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Immunology and Infection

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Published: March 27, 2016 doi: 10.3791/53909
Automatic Translation
1,2, 3, 1
1Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 2Department of Biochemistry, University of Zurich, 3Institute for Molecular Health Sciences, ETH Zurich

Introduction

Influenza - A - Virus (IAV) ist ein umhülltes Virus und gehört zur Familie der Orthomyxoviridae. Seine Gene codiert sind auf einem segmentierten, Negativ-sense und einzelsträngige RNA-Genom. Beim Menschen verursacht IAV Infektionen der Atemwege, die 1 für die globale Pandemien saisonalen Epidemien und trägt das Potential auftreten. Nach Bindung an Sialinsäure-Reste auf der Zelloberfläche 2 wird IAV internalisiert von Clathrin-abhängige Endozytose und Clathrin-unabhängige Wege 3-8. Das saure Milieu (pH <5,5) in den endozytischen Vakuolen löst eine große Konformationsänderung des IAV - Spike - Glykoprotein - Hämagglutinin (HA), die in Fusion des viralen Ergebnisse und die späten endosomalen Membran 9. Sobald die IAV Kapsid (hier auch als virale "Kern" bezeichnet) wurde von späten Endosomen (LEs) entkommen, es in das Cytosol unbeschichtet wird durch den Transport der viralen Ribonukleoproteine ​​gefolgt (vRNPs) in den Kern - die Seite of Virus - Replikation und Transkription 13.10. Vor der Säureaktivierung von HA erfährt das Virus eine allmähliche Abnahme der pH - Wert im endozytischen System, das den Kern für seine spätere Demontage 14-16 Primzahlen. In dieser "Priming" die M2 - Ionenkanäle in der viralen Membran Schritt vermitteln den Zustrom von Protonen und K +10,14,16. Die Veränderung der Ionenkonzentration in dem Virus Innenraum stört die Wechselwirkungen durch das virale Matrix - Protein aufbauen M1 und dem acht vRNP Bündel und erleichtert IAV uncoating im Zytoplasma folgende Membranfusion 10,14-17.

Direkte und quantitative Analyse des Priming-Schritt wurde durch die Tatsache erschwert, dass Endosomen schwer experimentell zuzugreifen. Der Eingabeprozess ist außerdem stark nichtsynchron. Zusätzlich Endpunktassays, wie qRT-PCR von freigesetzten viralen RNA oder Infektiosität Messungen bieten nicht ein genaues Bild über die biochemischen Zustand des viralen capsid zu einem bestimmten Schritt des Eintrages. Während Störung von Endosomen durch siRNA oder medikamentöse Behandlung wesentlich zum Verständnis der IAV Eintrag beigetragen hat 18-20, Feinabstimmung ist schwierig und anfällig für unspezifische Nebenwirkungen in der streng kontrollierten endosome Reifung Programm.

Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine bisher entwickelten in vitro - Protokoll auf der Verwendung von Geschwindigkeits Gradientenzentrifugation 17 basierend angepasst. Im Gegensatz zu anderen Versuchen , 21,22, 23,24, die auf Kombinationen von proteolytischen Spaltung und Detergens - Behandlung meist auf Basis wurden von EM - Analyse verfolgt, ermöglicht dieser Ansatz eine leicht quantifizierbar Ergebnis. Zentrifugation durch verschiedene Gradientenschichten ermöglicht die sedimentierenden Teilchen ausgesetzt werden und reagieren mit den Bedingungen in einer kontrollierten Weise zu verändern. In dem vorgestellten Protokoll IAV abgeleitet von geklärten Allantoisflüssigkeit oder gereinigter Viruspartikel werden in einer zweischichtigen Glycerin sedimentiertGradienten in dem die untere Schicht enthält den nicht-ionischen Detergens NP-40 (Abbildung 1). Da das Virus das zweite, Waschmittel enthaltende Schicht ein, so werden die viralen Lipidhülle und Hüll-Glycoproteine ​​sanft löslich gemacht und hinter sich gelassen. Der Kern, der sich aus den acht vRNP Bündels und durch eine Matrixschicht, Sedimenten als eine stabile Struktur, in der Pelletfraktion umgeben. Virale Kernproteine, wie beispielsweise M1 und vRNP assoziiertes Nukleoprotein (NP), können in dem Pellet durch SDS-PAGE und Coomassie-Färbung identifiziert werden. Insbesondere Vorteil handelsüblichen Gradientengelen unter und Färbung mit dem hochempfindlichen kolloidalen Coomassie 25, ermöglicht eine hohe Genauigkeit und Erfassung von sogar kleinen Mengen der viralen Core-assoziierten Proteinen.

Dies stellt die Grundlage für die Prüfung, ob verschiedene Bedingungen wie pH-Wert, Salzkonzentration und mutmaßliche uncoating Faktoren haben Auswirkungen auf das Sedimentationsverhalten von Kernkomponenten und Kern stabil keit. Zu diesem Zweck nur die untere, waschmittelhaltigen Schicht in dem Glycerol-Gradient wird durch die Einführung des Faktors oder der Zustand von Interesse modifiziert. Die Technik ist besonders wertvoll, die Wirkung von verschiedenen pH - Werten und Salzkonzentrationen auf die Integrität des IAV Kern 16 in die Untersuchung. Zwischenschritte des IAV uncoating könnte einschließlich Dissoziation der Matrixschicht anschließend bei leicht sauren pH (<6,5) bei einem pH von 5,5 vRNP Dissoziation überwacht und unteren 16,17 (Abbildung 1). Der letztere Schritt wurde durch die Anwesenheit von hohen K + -Konzentration in der Glycerinschicht verstärkt, einen späten endozytotischen Umgebung widerspiegelt 16. Somit ist, wie das Virus, und der Kern durch den Gradienten sedimentiert erfahren sie einen wechselnden Milieu, das nachahmt Bedingungen in Endosomen. Das Ergebnis war eine schrittweise Demontage des viralen Kern in vitro als Ergänzung Ergebnisse abgeleitet von der Zellbiologie - Assays.

t "> Das hier dargestellte Verfahren hat sich schnell aktiviert und hoch reproduzierbare Analyse von IAV (X31 und A / WSN / 33) und IBV (B / Lee / 40) durch sauren pH - Wert ausgelöst uncoating und K +16,17 sowie Demontage zu erhöhen von Paramyxovirus Kerne bei alkalischen pH - Exposition 17. Es ist denkbar, dass der Ansatz kann auch auf andere umhüllte Viren angepasst werden Einblicke in die biochemischen Eigenschaften des viralen Kapsids Struktur und Kapsid Demontage während Zelleintritt zu gewinnen.

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Protocol

1. Herstellung von Puffer und Stammlösungen

  1. Bereiten MNT - Puffer (20 mM MES, 30 mM Tris und 100 mM NaCl) durch Auflösen von 470 mg Tris - Hydrochlorid, 390 mg MES - ​​Hydrat und 580 mg NaCl in 80 ml ​​ddH 2 O. Stellen Sie den Puffer auf pH 7,4 und bringt es auf ein Endvolumen von 100 ml mit ddH 2 O.
  2. Bereiten Sie drei identische Lösungen von 500 mM MES - ​​Puffer durch Auflösen von 9,76 g MES - ​​Hydrat in 80 ml ​​dH 2 O je. Stellen Sie die Puffer pH 5,8, 5,4 und 5,0 jeweils durch mit konzentrierter NaOH titriert. Bringen jeder Puffer auf ein Endvolumen von 100 ml mit dH 2 O.
  3. Bereiten zwei identische Lösungen von 500 mM Tris - Puffer durch Lösen von 7,88 g Tris - Hydrochlorid in 80 ml ​​dH 2 O und jeweils den pH - Wert auf 7,4 und 6,4 jeweils durch mit konzentrierter HCI titriert. Bringen Sie den Puffer zu einem Endvolumen von 100 ml mit dH 2 O.
  4. Bereiten Sie 50% Glycerin - Lösung in dH 2 O und gut umrühren , bis die glycerol ist homogen vermischt. Filtern der Lösung durch eine Steritop Filtereinheit (0,22 um Porengrße) in eine Glasflasche.
  5. Herstellung von 10% NP-40 - Lösung und 1 M NaCl in dH 2 O.
  6. Bereiten 25x konzentrierter Protease - Inhibitor durch Auflösen von zwei Tabletten in 4 ml ddH 2 O.

2. Herstellung von Glycerol Gradients

  1. Bereiten 5 ml Detergenspuffer Master Mix (300 mM NaCl, 2% NP-40, 2x konzentrierte Proteaseinhibitor) -Lösung für jeden pH Zustand Test (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 und 5,0). Zu diesem Zweck mischen 9 ml 1 M NaCl, 6 ml 10% NP-40, 2,4 ml des 25x - Protease - Inhibitor Lager, und 9 ml ddH 2 0.
  2. Für jeden pH Zustand Pipette 4,4 ml der Master-Mix in einem 50 ml konischen Röhrchen.
  3. Für die pH-Werte über 5,8 addieren 0,6 ml des jeweiligen pH-Wert eingestellten 500 mM Tris-Stammlösung in das Röhrchen. Für pH 5,8 und niedriger 0,6 ml des jeweiligen pH-Wert eingestellten 500 mM MES-Stammlösung hinzufügen.
  4. Machen 5ml Pufferlösung , enthaltend 300 mM NaCl, 2x - Protease - Inhibitor, 60 mM Tris 7,4 und ddH 2 O auf pH Dies wird als Waschmittel freie Steuerung Gradientenpuffer dienen.
  5. Falls erforderlich, Feineinstellung der pH der Lösungen auf einen pH von 7,4, 6,4, 5,8, 5,4 und 5,0 durch Zugabe von konzentrierter HCl oder NaOH Lösungen, respectively.
  6. 5 ml 50% Glycerin-Stamm bis 5 ml der Waschmittelhaltigen und waschmittelfreie Puffergemische was zu sechs verschiedenen 25% Glycerinlösungen. Überprüfen Sie die pH-Werte von pH-Indikatorstreifen verwendet wird.
    HINWEIS: Falls der gemessene pH-Wert signifikant von dem Sollwert abweicht, sollten die jeweiligen Lösungen wieder hergestellt werden.
  7. Vorbereitung 15% Glycerin - Lösung von 50% Glycerin - Vorrats Mischen mit dH 2 O in einem 3: 7 - Verhältnis.

3. Ultrazentrifugation von IAV

  1. 3 ml 15% Glycerin-Lösung in extrem klar Zentrifugenröhrchen (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) durch eine 5 ml-Spritze und ein neeDLE (21 G, 9 cm lang). Nicht Tropfen an der Innenwand des Rohres lassen, da dies die Integrität des Gradienten stören. Wiederholen Sie dies für insgesamt sechs Zentrifugenröhrchen, eine für jede der fünf pH-Bedingungen zu testen, und eine für die Kontrollprobe.
  2. Vorsichtig 3,4 ml 25% Glycerin-Lösung unter der Schicht 15% Glycerin durch eine 5-ml-Spritze und eine lange Nadel. Achten Sie darauf, nicht auf die beiden Schichten mischen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle sechs Bedingungen mit den jeweiligen pH-Wert eingestellten Glycerinlösungen zu testen.
    HINWEIS: Die Arbeit in der Klasse II Biosicherheitswerkbank für die folgenden Schritte.
  3. Overlay sanft die Glycerol-Gradienten mit 30 ul geklärten Allantoisflüssigkeit enthält IAV (X31, H3N2) in 1 ml MNT-Puffer verdünnt (entspricht etwa 20-30 ug Gesamt-Virusprotein) für jeden Gradienten.
  4. Gleichgewicht gegenüberliegenden Röhren und legen Sie sie in einen SW41 Ultrazentrifugation Rotor. Zentrifuge für 150 min bei 55.000 xg und 12 ° C.
  5. Nach der Zentrifugation sorgfältigÜberstand verwerfen, dh sowohl Glycerol Schichten durch eine saubere Pasteur - Pipette und eine Saugvorrichtung verwendet. Das Pellet in 40 & mgr; l (1x) nicht reduzierende Puffer LDS Probe. Es ist wichtig zu pipettieren und mehrmals über das Pellet vollständig aufzulösen. Übertragen Sie die Probe in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

4. SDS-PAGE von Pelletfraktionen und Coomassie-Färbung

  1. Erhitzen alle Proben bei 95 ° C für 10 min. An diesem Punkt können die Proben bei -20 ° C gelagert werden, bis sie durch SDS-PAGE analysiert.
  2. Last 20 ul der gelösten Pellets auf einen vorgegossenen Gradienten (4-12%) Bis-Tris-Gel mini und laufen für 1 Stunde bei 200 V in 1x SDS MOPS Laufpuffer.
  3. Machen Fixierungslösung mit 40% Methanol und 10% Eisessig in ddH 2 O.
  4. Inkubieren Sie das Gel in Fixierungslösung für 1 Stunde und über Nacht in einer 15 cm Zellkulturschale mit einem ausreichenden Volumen von kolloidalem Coomassie Lösung färben, während sanftSchütteln bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Es ist wichtig, die Schale zu vermeiden, um die Verdampfung des Färbelösung zu schließen.
  5. Entfärben des Gels in ddH 2 O. Tauschen Sie die ddH 2 O alle 15-20 min , bis das Gel Hintergrund deutlich wird. Lagern Sie das Gel in ddH 2 O bei 4 ° C bis zur Band Quantifizierung abgetastet wird.
  6. Scannen Sie das Gel mit hoher Auflösung und verwenden im Handel erhältlich oder maßgeschneiderte Software für die Quantifizierung von Proteinbandenintensitäten. Subtrahieren des Hintergrundsignals von einem Bereich nahe den jeweiligen Bändern und normalisieren diese Werte an die detergensfreien Kontrollproben (bei pH 7,4).

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Representative Results

Wie bereits diskutiert, in Endosomen Grundierung erforderlich, um die IAV Kern uncoating kompetent zu machen. Protonierung des Kerns schwächt Wechselwirkung von M1 und vRNPs (zusammengesetzt aus den viralen RNA, NP und die Polymerase-Komplex PB1 / PB2 / PA). Dieser Prozess wird eingeleitet, wenn ankommende Virus zu einem pH-Wert von 6,5 ausgesetzt (oder niedriger) in frühen Endosomen (EBS) und wird fortgesetzt, bis die Virus-Sicherungen bei etwa pH 5,0 in LEs.

Um zwischen pH 7,4 und 5,0 bei einer konstanten Salzkonzentration die Abnahme des pH-Werts, die untere Schicht des Glycerins Gradienten wurden auf Werte eingestellt nachzuahmen. X31 von geklärten Allantoisflüssigkeit abgeleitet wurde einer Geschwindigkeit Gradientenzentrifugation und durch SDS-PAGE (2A, B). Ohne Reinigungsmittel , die in dem Gradienten (2A, lane1) sind intakte Virionen pelletiert, wie durch die Kennmuster reflektiert vonBands repräsentieren HA (HA1 und HA2; 63 kDa), NP (56 kDa) und M1 (27 kDa) in der Coomassie gefärbten Gel. Da das Gel unter nicht-reduzierenden Bedingungen laufen gelassen wurde, proteolytisch gespalten HA1 und HA2 noch durch Disulfidbrücken verbunden ist, und bei etwa 64 kDa laufen. Unter reduzierenden Bedingungen würden die Bänder zu HA1 und HA2 entsprechenden erscheinen sehr nahe an den NP und M1 Bands bzw. es schwierig macht , zu treu interpretieren und Bandenintensitäten bestimmen , die allein aus dem viralen Kern (2B) abgeleitet werden.

Bei Zugabe von NP-40 auf den Grund (25%) Glycerin Schicht der Virushülle einschließlich HA, NA und M2 wurden solubilisiert und die viralen Kern allein sedimentiert in das Pellet während Ultrazentrifugation (Abbildung 1, Figur 2, Spur 2). Beginnend mit einem pH - Wert unter 6,5, wird M1 allmählich von der Pelletfraktion verloren, die mindestens zwischen pH 5,8 und 5,4 (Abbildung Erreichen2A, B). Unterhalb von pH 5,8 wurden vRNPs dissoziiert und so vom Pellet verloren. Zuvor wurde gezeigt , dass in der Tat, sind ganze vRNPs in die obere Schicht gelöst, da ihre Freisetzung 16 mit dem Verlust von PB2 von der Pelletfraktion korreliert. Proteinbandenintensitäten wurden bestimmt und enthüllt zwei unterschiedliche pH - Schwellenwerte für die Demontage der M1 - Schicht und Dissoziation von vRNP Bündel, bzw. (Abbildung 2). Zusätzliche Bänder können auf dem Gel beobachtet werden, die mit der Polymerase-Proteine ​​PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa) und M2 (11 kDa) entsprechen könnte. Aufgrund ihrer geringeren Kopienzahlen innerhalb der IAV Virionen konnten wir nicht zuverlässig ihre Identität festzustellen und sie wurden daher nicht in Betracht für die Quantifizierung genommen.

Abbildung 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des IAV In - vitro - Kern Abbau - Test. Kurz gesagt, werden gereinigte Viruspartikel auf einem zweistufigen Glycerol-Gradienten geladen. Die untere Schicht enthält das Detergens NP-40 und wird auf den gewünschten pH-Wert und Salzkonzentration eingestellt, während die obere, waschmittelfreien Schicht auf einem konstanten pH-Wert und Salzkonzentration gehalten. Je nach dem Zustand in der unteren Schicht Glycerin, vollständige virale Kerne sedimentieren auf den Boden (1) oder dissoziiert werden und verbleiben in der Glycerinschicht (2). Neutralen pH-Wert führt zu einer Sedimentation von intakten viralen Kernen besteht aus M1 und vRNPs. Günstige Bedingungen für uncoating, wie saure pH-Wert (5,0), resultiert in der Dissoziation der viralen Kernkomponenten und damit Verlust aus der Pelletfraktion. Nach Ultrazentrifugation werden Glycerin Überstände entfernt und Pellets durch SDS-PAGE analysiert werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. p>

Figur 2
Abbildung 2: IAV Kern Zerlegung in vitro auf die Versauerung (A) In - vitro - Demontage von X31 Kerne bei verschiedenen pH - Bedingungen in der unteren Schicht Glycerin.. Als Kontrolle NP-40 wurde von der unteren Glycerinschicht (erste Spur) weggelassen. Proben wurden durch SDS-PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen, gefolgt von Coomassie-Färbung aufgetrennt. Virale Proteinbanden sind auf der rechten Seite angegeben. (B) Densitometrische Quantifizierung der Intensitäten der viralen Proteinbanden in (A) gezeigt ist . Proteinbandenintensitäten für M1 und NP wurden bei pH 7,4 auf diejenigen normalisierten ohne NP-40. Die Daten werden als Mittel von doppelten Experimenten ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Angepasst von Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Virale Capside sind metastabile makromolekularer Komplexe. Während Zusammenbau von Virionen, die Einkapselung und Kondensieren des Virusgenoms erfordert, hängt Einleitung der nächsten Runde der Infektion auf die Demontage dieser kompakten Kapsidstruktur. Viren entwickelt haben verschiedene zelluläre Mechanismen zu nutzen , um die Beschichtung-uncoating Zyklus zu steuern, einschließlich der zellulären Rezeptoren, Chaperone, proteolytischen Enzymen, physikalische bereitgestellt Kräfte , die durch Motorproteine ​​oder Helikasen sowie pH und Ionen Schalter 26,27. Hier beschreiben wir ein in vitro - Ansatz basiert auf einem Glycerol - Gradientenzentrifugation spezifisch die Wirkung von Faktoren zu testen , die Demontage des Kerns IAV fördern. Die Technik kann potentiell zum Präparieren uncoating Prozesse anderer umhüllten Viren angepasst sein.

Durch die Verwendung von kolloidalem Coomassie, die wichtigsten strukturellen IAV Proteine ​​M1, NP und HA deutlich sogar mit einem relativ kleinen Virus partic in SDS-PAGE nachgewiesen werdenle Nummer. Noch eine weitergehende Charakterisierung der sedimentierten Kapsidstruktur und seine Zusammensetzung erfordern würde Follow-up - Analysen, wie beispielsweise Elektronenmikroskopie (wie zuvor 28 dargestellt), Western Blotting, dynamische Lichtstreuung oder Massenspektrometrie. Weitere Erweiterung des Protokolls könnte Fraktionierung des unteren (25%) Glycerinphase und Analyse der spezifischen Kernkomponenten umfassen.

Einstellung der unteren Glycerinschicht auf die optimale Fusions pH von 5,0 (für X31) führte zu einer fast vollständigen Dissoziation der Matrixschicht (2) 16. Jedoch etwa 30% des Eingangs NP Signal kann immer noch bei diesem pH nachgewiesen werden. Es ist möglich , dass aufgrund des Fehlens von zellulärer uncoating Faktoren in dieser Konfiguration wie kürzlich identifizierten Histon - Deacetylase 6 (HDAC6) 18, unvollständige Demontage auftritt. Langsame Ansäuerung des viralen Kern und der Exposition gegenüber einem Wechsel von Na + Innerhalb der Zelle zu K + 16 Faktoren. Wir können nicht ausschließen, daß in unserem Aufbau, der nichtionische Detergens stört teilweise die Säure-exponierten und destabilisiert Kern. Keine Wirkung auf den Kern jedoch bei neutralem pH sedimentierenden wird durch ähnliche Proteinbandenintensitäten auf nicht-solubilisierten Proben im Vergleich angegeben beobachtet (2A, vergleiche Spuren 1 und 2). Obwohl stellte der Test hier erwies sich als sehr gut reproduzierbar und (als solche) robust genug für Band Quantifizierung, eine gewisse Variationsbreite beobachtet werden konnte.

Die Verwendung von Glycerin in diesem Protokoll ist für das Ergebnis des Experimentes kritisch. Wie zuvor berichtet , 17, Ultrazentrifugation durch einen Saccharosegradienten destabilisiert das IAV - Kern, der durch Saccharose erzeugt aufgrund eines hohen osmotischen Kraft wahrscheinlich ist. Reinigung von IAV über Saccharosegradienten könnten ähnliche Effekte ausüben. Daher verglichen wir-Ei gewachsen X31 von cl abgeleitet arified Allantoisflüssigkeit und Saccharose-gereinigte Aktien. Keinen großen Unterschied in Bezug auf den Einfluss von saurem pH-Wert auf die Kernstabilität beobachtet werden konnte (Daten nicht gezeigt). Um jedoch mögliche Nebenwirkungen des osmotisch aktive Saccharose auszuschließen, empfehlen wir die Durchführung der in vitro uncoating Assay mit geklärter Allantoisflüssigkeit oder konzentrierten Zellkulturüberstand.

Neben der Auswahl der Gradientenwerkstoff ist es wichtig, die Integrität des Gradienten zu halten, um nicht das Sedimentationsverhalten der lysierten viralen Kerne beeinflussen und reproduzierbare Ergebnisse sicherzustellen. Außerdem führt unvollständig Resuspension der Pelletfraktion nach Ultrazentrifugation wahrscheinlich zu unterschiedlichen Ergebnissen. Schließlich empfehlen wir den pH-Wert der Detergenz-haltigen Pufferlösungen idealerweise am selben Tag des Experiments als kleine Änderungen der Ionenkonzentration Anpassung könnte eine drastische Wirkung auf die Viruskernstabilität aufweisen.

content "> Es ist wichtig, dass abhängig von der speziellen IAV-Stamm, unterschiedliche Demontage Effizienzen auf die Eigenschaften des jeweiligen M1 und NP-Varianten auftreten. Grundlage beachten Dies könnte auch für die mutanten Viren anzuwenden. So pH Schwellenwerte für die Matrixschicht und vRNP Dissoziation haben vor der Prüfung zusätzliche Einflüsse bestimmt für die jeweilige IAV-Stamm werden. für die Analyse der spezifischen Bedingungen auf viralen Kernstabilität wir den Boden Glycerinschicht auf einen pH-Wert Einstellung vorschlagen, so dass die Hälfte der maximalen Abbau von M1 erreicht wird. Es ist möglich, den Einfluss von spezifischen Ionen oder Reduktionsmitteln zu untersuchen, indem die Reinigungsmittel enthaltende Schicht entsprechend zu modifizieren. Putative zellulären uncoating Faktoren direkt an den Glycerin Gradienten zugegeben werden. im Falle einer cytoplasmatischen Faktoren eine dritte Glycerinschicht am Boden des Gradienten könnte eingebracht, die auf einen neutralen pH-Wert eingestellt ist, enthält das zelluläre Faktor von Interesse, und von Detergens frei. auf diese Weise the dreischichtige Gradienten würde sogar nachahmen enger die Passage des Virus über die endozytischen System und Freisetzung von Genabschnitten in den neutralen Zytoplasma.

Zusammengenommen stellen wir eine robuste und dennoch einfach in - vitro - Test IAV - Grundierung und uncoating zu untersuchen, die das Potenzial für vielfältige Modifikationen , um diverse Fragen zu beantworten im Zusammenhang mit der IAV - Eintrag hat. Darüber hinaus kann es Eintrag Prozesse anderer umhüllte Viren mit damit verbundenen uncoating Mechanismen zu untersuchen, werden angewendet.

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Acknowledgments

Wir danken Yohei Yamauchi und Roberta Mancini für uns mit Reagenzien bereitstellt. Das AH-Labor durch die Marie-Curie Initial Training Networks (ITN), dem European Research Council (ERC), und von der Schweizerischen National Science Foundation (Sinergia) unterstützt wurde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets Sigma-Aldrich 11873580001 The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid Merck Millipore 100063
Glycerol anhydrous BioChemica AppliChem A1123
Hydrochloric acid Merck Millipore 100317
Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate Sigma-Aldrich M8250
Methanol Merck Millipore 106009
NP-40 Sigma-Aldrich I8896 Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm Life Technologies NP0321
NuPAGE LDS sample buffer (4x) Life Technologies NP0008
NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) Life Technologies NP0001
pH indicator strips, pH 4.0-7.0 Merck Millipore 109542
QC Colloidal Coomassie Stain BIO RAD 1610803
Sodium chloride Merck Millipore 106406
Sodiumhydroxide Merck Millipore 106498
Steritop filter unit Merck Millipore SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set Beckman Coulter 331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Tris hydrochloride  AppliChem A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid Virapur Freshly thawed on 4 °C

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References

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