Introduction
インフルエンザAウイルス（IAV）はエンベロープウイルスであり、 オルトミクソウイルス科に属します。その遺伝子は、セグメント化ネガティブセンス一本鎖RNAゲノム上にコードされています。ヒトでは、IAVは、季節の集団発生で発生する呼吸器感染症を引き起こし、世界的なパンデミック1の可能性を負いません。宿主細胞表面2上のシアル酸残基に結合すると、IAVは、クラスリン依存性エンドサイトーシスとクラスリン依存性経路3-8によって内在化されます。エンドサイトーシス液胞における酸性環境（pH値<5.5）は、ウイルスの融合および後期エンドソーム膜9の結果IAVスパイク糖タンパク質ヘマグルチニン（HA）、の主要なコンフォメーション変化を誘発します。サイトO - IAVキャプシドは、（ここではまた、ウイルス「コア」と呼ばれる）後期エンドソーム（LE）をから脱出した後、これを核に、ウイルスリボ（vRNPs）の輸送に続いて細胞質ゾルでコーティングされていませんFウイルスの複製および転写10-13。 HAの酸活性化の前に、ウイルスはその後の解体14-16のためのコアをプライムエンドサイトーシスシステム、内pHの漸減を経験します。この「プライミング」で陽子とK +10,14,16の流入を媒介するウイルス膜中のM2イオンチャネルをステップ。ウイルス内部のイオン濃度の変化は、相互作用がウイルスのマトリックスタンパク質M1と8 vRNPバンドルによって構築の妨げとなり、膜融合10,14-17以下の細胞質にIAVの脱殻を促進します。
プライミング工程の直接的かつ定量的な分析がエンドソームを実験的にアクセスすることが困難であるという事実によって妨げられてきました。エントリー方法は、さらに、非常に非同期です。また、このような放出されたウイルスRNAまたは感染力の測定値の定量RT-PCRのようなエンドポイントアッセイは、ウイルスcapsiの生化学的状態についての詳細な画像を提供していません。エントリの任意の段階で、D。 siRNAまたは薬物治療によってエンドソームの摂動が大幅IAVエントリ18-20の理解に貢献してきましたが、微調整が厳密に制御されたエンドソームの成熟プログラムで非特異的な副作用に困難となりやすいです。
これらの問題を回避するために、我々は速度勾配遠心分離17の使用に基づいて、以前に開発されたin vitroでのプロトコルを適応しています。主にタンパク質分解切断およびEM分析続く界面活性剤処理の組み合わせに基づいていた他の試み21,22、23,24、とは対照的に、このアプローチは、容易に定量化可能な結果を可能にしました。異なる傾斜層を介して遠心分離沈降粒子がに露出されることを可能にし、制御された方法で変化する条件に反応します。提示されたプロトコルでは、IAV清澄尿膜腔液または精製されたウイルス粒子に由来する二層グリセロール中に沈殿さ底部層は、非イオン性界面活性剤NP-40（ 図1）を含有する勾配。ウイルスは二、界面活性剤含有層に入ると、ウイルスの脂質エンベロープおよびエンベロープ糖タンパク質は、静かに可溶化し、残されています。コアは、8 vRNPバンドルで構成され、ペレット画分に安定な構造としてマトリックス層、堆積物に囲まれています。例えばM1およびvRNP関連核タンパク質（NP）、ウイルスコアタンパク質は、SDS-PAGEおよびクマシー染色によってペレットに同定することができます。具体的には、市販の勾配ゲルを利用して高感度コロイド状クーマシー25で染色し、高精度及びウイルスコア関連タンパク質であっても、少量の検出を可能にします。
これは、pH、塩濃度、および推定脱殻因子コア成分及びコアSTABILの沈降挙動に影響を与えるように異なる条件かどうかを試験するための基準を設定します性。この目的のために、グリセロール勾配だけ低く、界面活性剤含有層は、目的の因子または条件を導入することによって改変されます。技術は、IAVコア16の完全に異なるpH値および塩濃度の効果を調査する際に特に貴重でした。 IAVの脱殻の中間ステップは、pHが5.5と低い16,17（ 図1）でvRNP解離に続いて、弱酸性のpH（<6.5）で、マトリクス層の解離を含む監視することができます。後者のステップは、さらに後期エンドサイトーシス環境16を反映し 、グリセロール層中の高K +濃度の存在によって増強されました。したがって、ウイルスおよび勾配を通って沈降コアとして、彼らはそのエンドソームにおける模倣条件変更環境を経験しました。結果は、細胞生物学アッセイから得られた結果を補完し、in vitroでのウイルスコアの段階的分解しました。
tは">ここで紹介する方法は、高速で有効になっているとIAV（X31およびA / WSN / 33）と、IBV（B /リー/ 40）の再現性の高い分析は、酸性pHによってトリガーされ、K +16,17だけでなく、分解を増加させること脱殻アルカリ性のpH暴露17時のパラミクソウイルスのコアの。アプローチが細胞侵入時にウイルスキャプシド構造およびキャプシド解体の生化学的性質への洞察を得るために、他のエンベロープウイルスに適合させることができると考えられます。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
緩衝液および原液の調製
- 80ミリリットルののddH 2 Oで390ミリグラムMES水和物および580mgのNaClを、470mgのトリス塩酸塩を溶解することによりMNT緩衝液（20mMのMES、30mMのトリスおよび100mMのNaCl）を準備pH7.4に緩衝液を調整し、のddH 2 Oで最終容量100mlにそれを持って来ます
- 80ミリリットルのdH 2 O毎に9.76グラムのMES水和物を溶解することによって500mMのMES緩衝液の3つの同一の溶液を調製します。濃NaOHで滴定することにより、それぞれ、pHが5.8、5.4にバッファを調整し、5.0。 dH 2 Oで最終容量100mlに各バッファを持参
- 80ミリリットルのdH 2 Oそれぞれに7.88グラムのトリス塩酸塩を溶解することにより、500 mMトリス緩衝液の2つの同一のソリューションを用意し、濃HClで滴定することにより、それぞれ、7.4および6.4にpHを調整します。 dH 2 Oで最終容量100mlにバッファを持参
- dH 2 O中の50％グリセロール溶液を準備し、glycまでよくかき混ぜエロールは均一に混合されます。ガラス瓶にSteritopフィルタユニット（0.22μmの孔サイズ）を通して溶液をフィルタリングします。
- 10％NP-40ソリューションとのdH 2 O中1MのNaClを準備
- ddH 2 O 4ミリリットル中に2個の錠剤を溶解することにより25倍濃縮されたプロテアーゼ阻害剤を準備
グリセロール勾配の調製
- 5ミリリットルの洗剤バッファマスターミックス準備（pHは7.4、6.4、5.8、5.4、および5.0）のテストに各pH条件の溶液（300mMのNaCl、2％NP-40を、2倍は、プロテアーゼ阻害剤を濃縮します）。この目的のために、1MのNaClの9ミリリットル、10％NP-40の6ミリリットル、25×プロテアーゼ阻害剤の株式の2.4ミリリットル、及び9ミリリットルののddH 2 0を混ぜます。
- 各pH条件ピペット用の50mlコニカルチューブにマスターミックス4.4 mlです。
- 5.8以上のpH値についてチューブにそれぞれのpH調整500 mMトリスストック溶液の0.6ミリリットルを追加します。 pHが5.8と低いために、それぞれのpH調整の500mM MESストック溶液の0.6ミリリットルを追加します。
- 5を作ります300mMのNaClを含む緩衝液、2×プロテアーゼ阻害剤、pHが7.4とのddH 2 Oに調整し、60mMのトリスミリリットルこれは、界面活性剤を含まない対照勾配バッファとして機能します。
- 必要に応じて、それぞれ、濃HCl又はNaOHソリューションを追加することにより、pHが7.4、6.4、5.8、5.4、および5.0に溶液のpHを微調整します。
- 6別の25％グリセロール溶液が得られる界面活性剤含有および界面活性剤を含まない緩衝液の混合物の5ミリリットルに50％のグリセロールストックの5ミリリットルを追加します。 pH指示薬ストリップを用いてpH値を確認します。
注：測定したpHが所望の値と大きく異なる場合は、それぞれの溶液を再度準備する必要があります。 - 7比：3でのdH 2 Oで50％のグリセロールストックを混合することにより、15％グリセロール溶液を準備します。
IAVの3超遠心
- 5ミリリットルの注射器や旧姓を使用することにより（13.2ミリリットル、X 89ミリメートル14ミリメートル）の超クリアな遠心チューブに3ミリリットル15％グリセロール溶液を追加DLE（9 cmの長さ21 G、）。これは勾配の整合性を乱す可能性があるとして、管の内壁に水滴を残さないでください。 6遠心分離管、テストに5 pH条件ごとに1つの対照試料のための1つの合計のためにこれを繰り返します。
- 注意深く5mLの注射器と長い針を使用して、15％のグリセロール層の下に3.4 mlの25％グリセロール溶液を置きます。二つの層を混在させないように注意してください。それぞれのpH調整グリセロール溶液でテストするために、すべての6つの条件のためにこれを繰り返します。
注：以下の手順については、クラスII安全キャビネットで作業。 - 静かに1ミリリットルMNT緩衝液で希釈IAV（X31、H3N2）を含む尿膜液を明らかにした30μlのグリセロール勾配を重ねるごとグラデーションの（周り20-30μgの総ウイルスタンパク質のに相当します）。
- バランスチューブに反対し、SW41超遠心ローターに入れます。 55,000×gで、150分間遠心し、12°C。
- 遠心分離した後、慎重にきれいなパスツールピペットや吸引器を使用して上清を除去し、 すなわち 、両方のグリセロール層。 40μL（1×）非還元LDSサンプル緩衝液中にペレットを再懸濁します。完全にペレットを溶解するには、上下に数回ピペッティングすることが重要です。 1.5ミリリットルのマイクロチューブにサンプルを移します。
4. SDS-PAGEペレット画分のクマシー染色
- 10分間95℃ですべてのサンプルを加熱します。これらはSDS-PAGEによって分析されるまで、この時点で、サンプルは-20℃で保存することができます。
- 負荷溶解ペレット20μlのプレキャスト勾配（4から12パーセント）ビス - トリスミニゲル上に、バッファを実行している1×MOPS SDSで200 Vで1時間実行します。
- ddH 2 O中の40％メタノールおよび10％氷酢酸固定液を作ります
- コロイド状クーマシー液の十分な量で一晩15cmの細胞培養皿に1時間と染色のための固定液中でゲルをインキュベートしながらそっと室温で振とう。
注：これは、染色溶液の蒸発を回避するために、皿を閉鎖することが重要です。 - ddH 2 O中でゲル脱色ゲルの背景が透明になるまでのddH 2 Oごとに15〜20分を交換してください。それはバンドの定量化のためにスキャンされるまで4℃でのddH 2 Oでゲルを保管してください。
- 高解像度でゲルをスキャンし、タンパク質バンド強度の定量化のために市販されているか、またはカスタムメイドのソフトウェアを使用しています。各バンドに近い領域からバックグラウンド信号を減算し、界面活性剤を含まない対照試料（pH7.4で）にこれらの値を正規化します。
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Representative Results
既に論じたように、エンドソーム内のプライミングコンピ脱殻IAVコアをレンダリングするために必要とされます。コアのプロトンは、（ウイルスRNA、NP、およびポリメラーゼ複雑PB1 / PB2 / PAから成る）M1とvRNPsの相互作用を弱めます。入ってくるウイルスは初期エンドソーム（のEE）6.5（またはそれ以下）のpHに露出してのLEでpH約5.0でのウイルスのヒューズまで継続されると、このプロセスが開始されます。
pH値の減少を模倣するために、グリセロール勾配の最下層は、一定の塩濃度でpHを7.4と5.0の間の値に調整しました。清澄尿膜腔液から誘導X31は、速度勾配遠心分離にかけ、SDS-PAGE（ 図2A、B）で分析しました。の特徴的なパターンに反映されるように勾配（ 図2A、レーン1）に存在する洗剤なしで無傷のビリオンは、ペレット化されていますクマシー染色したゲルでは、NP（56 kDaの）、およびM1（27 kDaの）; HA（63 kDaのHA1とHA2）を表すバンド。ゲルは非還元条件下で実行されたので、タンパク質分解的に切断されHA1とHA2はまだジスルフィド結合によって接続されており、約64キロダルトンを実行しています。還元条件下HA1とHA2に対応するバンドを忠実に解釈し、単にウイルスコア（ 図2B）に由来するバンド強度を決定することが困難になる、それぞれ、NP及びM1バンドに非常に近いと思われます。
底部（25％）のグリセロール層のNP-40を添加すると、HA、NA、およびM2を含むウイルスエンベロープを可溶化し、そして単独でウイルスコアは超遠心（ 図1、 図2、レーン2）中にペレットに沈降します。 6.5未満のpHから開始し、M1が徐々にペレット画分から失われ、pHは5.8と5.4との間の最小に達した（ 図図2A、B）。 pH値の下に5.8 vRNPsは解離し、したがって、ペレットから失われました。以前は、それらの放出がペレット画分16からPB2の喪失と相関するように、実際には、全体vRNPsは、上層中に放出されることが示されています。タンパク質バンドの強度は（ 図2）は、それぞれ、vRNP束のM1層および解離の分解のための2つの別個のpH閾値を明らかに決定しました。追加のバンドは、ポリメラーゼタンパク質のPB1（87キロダルトン）、PB2（86キロダルトン）、PA（83キロダルトン）、およびM2（11 kDaの）に対応している場合がありゲル上で観察することができました。 IAVビリオン内部のその低いコピー数に起因して、我々は確実に自分のアイデンティティを決定することができませんでしたし、彼らは、結果的に定量化のために考慮されていませんでした。
図1：IAVの略図 
図2： 酸性化の際に in vitroでの IAVコア解体低いグリセロール層中の異なるpH条件でのX31コアの（A） インビトロ分解。対照として、NP-40、底グリセロール層（第1レーン）を省略しました。サンプルは、クーマシー染色に続く非還元条件下でSDS-PAGEにより分離しました。ウイルスタンパク質のバンドが右側に示されています。 （B）（A）に示したウイルスのタンパク質バンドの強度の濃度測定定量化。 M1およびNPのためのタンパク質のバンド強度は、NP-40なしでpH7.4のものに正規化しました。データは±標準偏差（SD）の重複実験の平均として表されます。シュタウファーら 、2014年16から適応。ge.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ウイルスキャプシドは、準安定巨大分子複合体です。ビリオンのアセンブリは、ウイルスゲノムのキャプシド形成及び縮合を必要とするが、感染の次のラウンドの開始は、このコンパクトなキャプシド構造の分解に依存します。ウイルスは、細胞受容体、シャペロン、タンパク質分解酵素、モータータンパク質またはヘリカーゼ、ならびにpHおよびイオンスイッチ26,27により提供される物理的な力を含むコーティング-脱殻サイクルを制御するために、様々な細胞機構を利用するために進化してきました。ここでは、特にIAVコアの分解を促進因子の効果をテストするために、グリセロール勾配遠心分離に基づいて、in vitroでのアプローチについて説明します。技術は、潜在的には他のエンベロープウイルスの脱殻のプロセスを解剖するために適合させることができます。
コロイド状クーマシーを使用して、主要な構造IAVタンパク質M1、NPおよびHAは明らかに比較的小さなウイルス気難しいとSDS-PAGEで検出することができますル数。しかし、より詳細な沈降キャプシド構造の特徴付けおよびフォローアップを必要とするその組成分析、（以前は28を提示したように）電子顕微鏡など、ウェスタンブロット法、動的光散乱法または質量分析法。プロトコルの更なる拡張は、特定のコアコンポーネントの低い（25％）グリセリン相と分析の分別を含むことができます。
（X31用）5.0の最適な融合pHに低いグリセロール層の調整は、マトリクス層のほぼ完全な解離（ 図2）16につながりました。しかし、入力NP信号の約30％は、まだこのpHで検出することができます。そのような最近同定されたヒストンデアセチラーゼ6（HDAC6）18と、このセットアップにおける細胞脱殻因子の非存在下に、不完全な分解が起こる可能性があります。 K +へのNa +からスイッチへのウイルスコアと露出のセルの内部には、ゆっくりと酸性化16因子脱殻することによって制御完全vRNPリリースのウイルスをプライミング。私たちは、セットアップ中に、非イオン性界面活性剤は、部分的に酸露出し、不安定化したコアを破壊することを排除することはできません。しかし、中性のpHで沈降コアには影響は、非可溶化サンプル（ 図2A、レーン1および2を比較）と比較して、同様のタンパク質バンド強度によって示さ観察されません。ここで提示アッセイは、バンドの定量化のために十分に堅牢（そのようなものがあるように）高い再現性とであることが証明された、が、ばらつきのある範囲を観察することができました。
このプロトコル中のグリセロールの使用は、実験の結果のために重要です。以前に17を報告したように、ショ糖勾配を通して超遠心分離が原因ショ糖によって作成された高い浸透力に起因する可能性が高いIAVコアを、不安定化。ショ糖勾配を介したIAVの精製は、同様の効果を発揮する可能性があります。そこで我々はCL由来卵成長X31を比較しました arified尿膜液およびスクロース精製取り揃えております。重大な違いは、コアの安定性の酸性pHの影響に関して観察されなかった（データは示さず）。それにもかかわらず、浸透活性ショ糖の潜在的な副作用を排除するために、我々は尿膜明らかに流体または濃縮細胞培養上清を用いたin vitro脱殻アッセイを実施することをお勧めします。
勾配材料の選択に加え、溶解ウイルスコアの沈降挙動に影響を与え、再現性のある結果を保証しないために、勾配の完全性を維持することが重要です。また、超遠心分離後のペレット画分の不完全な再懸濁は、おそらく異なる結果につながります。イオン濃度の小さな変化は、ウイルスコアの安定性に劇的な影響を与える可能性があります最後に、我々は強く実験の同じ日に理想的な界面活性剤含有緩衝液のpHを調整することをお勧めします。
コンテンツマトリックス層およびvRNPのための ">これはまた、変異体ウイルスに適用することがあります。特にIAV株に応じて、異なる分解効率はそれぞれM1およびNPの変異体の特性に基づいて発生する可能性があることに留意することが重要である。したがって、pHがしきい値解離は追加の影響を試験する前に、それぞれのIAV株について決定しなければならない。我々は、M1の半最大分解が達成されるように、pH値に下部グリセロール調整層を示唆するウイルスコアの安定性に対する特定の条件の分析のためにそれが可能ですそれに応じて界面活性剤を含有する層を変更することによって、特定のイオンまたは還元剤の影響を調査する。推定細胞脱殻因子は、グリセロール勾配に直接添加することができる。細胞質因子の場合には、勾配の下部に第三のグリセロール層とすることができます、中性のpHに調整され、導入された、目的の細胞性因子を含有し、界面活性剤を含まない。このように、第電子三層の勾配は一層厳密に中性細胞質への遺伝子セグメントのエンドサイトーシスシステム及び放出により、ウイルスの通過を模倣します。まとめると、我々はIAVエントリのコンテキストで多様な質問に対処するために、汎用性の修正の可能性を持っているIAVプライミングと脱殻を研究するために堅牢かつシンプルなin vitroアッセイを提示します。また、関連する脱殻のメカニズムを有する他のエンベロープウイルスの侵入過程を調査するために適用することができます。
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Acknowledgments
私たちは、試薬をご提供するため洋平山内とロベルタマンシーニに感謝します。 AHの研究室は、マリー・キュリー初期研修ネットワーク（ITN）、欧州研究会議（ERC）によると、スイス国立科学財団（Sinergia）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
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