Introduction
Influensa A-virus (IAV) är ett höljevirus och tillhör familjen Orthomyxoviridae. Dess gener kodas på en segmenterad, negativ-sense och enkelsträngat RNA-genomet. Hos människor orsakar IAV luftvägsinfektioner, som förekommer i säsong utbrott epidemiska och bär risken för globala pandemier 1. Vid bindning till sialinsyrarester på värdcellytan 2, är IAV internaliseras av clathrin-beroende endocytos och clathrin oberoende vägar 3-8. Den sura miljö (pH <5,5) i de endocytiska vakuoler utlöser en stor konformationsförändring i IAV spik glykoprotein hemagglutinin (HA), vilket resulterar i fusion av det virala och den sena endosomala membranet 9. När väl IAV kapsiden (här även hänvisad till som viral "kärna") har undkommit från sena endosomer (LES), är det inte belagda i cytosolen följt av transport av de virala ribonukleoproteiner (vRNPs) in i kärnan - platsen of virusreplikation och transkription 10-13. Innan syraaktivering av HA viruset upplever en gradvis minskning av pH i den endocytiska systemet, som primär kärnan för dess efterföljande demontering 14-16. I denna "priming" steg M2 jonkanaler i virusmembranet mediera tillströmningen av protoner och K +10,14,16. Förändringen i jonkoncentration i virus inre stör samspelet bygga upp av den virala matrisprotein M1 och åtta vRNP bunten, och underlättar IAV uncoating i cytoplasman efter membranfusion 10,14-17.
Direkt och kvantitativ analys av evakueringssteget har hindrats av det faktum att endosomer är svåra att komma åt experimentellt. Inmatningsprocessen är för övrigt i hög grad icke-synkron. Dessutom har end-point-analyser, såsom QRT-PCR av frigjorda virala RNA eller infektions mätningar, inte ge en detaljerad bild av den biokemiska tillstånd virala Capsid vid varje givet steg av posten. Även störning av endosomer av siRNA eller läkemedelsbehandling har väsentligt bidragit till förståelsen av IAV inträde 18-20,-tuning bra är svårt och benägna att ospecifika biverkningar i hårt kontrollerad endosomen mognad program.
För att undvika dessa problem, har vi anpassat en tidigare utvecklad in vitro-protokoll baserat på användningen av hastighets gradientcentrifugering 17. Till skillnad från andra försök 21,22, 23,24, som oftast var baserade på kombinationer av proteolytisk klyvning och tvättmedel behandling följt av EM analys, detta tillvägagångssätt möjliggjorde en lätt mätbar resultat. Centrifugering genom olika lutning lager tillåter sedimente partiklarna att utsättas för och reagera med förändrade förutsättningar på ett kontrollerat sätt. I den presenterade protokollet, IAV härrörande från klar allantoisvätska eller renade virala partiklar sedimenteras till en två-lagers glycerolgradient i vilken det undre lagret innehåller den icke-joniska detergenten NP-40 (Figur 1). Eftersom viruset kommer in i andra, tvättmedel som innehåller lager, de virus lipid kuvert och kuvert glykoproteiner försiktigt solubiliseras och kvar. Kärnan, som består av den åtta vRNP knippet och omgiven av ett matrisskikt, sediment som en stabil struktur in i pelletfraktionen. Virala kärnproteiner, till exempel M1 och vRNP-associerad nukleoprotein (NP), kan identifieras i pelleten med SDS-PAGE och Coomassie-färgning. I synnerhet dra nytta av kommersiellt tillgängliga gradientgeler och färgning med den mycket känsliga kolloidalt Coomassie 25, möjliggör hög precision och detektion av även små mängder av viruskärn associerade proteiner.
Detta utgör grunden för att testa om olika förhållanden såsom pH, saltkoncentration, och förmodade uncoating faktorer har effekter på sedimenteringsbeteende kärnkomponenter och kärn stabil heten. För detta syfte, är endast den nedre, detergent-innehållande skikt i glycerolgradient modifieras genom införande av faktorn eller ett tillstånd av intresse. Tekniken har varit särskilt värdefullt att utreda effekten av olika pH-värden och saltkoncentrationer på integritet IAV kärnan 16. Mellanliggande steg av IAV uncoating kunde övervakas inkluderande dissociation av matrisskiktet vid milt surt pH (<6,5) följt av vRNP dissociation vid pH 5,5 och lägre 16,17 (Figur 1). Det senare steget förstärktes ytterligare genom närvaron av hög K + koncentration i glycerolskiktet, vilket återspeglar en sen endocytiska miljö 16. Således, eftersom viruset och kärnan sedimente genom gradienten de upplevde en föränderlig miljö som efterliknar förhållandena i endosomer. Resultatet var en stegvis demontering av den virala kärnan in vitro komplement resultat som härrör från cellbiologiska analyser.
t "> Den metod som presenteras här har möjliggjort snabb och mycket reproducerbar analys av IAV (X31 och A / WSN / 33) och IBV (B / Lee / 40) uncoating utlöses av surt pH och öka K +16,17 samt demontering av paramyxovirus kärnor vid alkaliskt pH exponering 17. det är tänkbart att tillvägagångssättet kan anpassas till andra inkapslade virus att få insikt i de biokemiska egenskaperna hos den virala kapsiden struktur och kapsiden demontering under cellinträde.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Buffertar och stamlösningar
- Förbered MNT buffert (20 mM MES, 30 mM Tris och 100 mM NaCl) genom att lösa 470 mg Tris hydroklorid, 390 mg MES hydrat och 580 mg NaCl i 80 ml DDH 2 O. Justera bufferten till pH 7,4 och föra den till en slutlig volym av 100 ml med DDH 2 O.
- Förbered tre identiska lösningar av 500 mM MES-buffert genom upplösning av 9,76 g MES hydrat i 80 ml dH 2 O vardera. Justera buffertarna till pH 5,8, 5,4, och 5,0, respektive, genom att titrera med koncentrerad NaOH. Föra varje buffert till en slutlig volym av 100 ml med dH2O
- Förbered två identiska lösningar av 500 mM Tris-buffert genom upplösning av 7,88 g Tris-hydroklorid i 80 ml dH 2 O vardera och justera pH till 7,4 och 6,4, respektive, genom att titrera med koncentrerad HCl. Bringa buffert till en slutlig volym av 100 ml med dH2O
- Förbered 50% glycerollösning i dH 2 O och rör om väl tills Glycerol är homogent blandade. Filtrera lösningen genom ett Steritop filterenhet (0,22 ^ m porstorlek) i en glasflaska.
- Förbered 10% NP-40-lösning och 1 M NaCl i dH2O
- Förbered 25x koncentrerad proteashämmare genom att lösa två tabletter i 4 ml DDH 2 O.
2. Framställning av glycerolgradienter
- Förbereda 5 ml detergentbuffert Master Mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x koncentrerad proteashämmare) lösning för varje pH-tillstånd som prov (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, och 5,0). För detta ändamål, blanda 9 ml av en M NaCl, 6 ml 10% NP-40, 2,4 ml av inhibitorn lager 25x proteas, och 9 ml DDH 2 0.
- För varje pH skick pipett 4,4 ml av Master Mix till en 50 ml koniska rör.
- För pH-värden över 5,8 till 0,6 ml av respektive pH-justerade 500 mM Tris-stamlösning till röret. För pH 5,8 och lägre lägga 0,6 ml av respektive pH-justerade 500 mM MES stamlösning.
- gör 5ml buffertlösning innehållande 300 mM NaCl, 2x proteasinhibitor, 60 mM Tris justerad till pH 7,4 och DDH 2 O. Detta kommer att fungera som detergent-fri kontroll gradient buffert.
- Om nödvändigt, fine-justera pH hos lösningarna till pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, och 5,0 genom tillsats av koncentrerad HCl eller NaOH-lösningar, respektive.
- Tillsätt 5 ml av 50% glycerol lager till 5 ml av tvätt innehållande och tvättmedelsfria buffertblandningar resulterar i sex olika 25% glycerollösningar. Kontrollera pH-värden med hjälp av pH-indikatorremsor.
OBS: Om det uppmätta pH skiljer sig avsevärt från det önskade värdet, bör respektive lösningar beredas på nytt. - Förbered 15% glycerollösning genom att blanda 50% glycerol lager med dH 2 O i en 3: 7-förhållande.
3. Ultracentrifugering av IAV
- Tillsätt 3 ml 15% glycerollösning i ultra-klara centrifugrör (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) med hjälp av en 5 ml spruta och en needle (21 G, 9 cm lång). Lämna inte droppar vid den inre väggen av röret då detta kan störa integriteten av gradienten. Upprepa detta för totalt sex centrifugeringsrören, ett för var och en av de fem pH-betingelser för att testa och ett för kontrollprovet.
- Placera försiktigt 3,4 ml 25% glycerollösning under 15% glycerol lager med hjälp av en ml spruta 5 och en lång nål. Var noga med att inte blanda de två lagren. Upprepa detta för alla sex förutsättningar för att testa med respektive pH-justerade glycerollösningar.
OBS: Arbete i klass II biosäkerhet skåp för följande steg. - overlay försiktigt glycerolgradienter med 30 pl klar allantoisvätska innehållande IAV (X31, H3N2) utspädd i en ml MNT buffert (motsvarar cirka 20-30 pg av totalt viralt protein) för varje gradient.
- Balans motsatta rör och placera dem i en SW41 ultracentrifugering rotor. Centrifugera i 150 min, vid 55000 x g, och 12 ° C.
- Efter centrifugering, noggrantAvlägsna supernatanten, det vill säga både glycerolskikt med en ren Pasteur pipett och en suganordning. Återsuspendera pelleten i 40 | j, l (1x) icke-reducerande prov LDS buffert. Det är viktigt att pipettera upp och ned flera gånger för att lösa upp pelleten fullständigt. Överföra provet i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
4. SDS-PAGE av pellets Bråk och Coomassie färgning
- Värma upp alla prover vid 95 ° C under 10 min. Vid denna punkt proven kunde lagras vid -20 ° C tills de analyseras med SDS-PAGE.
- Belastning 20 pl av de upplösta pelletsen på en pre-cast-gradient (4-12%) bis-Tris mini-gel och kördes under 1 h vid 200 V i 1 x MOPS SDS löpbufferten.
- Göra fixeringslösning med 40% metanol och 10% isättika i DDH 2 O.
- Inkubera gelen i fixeringslösning under 1 timme och färga över natten i en 15 cm cellodlingsskål med en tillräcklig volym av kolloidalt Coomassie lösning medan försiktigtskakning vid rumstemperatur.
OBS: Det är viktigt att stänga skålen för att undvika avdunstning av färglösningen. - Avfärgning gelén i DDH 2 O. Byt DDH 2 O varje 15-20 min tills gelén bakgrunden blir klar. Förvara gelen i DDH 2 O vid 4 ° C tills den skannas för band kvantifiering.
- Skanna gelen med hög upplösning och använda kommersiellt tillgängliga eller skräddarsydd mjukvara för kvantifiering av protein bandintensiteter. Subtrahera bakgrundssignalen från ett område nära respektive band och normalisera dessa värden till de tvättmedelsfria kontrollprover (vid pH 7,4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som redan diskuterats, priming i endosomer krävs för att göra IAV kärnan uncoating kompetent. Protonering av kärnan försvagar interaktionen av M1 och vRNPs (bestående av det virala RNA, NP, och polymeraset komplex PB1 / PB2 / PA). Denna process initieras när inkommande viruset utsätts för ett pH av 6,5 (eller lägre) i tidiga endosomer (EES) och fortsätter tills viruset säkringar vid omkring pH 5,0 i LES.
I syfte att efterlikna den minskning av pH, var bottenskiktet av de glycerolgradienter justeras till värden mellan pH 7,4 och 5,0 vid en konstant saltkoncentration. X31 härleds från klar allantoisvätska underkastades hastighetsgradient centrifugering och analyserades genom SDS-PAGE (figur 2A, B). Utan tvättmedel närvarande i gradienten (figur 2A, lane1) intakta virioner pelleteras, såsom återspeglas av det karakteristiska mönstret förband som representerar HA (HA1 och HA2, 63 kDa), NP (56 kDa), och M1 (27 kDa) i Coomassie-färgade gelén. Eftersom gelén kördes under icke-reducerande betingelser, är proteolytiskt klyvs HA1 och HA2 fortfarande förbundna genom disulfidbindningar och kördes vid ungefär 64 kDa. Under reducerande betingelser banden motsvarande HA1 och HA2 förefaller mycket nära de NP- och M1-banden, respektive, vilket gör det svårt att troget tolka och fastställa bandintensiteter som enbart är härledda från den virala kärnan (Figur 2B).
Vid tillsats av NP-40 till botten (25%) glycerol skikt virushöljet inklusive HA, NA, och M2 solubiliserades och den virala kärnan ensam sedimente in i pelleten under ultracentrifugering (figur 1; figur 2, bana 2). Börjar med ett pH under 6,5, är M1 gradvis förloras från pelletfraktionen, och nådde ett minimum mellan pH 5,8 och 5,4 (Figur2A, B). Under pH 5,8 vRNPs dissocierades och sålunda förloras från pelleten. Tidigare har det visats att, i själva verket är hela vRNPs släpps ut i det övre skiktet, eftersom deras frisättning korrelerade med förlusten av PB2 från pelletfraktionen 16. Protein bandintensiteter bestämdes, avslöjar två distinkta pH-trösklar för demontering av M1 skiktet och dissociation av vRNP buntar, respektive (figur 2). Ytterligare band kunde observeras på gelén, som kan motsvara den polymerasproteiner PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa), och M2 (11 kDa). På grund av deras lägre kopietal inne IAV virioner vi kunde inte tillförlitligt sätt fastställa deras identitet och de därför inte beaktas för kvantifiering.
Figur 1: Schematisk representation av IAV 
Figur 2: IAV kärna demontering in vitro vid surgöring (A) In vitro isärtagning av X31 kärnor vid olika pH-förhållanden i det nedre glycerolskiktet.. Som en kontroll, var NP-40 utelämnas från bottenglycerolskiktet (första bana). Prover separerades genom SDS-PAGE under icke-reducerande betingelser följt av Coomassie-färgning. Viral proteinband indikeras till höger. (B) Densitometrisk kvantifiering av intensiteterna av viral proteinband som visas i (A). Proteinband nivåerna för M1 och NP normaliserades till dem vid pH 7,4 utan NP-40. Data representeras som medel för dubbla experiment ± standardavvikelse (SD). Anpassad från Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Virala kapsider är metastabila makromolekylära komplex. Även montering av virioner kräver inkapsling och kondensering av virusgenomet, inledningen av nästa omgång av infektion beror på demontering av denna kompakta kapsid struktur. Virus har utvecklats till att utnyttja olika cellulära mekanismer för att styra beläggnings uncoating cykel, inklusive cellulära receptorer, chaperones, proteolytiska enzymer, fysiska krafter som tillhandahålls av motorproteiner eller helikaser samt pH och joniska omkopplare 26,27. Här beskriver vi en in vitro-metod som bygger på en glycerol gradientcentrifugering för att specifikt testa effekten av faktorer som främjar demontering av IAV kärnan. Tekniken kan potentiellt anpassad för dissekera uncoating processer för andra virus med höljen.
Genom att använda kolloidal Coomassie, de stora strukturella IAV proteiner M1, NP, och HA kan tydligt detekteras i SDS-PAGE även med en relativt liten virus particle nummer. Men en mer djupgående karakterisering av sedimente kapsid struktur och dess sammansättning skulle kräva uppföljning analyser, såsom elektronmikroskopi (som tidigare presenterats 28), Western blotting, dynamisk ljusspridning eller masspektrometri. Ytterligare förlängning av protokollet kan inkludera fraktionering av den lägre (25%) glycerol fas och analys av de specifika kärnkomponenter.
Justering av det undre glycerolskiktet till den optimala fusions pH av 5,0 (för X31) ledde till en nästan fullständig dissociation av matrislagret (figur 2) 16. Emellertid kan omkring 30% av den ingående NP-signalen fortfarande detekteras vid detta pH. Det är möjligt att på grund av avsaknaden av cellulära uncoating faktorer i denna inställning, såsom nyligen identifierat histondeacetylas 6 (HDAC6) 18, sker ofullständig demontering. Inne i cellen, till långsam försurning av den virala kärnan och exponering för en övergång från Na + K + 16. Vi kan inte utesluta att i vår inställning, den icke-joniska detergenten stör delvis syra exponerade och destabiliseras kärnan. Emellertid är ingen effekt på kärnan sedimente vid neutralt pH observeras indikeras genom liknande protein bandintensiteter jämfört med icke-solubiliserade prover (figur 2A, jämför bana 1 och 2). Även om, analysen presenteras här visat sig vara mycket reproducerbar och (som sådan är) robust nog för bandet kvantifiering, kunde observeras en viss variationsbredd.
Användningen av glycerol i detta protokoll är avgörande för resultatet av försöket. Såsom tidigare rapporterats 17, ultracentrifugering genom en sackarosgradient destabiliserar IAV kärnan, vilket sannolikt beror på en hög osmotisk kraft som skapas av sackaros. Rening av IAV via sackarosgradienter kan utöva liknande effekter. Därför jämfört vi ägg odlade X31 härrör från cl arified allantoisvätska och sackaros-renad bestånd. Ingen större skillnad kunde observeras med avseende på inverkan av surt pH på kärn stabilitet (data ej visade). Men för att utesluta eventuella biverkningar av osmotiskt aktiva sackaros, rekommenderar vi att utföra in vitro uncoating analys med klar allantoisvätska eller koncentrerade cellkultursupernatanter.
Förutom valet av lutning material, är det viktigt att behålla integriteten av gradienten att inte påverka sedimenteringsbeteende de lyserade virala kärnor och säkerställa reproducerbara resultat. Dessutom leder ofullständig resuspension av pelleten fraktionen efter ultracentrifugering sannolikt att olika resultat. Slutligen rekommenderar vi starkt att justera pH i tvätt innehållande buffertlösningar helst på samma dag av experimentet som små förändringar i jonkoncentration kan ha en dramatisk effekt på den virala bålstabilitet.
innehåll "> Det är viktigt att notera att beroende på den särskilda IAV stammen kan olika demonterings effektivitet ske baserat på egenskaperna hos respektive M1 och NP varianter. Det kan också gälla för muterade virus. Således pH trösklar för matrisskiktet och vRNP dissociation måste bestämmas för respektive IAV stammen innan du testar ytterligare påverkan. för analysen av särskilda villkor för viral bålstabilitet föreslår vi att justera bottenglycerolskiktet till ett pH-värde så att hälften av den maximala demontering av M1 uppnås. det är möjligt för att undersöka inverkan av specifika joner eller reduktionsmedel genom modifiering av detergent-innehållande skikt i enlighet därmed. Förmodade cellulära uncoating faktorer kan tillsättas direkt till den glycerolgradient. vid cytoplasmiska faktorer, kan ett tredje glycerolskikt vid botten av gradienten vara införts, vilken justeras till neutralt pH, innehåller den cellulära faktorn av intresse, och är fri från tvättmedel. på detta sätt, the tre-skikt gradient skulle ännu närmare härma passagen av virusen genom den endocytiska systemet och frisättning av gensegmenten i neutral cytoplasman.Sammantaget presenterar vi en robust men ändå enkel in vitro-analys för att studera IAV sugande och uncoating, som har potential för mångsidig ändringar för att ta itu med olika frågor inom ramen för IAV inträde. Dessutom kan den användas för att undersöka inträdesprocesser för andra inkapslade virus med tillhörande uncoating mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Yohei Yamauchi och Roberta Mancini för att förse oss med reagens. AH laboratorium stöddes av Marie Curie Initial Training Networks (ITN), European Research Council (ERC) och av den schweiziska National Science Foundation (Sinergia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
- de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
- Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
- Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
- White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A.
- Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
- Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
- Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
- Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
- Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
- Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
- Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
- Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
- Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
- Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
- Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
- Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
- Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
- Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
- Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
- Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A.
- Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
- Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).
