجاريا لتقدير من شدة الفرقة البروتين. طرح إشارة الخلفية من منطقة قريبة من العصابات منها وتطبيع هذه القيم لعينات سيطرة خالية من المنظفات (في درجة الحموضة 7.4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما سبق ذكره، مطلوب فتيلة في الإندوسومات لتقديم الأساسية IAV uncoating المختصة. بروتوناتيون من جوهر يضعف تفاعل M1 وvRNPs (تتكون من الحمض النووي الريبي الفيروسي، NP، والبلمرة PB1 معقد / PB2 / PA). يبدأ هذه العملية عندما يتعرض فيروس الواردة إلى الرقم الهيدروجيني من 6.5 (أو أقل) في الإندوسومات في وقت مبكر (إي إي إس) وتستمر حتى الصمامات الفيروس في جميع أنحاء درجة الحموضة 5.0 في ليه.

من أجل تقليد انخفاض الرقم الهيدروجيني، تم تعديل الطبقة السفلى من التدرجات الجلسرين للقيم بين درجة الحموضة 7.4 و 5.0 في تركيز الملح المستمر. تعرض X31 المستمدة من السوائل السقاء أوضح أن الطرد المركزي سرعة التدرج وتحليلها بواسطة SDS-PAGE (الشكل 2A، B). دون المنظفات الحالي في الانحدار (الشكل 2A، lane1) ومكعبات virions سليمة، كما يتجلى ذلك في نمط مميز منفرق تمثل HA (HA1 وHA2، 63 كيلو دالتون)، NP (56 كيلو دالتون)، وM1 (27 كيلو دالتون) في Coomassie الملون هلام. منذ تم تشغيل هلام في ظل ظروف غير الحد، HA1 المشقوق proteolytically وHA2 لا تزال متصلة بواسطة السندات ثاني كبريتيد وتعمل في حوالي 64 كيلو دالتون. في ظل ظروف الحد من العصابات الموافق HA1 وHA2 ستظهر قريبا جدا من العصابات NP وM1، على التوالي، مما يجعل من الصعب تفسير بأمانة وتحديد شدة الفرقة التي هي مستمدة فقط من صميم الفيروسي (الشكل 2B).

على إضافة NP-40 إلى أسفل (25٪) الجلسرين طبقة الغلاف الفيروسي بما في ذلك HA، NA، وكانت M2 بالفاعلات وجوهر الفيروسي الرسوبية وحدها في بيليه خلال تنبيذ فائق (الشكل 1؛ الشكل 2، 2 لين). بدءا من الرقم الهيدروجيني أقل من 6.5، يتم فقدان M1 تدريجيا من جزء بيليه، وبلغ الحد الأدنى بين درجة الحموضة 5.8 و 5.4 (الشكل2A، B). تحت درجة الحموضة تم فصلها 5.8 vRNPs وخسر من بيليه وهكذا. سابقا، وقد تبين أنه، في الواقع، يتم الافراج vRNPs كلها في الطبقة العليا، والإفراج عنهم يرتبط مع فقدان PB2 من بيليه جزء 16. تم تحديد شدة الفرقة البروتين، وكشف عن اثنين من عتبات درجة الحموضة متميزة للتفكك وطبقة M1 وتفكك حزم vRNP، على التوالي (الشكل 2). ويمكن ملاحظة الفرق إضافية على هلام، والتي قد تتوافق مع البروتينات البلمرة PB1 (87 كيلو دالتون)، PB2 (86 كيلو دالتون)، والسلطة الفلسطينية (83 كيلو دالتون)، و M2 (11 كيلو دالتون). نظرا لأعداد نسخة منخفضة في الداخل virions IAV لم نتمكن من تحديد موثوق هويتهم وانهم بالتالي لا تؤخذ بعين الاعتبار لتقدير.

الشكل 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للIAV في المختبر الأساسية التفكيك الفحص. لفترة وجيزة، يتم تحميل الجسيمات الفيروسية النقاء على خطوتين الجلسرين التدرج. تحتوي الطبقة السفلى المنظفات NP-40 وتعدل لتركيز الحموضة والملح المطلوب في حين يتم الاحتفاظ، طبقة خالية من المنظفات العليا في تركيز الحموضة والملح المستمر. تبعا لحالة في طبقة الجلسرين أقل، النوى الفيروسية كاملة الرواسب إلى أسفل (1) أو نأت وتبقى في طبقة الجلسرين (2). الرقم الهيدروجيني محايدة يؤدي إلى ترسب النوى الفيروسية سليمة مكونة من M1 وvRNPs. الظروف المواتية لuncoating، مثل الرقم الهيدروجيني الحمضية (5.0)، والنتائج في التفكك من المكونات الأساسية الفيروسية وبالتالي خسارة من جزء بيليه. بعد تنبيذ فائق، يتم إزالة supernatants الجلسرين ويتم تحليل الكريات بواسطة SDS-PAGE. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. P>

الشكل 2
الشكل 2: IAV التفكيك الأساسية في المختبر على تحمض (A) في المختبر التفكيك من النوى X31 في ظروف الأس الهيدروجيني مختلفة في طبقة الجلسرين أقل. كعنصر تحكم، تم حذف NP-40 من طبقة الجلسرين أسفل (المسار الأول). تم فصل العينات بواسطة SDS-PAGE تحت ظروف غير الحد تليها Coomassie تلطيخ. يشار إلى العصابات البروتين الفيروسي على اليمين. (ب) قياس الكثافة الكمي لشدة العصابات البروتين الفيروسي هو مبين في الفقرة (أ). تم تطبيع البروتين شدة الفرقة لM1 وNP لتلك التي في درجة الحموضة 7.4 دون NP-40. يتم تمثيل البيانات كوسيلة للتجارب مكررة ± الانحراف المعياري (SD). مقتبس من ستوفر وآخرون، 2014 (16).ge.jpg مرحبا "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

capsids الفيروسية المجمعات الجزيئات متبدل الاستقرار. في حين تجميع virions يتطلب encapsidation والتكثيف من الجينوم فيروس، بدء الجولة القادمة من عدوى يعتمد على تفكيك هذه البنية القفيصة المضغوط. وقد تطورت الفيروسات لاستغلال الآليات الخلوية المختلفة للسيطرة على دورة طلاء uncoating، بما في ذلك المستقبلات الخلوية، مرافقين، والإنزيمات المحللة للبروتين، القوى الفيزيائية التي تقدمها البروتينات الحركية أو helicases وكذلك درجة الحموضة ومفاتيح الأيونية 26،27. هنا، نحن تصف نهجا في المختبر على أساس الطرد المركزي الجلسرين التدرج لاختبار تحديدا تأثير عوامل تعزيز التفكيك من جوهر IAV. هذه التقنية يمكن أن يحتمل تكييفها لتشريح العمليات uncoating من الفيروسات يلفها أخرى.

باستخدام الغروية Coomassie، البروتينات IAV الهيكلية الرئيسية M1، NP، وHA يمكن الكشف عنها بشكل واضح في SDS-PAGE حتى مع وجود partic فيروس صغير نسبيالو العدد. ومع ذلك، وتوصيف أكثر في عمق بنية القفيصة الرسوبية وتكوينه يتطلب متابعة ويحلل، مثل المجهر الإلكتروني (كما وردت سابقا 28)، غرب النشاف، ودينامية تشتت الضوء أو قياس الطيف الكتلي. مزيد من التمديد للبروتوكول يمكن أن تشمل التجزئة من أقل (25٪) المرحلة الجلسرين وتحليل المكونات الأساسية المحددة.

أدى تعديل الطبقة السفلى الجلسرين لحموضة الانصهار المثلى من 5.0 (لX31) إلى التفكك شبه الكامل للطبقة مصفوفة (الشكل 2) 16. ومع ذلك، لا يزال من الممكن الكشف عن حوالي 30٪ من مدخلات إشارة NP في هذه الحموضة. ومن الممكن أنه نظرا لعدم وجود عوامل uncoating الخلوية في هذا الإعداد، مثل تحديد مؤخرا هيستون deacetylase 6 (HDAC6) 18، يحدث التفكيك غير مكتملة. داخل الخلية، وتحمض بطء قلب الفيروسي والتعرض للتبديل من الصوديوم إلى K + 16. لا يمكننا استبعاد أن في الإعداد لدينا، والمنظفات غير الأيونية يعطل جزئيا جوهر حمض المكشوفة وزعزعة الاستقرار. ومع ذلك، أي تأثير على جوهر المترسبة في الرقم الهيدروجيني محايدة لوحظ أشارت كتبها مماثلة شدة الفرقة البروتين بالمقارنة مع عينات غير بالفاعلات (الشكل 2A، مقارنة حارات 1 و 2). على الرغم من أن فحص المقدمة هنا ثبت أن يكون تكرار للغاية و(على هذا النحو هو) قوي بما فيه الكفاية لتقدير الفرقة، وطائفة معينة من التباين ويمكن ملاحظة.

استخدام الجلسرين في هذا البروتوكول هو أمر حاسم لنتائج التجربة. كما ذكرت سابقا 17، تنبيذ فائق من خلال التدرج السكروز يزعزع استقرار الأساسية IAV، الذي يرجع في الغالب إلى قوة الأسموزية العالية التي أنشأتها السكروز. تنقية IAV عبر التدرجات السكروز قد يؤدي الى تأثيرات مماثلة. وبالتالي فإننا مقارنة البيض نمت X31 مستمدة من البنود السوائل السقاء arified وأسهم تنقية السكروز. لا يوجد فرق كبير ويمكن ملاحظة فيما يتعلق تأثير درجة الحموضة الحمضية على الاستقرار الأساسية (لا تظهر البيانات). ومع ذلك، من أجل استبعاد الآثار الجانبية المحتملة من السكروز نشط osmotically، نوصي إجراء فحص في المختبر uncoating مع توضيح سقائية supernatants ثقافة الخلية السوائل أو المركزة.

وبالاضافة الى اختيار المواد التدرج، فمن المهم للحفاظ على سلامة التدرج لعدم التأثير على سلوك الترسيب من النوى الفيروسية هي lysed وضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار. وبالإضافة إلى ذلك، إعادة تعليق غير الكامل للجزء بيليه بعد تنبيذ فائق المرجح أن يؤدي إلى نتائج مختلفة. وأخيرا، ونحن نوصي بشدة ضبط درجة الحموضة في المحاليل التي تحتوي على مواد التنظيف في مكان مناسب في نفس يوم من التجربة عن التغيرات الصغيرة في التركيز الأيوني قد يكون لها تأثير كبير على استقرار الأساسية الفيروسي.

محتوى "> ومن المهم أن نلاحظ أن هذا يتوقف على سلالة IAV معين، الكفاءة التفكيك مختلفة قد تحدث على أساس خصائص M1 منها وNP المتغيرات، وهذا قد ينطبق أيضا للبحث عن الفيروسات متحولة. وهكذا، عتبات الرقم الهيدروجيني للطبقة مصفوفة وvRNP ويتحدد التفكك لسلالة IAV منها قبل اختبار تأثيرات إضافية. وبالنسبة لتحليل شروط معينة على الاستقرار الأساسية الفيروسي نقترح تعديل طبقة الجلسرين أسفل إلى قيمة الرقم الهيدروجيني بحيث يتم تحقيق التفكيك نصف الحد الأقصى من M1. ومن الممكن للتحقيق في تأثير أيونات معينة أو الاختزال عن طريق تعديل الطبقات التي تحتوي على المنظفات وفقا لذلك. ويمكن إضافة عوامل uncoating الخلوية المفترضة مباشرة إلى التدرج الجلسرين، وفي حالة عوامل هيولي، طبقة الجلسرين الثالثة في الجزء السفلي من الانحدار يمكن أن يكون عرض، والذي يتم تعديله لدرجة الحموضة محايدة، يحتوي على عامل الخلوي من الفائدة، وخالية من المنظفات. وبهذه الطريقة، الأن ه ثلاث طبقات متدرجة تحاكي بشكل أوثق مرور الفيروس عن طريق نظام التقامي والإفراج عن شرائح الجينات في السيتوبلازم محايد.

مجتمعة، نقدم وإن كان بسيطا في المختبر فحص قوي لدراسة IAV فتيلة وuncoating، والتي لديها القدرة على التعديلات تنوعا من أجل معالجة مسائل متنوعة في سياق دخول IAV. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يمكن تطبيقها على التحقيق في عمليات دخول الفيروسات يلفها أخرى مع آليات uncoating ذات الصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر يوهي ياموتشي وروبرتا مانشيني لتزويدنا الكواشف. وأيد المختبر ه من قبل ماري كوري شبكة التكوين الأولي (آي تي)، والمجلس الأوروبي للبحوث (ERC)، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (SINERGIA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets Sigma-Aldrich 11873580001 The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid Merck Millipore 100063
Glycerol anhydrous BioChemica AppliChem A1123
Hydrochloric acid Merck Millipore 100317
Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Methanol Merck Millipore 106009
NP-40 Sigma-Aldrich I8896 Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm Life Technologies NP0321
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Technologies NP0008
NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) Life Technologies NP0001
pH indicator strips, pH 4.0-7.0 Merck Millipore 109542
QC Colloidal Coomassie Stain BIO RAD 1610803
Sodium chloride Merck Millipore 106406
Sodiumhydroxide Merck Millipore 106498
Steritop filter unit Merck Millipore SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set Beckman Coulter 331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Tris hydrochloride  AppliChem A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid Virapur Freshly thawed on 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
  2. Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
  3. de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
  4. Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
  5. Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
  6. Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
  7. Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
  8. Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
  9. White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
  10. Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
  11. Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
  12. Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
  13. Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
  14. Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
  15. Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
  16. Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
  17. Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
  18. Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
  19. Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
  20. Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
  21. Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
  22. Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
  23. Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
  24. Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
  25. Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  26. Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
  27. Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
  28. Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).

Tags

عدوى، العدد 109، الأنفلونزا فيروس، دخول الفيروس، uncoating، M1، vRNPs، تنبيذ فائق
<em>في المختبر</em> التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stauffer, S., Nebioglu, F.,… More

Stauffer, S., Nebioglu, F., Helenius, A. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (109), e53909, doi:10.3791/53909 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter