Introduction
וירוס שפעת A (IAV) הוא וירוס אפוף ושייך למשפחת Orthomyxoviridae. הגנים שלו מקודדים על גנום RNA מפולח, שלילי-השכל חד-גדילים. אצל בני אדם, IAV גורם זיהומים בדרכי נשימה, אשר מתרחשים התפרצויות מגיפה עונתיות ונושאת פוטנציאל המגיפות העולמיות 1. עם קשירת שאריות חומצת sialic על תא מארח המשטח 2, IAV מופנם על ידי אנדוציטוזה clathrin התלוי מסלולים עצמאיים-clathrin 3-8. המילייה חומצי (pH <5.5) ב vacuoles endocytic מפעילה שינוי קונפורמציה מרכזי hemagglutinin גליקופרוטאין ספייק IAV (HA), שתוצאתה היתוך של נגיפי ואת endosomal מאוחר קרום 9. לאחר קפסיד IAV (כאן המכונה גם ויראלי "הליבה") ברח מן endosomes מאוחר (LES), הוא ללא ציפוי ב cytosol ואחריו התחבורה של ribonucleoproteins ויראלי (vRNPs) לתוך הגרעין - O את האתרf וירוס שכפול שעתוק 10-13. לפני הפעלת חומצה של HA בנגיף חווה ירידה הדרגתית pH במערכת endocytic, אשר מספרים ראשוניים הליבה עבור פירוקו לאחר 14-16. בחודש זה "הטרמה" צעד של תעלות יונים M2 בקרום ויראלי לתווך זרם של פרוטונים ו- K +10,14,16. השינוי בריכוז יוני בפנים הווירוס מפריע האינטראקציות להצטבר על ידי חלבון מטריקס ויראלי M1 ואת צרור השמונה vRNP, ומקל IAV uncoating בציטופלסמה הבא קרום היתוך 10,14-17.
ניתוח ישיר וכמותיים של הצעד יחול כבר הקשה על ידי העובדה endosomes קשה לגשת באופן ניסיוני. תהליך הכניסה, יתר על כן, מאוד לא סינכרוני. בנוסף, מבחני סוף נקודות, כגון qRT-PCR של מדידות infectivity או רנ"א נגיפי שוחרר, אינם מספקים תמונה מפורטת על מצב ביוכימי של capsi ויראליד בכל צעד נתון כניסה. בעוד ההפרעות של endosomes ידי siRNA או טיפול תרופתי תרם משמעותית להבנת כניסה IAV 18-20, כיוונון עדין קשה ונוטים תופעות לוואי נוקבים בתוכנית התבגרות אנדוזום תחת פיקוח הדוק.
כדי למנוע בעיות אלה, יש לנו התאמנו שפותח בעבר בפרוטוקול במבחנה מבוסס על שימוש צנטריפוגה שיפוע מהיר 17. בניגוד לניסיונות אחרים 21,22, 23,24, שהתבססו בעיקר על שילובים של מחשוף פרוטאוליטים וטיפול חומר ניקוי ואחריו ניתוח EM, גישה זו אפשרה להם תוצאה לכימות בקלות. צנטריפוגה דרך שכבות צבע שונות מאפשרת החלקיקים לסדימנטציה להיחשף ומגיבים עם שינוי תנאים באופן מבוקר. בפרוטוקול שהוצג, IAV נגזר נוזל allantoic בהיר או חלקיקים נגיפיים מטוהרים שקועים גליצרול דו שכבתישיפוע שבו השכבה התחתונה מכילה את הלא יוניים חומר ניקוי NP-40 (איור 1). כמו הנגיף חודר את השכבה השנייה, המכיל חומר ניקוי, המעטפה שומנים ויראלי גליקופרוטאינים המעטפה הם solubilized בעדינות והשאיר אחריו. הליבה, מורכב משמונה צרור vRNP ומוקף שכבת מטריקס, משקע כמבנה יציב לתוך השבר הגלול. חלבונים הליבה ויראלי, כגון M1 ו- nucleoprotein הקשורים vRNP (NP), יכול להיות מזוהים את הכדור על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים. בפרט, תוך ניצול של ג'ל שיפוע הזמין המסחרי מכתימה עם קולואידים רגישות הגבוהה Coomassie 25, מאפשר דיוק וזיהוי גבוהים של כמויות קטנות אפילו של חלבוני ליבה קשורה ויראלי.
זו מגדירה את הבסיס לבדוק האם תנאים שונים כגון pH, ריכוז מלח, וגורם uncoating המשוערת יש השפעות על התנהגות השקיעה של רכיבי ליבת הליבה stabil ity. למטרה זו, רק את השכבה התחתונה, המכיל חומר ניקוי שיפוע גליצרול היא שונה על ידי החדרת הגורם או מצב עניינים. הטכניקה כבר יקרה במיוחד בחקירת ההשפעה שונה ערכי pH וריכוז מלח על שלמות ליבת IAV 16. פעולות ביניים של uncoating IAV יכול להיות במעקב דיסוציאציה כולל של שכבת מטריקס ב- pH חומצי קל (<6.5) ואחריו דיסוציאציה vRNP ב- pH 5.5 והתחתון 16,17 (איור 1). השלב האחרון היה עוד יותר משופר על ידי נוכחות של גבוה K + ריכוז בשכבת גליצרול, המשקף בסביבה endocytic מאוחר 16. לכן, כמו הווירוס ואת הליבה משקעים דרך השיפוע שחווה בסביבה משתנית שתנאים מחקו ב endosomes. התוצאה היתה פירוק הדרגתי של הליבה ויראלי במבחנה, המשלימה התוצאות הנגזרות מבחני ביולוגיה של התא.
t "> השיטה המוצגת כאן אפשרה מהר וניתוח לשחזור ביותר של IAV (X31 ו- A / WSN / 33) ואת IBV (B / Lee / 40) uncoating מופעלות על ידי pH חומצי והגדלת K +16,17 וכן פירוק ליבות paramyxovirus בחשיפה pH בסיסי 17. זה מתקבל על הדעת כי ניתן להתאים את הגישה וירוסים אפוף אחרים כדי להשיג תובנות את התכונות הביוכימיות של המבנה קפסיד ויראלי ופירוק קפסיד במהלך ערך בתא.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת חוצצים ופתרונות במלאי
- הכן חיץ MNT (20 MES מ"מ, 30 מ"מ טריס ו 100 mM NaCl) על ידי המסת 470 מ"ג טריס Hydrochloride, 390 מ"ג מימה MES ו 580 מ"ג NaCl ב 80 מ"ל DDH 2 O. התאם את חיץ pH 7.4 ולהביא אותו לנפח סופי של 100 מ"ל עם DDH 2 O.
- הכן שלושה פתרונות זהים של 500 חיץ מ"מ MES על ידי המסת מימה MES 9.76 גרם 80 מ"ל DH 2 O כל אחד. התאם את מאגרי 5.8 pH, 5.4, ו -5.0, בהתאמה, על ידי titrating עם NaOH המרוכז. תביאו כל חיץ לנפח סופי של 100 מ"ל עם DH 2 O.
- הכן שני פתרונות זהים של 500 מ"מ טריס חיץ ידי המסת 7.88 גרם טריס הידרוכלוריד ב 80 מ"ל DH 2 O כל ולהתאים את ה- pH ל 7.4 ו -6.4, בהתאמה, על ידי titrating עם מרוכזת HCI. תביאו למאגר לנפח סופי של 100 מ"ל עם DH 2 O.
- הכן פתרון גליצרול 50% ב DH 2 O ומערבבים היטב עד glycארול הוא מעורב homogenously. סנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן Steritop (0.22 מיקרומטר גודל נקבובי) לתוך בקבוק זכוכית.
- כן 10% פתרון NP-40 ו 1 M NaCl ב DH 2 O.
- הכן 25x מעכב פרוטאז מרוכז על ידי המסת שתי טבליות ב 4 מ"ל DDH 2 O.
2. הכנת מעברי צבע גליצרול
- כן 5 מיליליטר לערבב חומרי ניקוי החיץ מאסטר (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x מרוכז מעכבי פרוטאז) פתרון עבור כל תנאי pH לבדוק (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, ו -5.0). לשם כך, לערבב 9 מ"ל של 1 M NaCl, 6 מ"ל של 10% NP-40, 2.4 מ"ל של המניה מעכב פרוטאז 25x, ו- 9 מ"ל DDH 2 0.
- עבור כל pH מצב pipet 4.4 מ"ל של מיקס מאסטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
- עבור ערכי ה- pH מעל 5.8 להוסיף 0.6 מ"ל של פתרון המניות בהתאמה מותאם pH 500 מ"מ טריס אל הצינור. עבור 5.8 pH והתחתון להוסיף 0.6 מ"ל של פתרון המניות pH המותאמת בהתאמה 500 מ"מ MES.
- הפוך 5מ"ל של תמיסת מאגר המכיל 300 mM NaCl, מעכבי פרוטאז 2x, 60 מ"מ טריס מותאם pH 7.4 ו DDH 2 O. זה ישמש חיץ שיפוע מלא חומר ניקוי חינם.
- במידת הצורך, עדין לכוונן את ה- pH של פתרונות pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4, ו -5.0 ידי הוספת פתרונות HCI או NaOH מרוכז, בהתאמה.
- הוסף 5 מ"ל של המניה גליצרול 50% עד 5 מ"ל של המכילים חומרי ניקוי וחומרי ניקוי ללא תערובות חיץ וכתוצאה מכך שישה פתרונות גליצרול שונים 25%. בדוק את ערכי ה- pH באמצעות רצועות אינדיקטור pH.
הערה: במידה pH נמדד שונה באופן משמעותי מן הערך הרצוי, הפתרונות המתאימים צריכים להיות מוכנים שוב. - כן פתרון גליצרול 15% על ידי ערבוב 50% מניות גליצרול עם DH 2 O ב 3: יחס 7.
3. ultracentrifugation של IAV
- הוסף 3 פתרון גליצרול מ"ל 15% לתוך צינורות צנטריפוגה אולטרה ברור (13.2 מ"ל, 14 מ"מ x 89 מ"מ) באמצעות מזרק 5 מ"ל ו לביתDLE (21 G, 9 ס"מ). אין להשאיר טיפות על הקיר הפנימי של הצינור, שכן הדבר עלול להפריע את היושרה של השיפוע. חזור על פעולה זו עבור סכום כולל של שישה צינורות צנטריפוגה, אחד עבור כל אחד מחמשת התנאים pH לבדוק ואחד למדגם שליטה.
- בזהירות במקום 3.4 מ"ל 25% פתרון גליצרול מתחת לשכבת גליצרול 15% באמצעות מזרק 5 מ"ל ו מחט ארוכה. יש להיזהר שלא לערבב את שתי השכבות. חזור על פעולה זו עבור כל ששת התנאים לבדוק עם פתרונות גליצרול pH המותאמת בהתאמה.
הערה: עבודת בארון biosafety בכיתה השנייה על הצעדים הבאים. - בעדינות כיסוי הדרגתי גליצרול עם 30 μl בהירים נוזל allantoic המכיל IAV (X31, H3N2) מדולל 1 מיליליטר חיץ MNT (מקביל סביב 20-30 מיקרוגרם של חלבון נגיפי הכולל) עבור כל צבע.
- יתרה מנוגדים צינורות ומניחים אותם לתוך הרוטור ultracentrifugation SW41. צנטריפוגה עבור 150 דקות, ב 55,000 XG, ו -12 מעלות צלזיוס.
- לאחר צנטריפוגה, בזהירותלהסיר את supernatant, כלומר, הן שכבות גליצרול באמצעות פיפטה פסטר נקייה וכן aspirator. Resuspend גלולה ב 40 μl (1x) חיץ מדגם LDS הלא צמצום. חשוב pipet מעלה ומטה מספר פעמים כדי לפזר את הגלולה לחלוטין. מעבירים את המדגם לתוך צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
4. SDS-PAGE של גלולה שברים ו Coomassie מכתים
- מחמם את כל הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בשלב זה הדגימות ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד שהם מנותחים על ידי SDS-PAGE.
- טען 20 μl של כדורי מומס על שיפוע מראש יצוק (4-12%) Bis-טריס ג'ל מיני ולהפעיל עבור שעה 1 ב 200 V ב 1x מגבים SDS הפעלת המאגר.
- בצע פתרון קיבעון עם 40% מתנול 10% קרחוני חומצה אצטית DDH 2 O.
- דגירה ג'ל בתמיסה קיבעון עבור שעה 1 ו להכתים לילה בצלחת תרבית תאים 15 ס"מ עם נפח מספיק של פתרון Coomassie קולואידים בעוד בעדינותרועד בטמפרטורת החדר.
הערה: חשוב לסגור את המנה על מנת למנוע אידוי של הפתרון המכתים. - Destain הג'ל DDH 2 O. החזר את DDH 2 O כל 15-20 דקות עד שרקע ג'ל מתבהר. אחסן את הג'ל DDH 2 O על 4 מעלות צלזיוס עד שהוא נסרק כימות הלהקה.
- סרוק את הג'ל על ברזולוציה גבוהה ולהשתמש תוכנה זמינה או מחוייט מסחרית עבור כימות של עוצמות להקת חלבון. הפחת את אות רקע מאזור קרוב להקות בהתאמה לנרמל את הערכים הללו ל דגימות בקרת חומר הניקוי ללא (ב- pH 7.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שכבר דן, יחול ב endosomes נדרש כדי להבהיר את ליבת IAV uncoating מוסמכת. Protonation של הליבה מחליש אינטראקציה של M1 ו- vRNPs (מורכב של רנ"א הנגיפי, NP, ואת פולימראז המורכב PB1 / PB2 / רש"פ). תהליך זה מופעל כאשר וירוס נכנס חשוף pH של 6.5 (או נמוכים) ב endosomes מוקדם (EES) וממשיך עד נתיכי הווירוס בסביבות 5.0 pH ב Les.
על מנת לחקות את הירידה של pH, השכבה התחתונה של הדרגתיים גליצרול הותאמו ערכי בין pH 7.4 ו -5.0 בריכוז מלח מתמיד. X31 נגזר נוזל allantoic הבהיר היה נתון צנטריפוגה שיפוע מהיר ונותח על ידי SDS-PAGE (איור 2 א ', ב'). ללא חומר ניקוי נוכח השיפוע (איור 2 א, lane1) virions השלם הם pelleted, כפי שמשתקפים הדפוס האופייני שללהקות המייצג HA (HA1 ו HA2; 63 KDA), NP (56 KDA), ו M1 (27 KDA) ב Coomassie מוכתם ג'ל. מאז ג'ל נדרס בתנאים הלא צמצום, proteolytically ביקע HA1 ו HA2 עדיין מחוברים באמצעות אג"ח דיסולפיד ולהפעיל כ 64 kDa. בתנאי הפחתת הלהקות המתאימות HA1 ו HA2 תופענה קרוב מאוד להקות NP ו M1, בהתאמה, מה שהופך אותו קשה לפרש בנאמנות ולקבוע בעוצמות להקה כי נגזרות אך ורק מליבת ויראלי (איור 2 ב).
עם התוספת של NP-40 לתחתית (25%) גליצרול שכבת המעטפת הנגיפית כולל HA, NA, ו- M2 היה solubilized וליבת ויראלי לבד משקעת לתוך הגלולה במהלך ultracentrifugation (איור 1; איור 2, מסלול 2). החל עם pH מתחת ל -6.5, M1 הוא איבד בהדרגה את השבר גלולה והגיע למינימום בין pH 5.8 ו -5.4 (איור2A, B). להלן pH 5.8 vRNPs היו מנותקים וכך אבדו מן הגלולה. בעבר, הוכיח כי, למעשה, כל vRNPs משתחרר לתוך השכבה העליונה, כמו שחרורם בקורלציה עם הפסד של PB2 מן השבר הגלול 16. להקה עוצמת חלבון נקבעו, התגלה שני ספי pH ברורים פירוק שכבת M1 ו- דיסוציאציה של חבילות vRNP, בהתאמה (איור 2). להקות נוספות יכולות להיבחן על הג'ל, אשר עשוי מתאים אל PB1 חלבוני פולימראז (87 KDA), PB2 (86 KDA), הרשות פלסטינית (83 KDA), ו- M2 (11 KDA). בשל מספרי העותק התחתונים שלהם בתוך virions IAV לא יכולנו לקבוע את זהותם באופן מהימן והם וכתוצאה מכך לא נלקחו בחשבון עבור כימות.
איור 1: ייצוג סכמטי של IAV 
איור 2: פירוק ליבת IAV במבחנה על החמצה (א) במבחנת פירוק חלקים המשומשים X31 בתנאי pH שונה בשכבת גליצרול הנמוכה.. כביקורת, NP-40 הושמטו משכבת גליצרול התחתונה (הנתיב הראשון). דוגמאות הופרדו על ידי SDS-PAGE בתנאים שאינם צמצום ואחריו Coomassie מכתים. להקות חלבון נגיפי מסומנים בצד ימין. (ב) כימות densitometric של העוצמות של להקות חלבון נגיפיות שמוצגות (א). עוצמות להקת חלבון עבור M1 ו- NP היו מנורמלות לאלה ב- pH 7.4 בלי NP-40. נתונים מיוצגים כאמצעי ניסויים כפולים ± סטיית תקן (SD). מעובד מתוך סטיופר et al., 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
capsids ויראלי הם קומפלקסים macromolecular metastable. בעוד הרכבה של virions מחייבת encapsidation ועיבוי של הגנום הווירוס, ייזום של הסיבוב הבא של זיהום תלוי פירוק מבנה קפסיד קומפקטי זו. וירוסים התפתחו לנצל מנגנונים תאיים שונים כדי לשלוט על מחזור הציפוי-uncoating, כולל קולטני תאים, מלווה, אנזימים פרוטאוליטים, כוחות פיסיים הניתנים על ידי חלבונים מנועים או helicases וכן pH ומתגים יוניים 26,27. כאן, אנו מתארים גישה במבחנה מבוססת על צנטריפוגה שיפוע גליצרול כדי לבדוק את ההשפעה במיוחד של גורמי קידום פירוק גרעין IAV. הטכניקה ניתן להתאים באופן פוטנציאלי עבור לנתח תהליכי uncoating של וירוסים אפופים אחרים.
באמצעות קולואידים Coomassie, חלבוני IAV המבניים הגדולים M1, NP, ו HA ניתן לאתר בבירור SDS-PAGE אפילו עם partic וירוס קטן יחסיתמספר le. עם זאת, אפיון מעמיק יותר של המבנה קפסיד משקעים והרכבה ידרוש מעקב מנתח, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית (כמו בעבר הציג 28), המערבי סופג, פיזור אור דינאמי או ספקטרומטריית מסה. הארכה נוספת של הפרוטוקול יכולה לכלול חלוקה של השלב גליצרול הנמוך (25%) וניתוח של מרכיבי הליבה הספציפיים.
התאמת שכבת גליצרול התחתונה אל pH ההיתוך האופטימלי של 5.0 (עבור X31) הביאה ניתוק מוחלט כמעט של שכבת מטריקס (איור 2) 16. עם זאת, כ -30% של אות קלט NP עדיין יכולים להיקלט ב- pH זה. יתכן כי בשל העדר של גורמי הסלולר uncoating כלולים בהגדרה זו, כגון deacetylase היסטון זיהה באחרונה 6 (HDAC6) 18, פירוק שלם מתרחש. בתוך התא, החמצה האיטית של הליבה וחשיפה ויראלי למתג מ Na + ל- K + 16. אנחנו לא יכולים לשלול כי ההגדרה שלנו, אבקת הכביסה הלא היונית חלקית משבשת את ליבת החומצה חשופה ומעורערת. עם זאת, אין כל השפעה על הליבה לסדימנטציה ב- pH הניטראלי הוא ציין שמציינת בעוצמות להקת חלבון דומות לעומת דגימות הלא solubilized (איור 2 א, להשוות מסלולי 1 ו -2). אמנם, assay המוצג כאן התברר לשחזור מאוד (וככזה הוא) חזק מספיק עבור כימות להקה, טווח מסוים של וריאציה יכול להיבחן.
השימוש גליצרול בפרוטוקול זה הוא קריטי עבור התוצאה של הניסוי. כפי שדווח בעבר 17, ultracentrifugation באמצעות שיפוע סוכרוז מערער הליבה IAV, אשר צפוי עקב כוח אוסמוטי גבוה נוצר על ידי סוכרוז. טיהור IAV באמצעות הדרגתיים סוכרוז עלולה להפעיל השפעות דומות. לכן השווינו-ביצת גדל X31 נגזרת CL נוזל allantoic arified ומניות מטוהרים סוכרוז. אין הבדל גדול יכול להיבחן ביחס להשפעת pH חומצי על יציבות הליבה (מידע לא מוצג). אף על פי כן, על מנת לשלול תופעות לוואי אפשריות של סוכרוז אוסמוטי הפעיל, אנו ממליצים לבצע את במבחנת assay uncoating עם הבהיר allantoic supernatants תרבית תאים נוזל או מרוכז.
מלבד הבחירה של חומר שיפוע, חשוב לשמור על השלמות של השיפוע לא להשפיע על התנהגות השקיעה של ליבות ויראלי lysed ולהבטיח תוצאות לשחזור. בנוסף, resuspension שלם של השבר גלולה לאחר ultracentrifugation מוביל צפוי לתוצאות שונות. לבסוף, אנו ממליצים בחום התאמת ה- pH של תמיסות בופר המכיל חומר הניקוי באופן אידיאלי באותו היום של הניסוי כמו שינויים קטנים ריכוז יוני עשויים להיות השפעה דרסטית על יציבות ליבת ויראלי.
תוכן "> חשוב לציין כי בהתאם לזן IAV בפרט, יעילות פירוק שונות עלולים לגרום מבוססות על המאפיינים של M1 בהתאמה NP וריאנטים. זה עשוי לחול גם על וירוסי מוטציה. לפיכך, ספי pH עבור שכבת מטריקס vRNP דיסוציאציה צריך להיקבע עבור זן IAV בהתאמה לפני בדיקת השפעות נוספות. לניתוח של תנאים ספציפיים על יציבות ליבה ויראלי אנו ממליצים להתאים את שכבת גליצרול התחתונה לערך pH כך שמחצית מקסימלי פירוק M1 מושג. יתכן כדי לחקור את ההשפעה של יונים ספציפיים או סוכני הפחתה ידי שינוי השכבה המכיל חומר הניקוי בהתאם. גורמי uncoating הסלולר משוערים ניתן להוסיף ישירות שיפוע גליצרול. במקרה של גורמי cytoplasmic, שכבת גליצרול שלישית בתחתית השיפוע יכולה להיות הציג, אשר מותאם pH נייטרלי, מכיל הגורם הסלולר של עניין, והוא ללא חומר ניקוי. בדרך זו, השיפוע תלת שכבתי דואר אפילו לחקות באופן הדוק יותר את המעבר של הנגיף באמצעות מערכת endocytic ושחרור פלחי גנים לתוך הציטופלסמה הניטראלי.יחדיו, אנו מציגים assay חזק אך פשוט במבחנה ללמוד תחול IAV ו uncoating, אשר יש לו את פוטנציאל שינויים צדדיים כדי לענות על שאלות מגוונות בהקשר של כניסת IAV. בנוסף, זה יכול להיות מיושם כדי לחקור תהליכי כניסת וירוסים אפופים אחרים עם מנגנוני uncoating קשורים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים יוהיי Yamauchi ורוברטה מנצ'יני לספק לנו חומרים כימיים. מעבדת AH נתמכה על ידי רשתות ההדרכה הראשוניות מארי קירי (ITN), מועצת המחקר האירופית (ERC), ועל ידי הקרן הלאומית למדע השויצרי (Sinergia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
- de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
- Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
- Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
- White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A.
- Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
- Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
- Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
- Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
- Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
- Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
- Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
- Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
- Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
- Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
- Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
- Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
- Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
- Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
- Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
- Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A.
- Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
- Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).
