Introduction
Influenza A virus (IAV) es un virus con envoltura y pertenece a la familia de Orthomyxoviridae. Sus genes están codificados en un sentido negativo segmentado y genoma de ARN de cadena simple. En los seres humanos, IAV causa infecciones respiratorias, que se producen en brotes epidémicos estacionales y tiene el potencial de pandemias globales 1. Tras la unión a los residuos de ácido siálico en la superficie de la célula huésped 2, IAV es internalizado por endocitosis dependiente de clatrina y las vías de clathrin independiente 3-8. El medio ácido (pH <5,5) en las vacuolas endocíticas desencadena un cambio conformacional importante en la IAV espiga glicoproteína hemaglutinina (HA), lo que resulta en la fusión de la viral y el fallecido membrana 9 endosomal. Una vez que la cápside IAV (aquí también se hace referencia como "núcleo" viral) ha escapado de los endosomas finales (LES), que no está recubierto en el citosol seguido por el transporte de las ribonucleoproteínas virales (vRNPs) en el núcleo - el sitio ola replicación del virus y la transcripción f 10-13. Antes de la activación ácida de HA del virus experimenta una disminución gradual en el pH en el sistema endocítica, que ceba el núcleo para su posterior desmontaje 14-16. En este "cebado" intensificar los canales iónicos M2 en la membrana viral mediar en la afluencia de protones y K +10,14,16. El cambio en la concentración iónica en el interior virus perturba las interacciones se acumulan por la proteína de la matriz M1 viral y el haz vRNP ocho, y facilita IAV uncoating en el citoplasma después de la fusión de membranas 10,14-17.
El análisis directo y cuantitativa de la etapa de cebado se ha visto obstaculizada por el hecho de que los endosomas son difíciles de acceder experimentalmente. El proceso de entrada es, por lo demás, altamente no sincrónico. Además, los ensayos de punto final, como QRT-PCR mediciones de ARN o la infectividad viral liberados, no proporcionan una imagen detallada sobre el estado bioquímico de la capsi virald en cualquier etapa dada de entrada. Mientras que la perturbación de los endosomas de siRNA o tratamiento de drogas ha contribuido significativamente a la comprensión de la entrada IAV 18-20, puesta a punto es difícil y propensos a los efectos secundarios inespecíficos en el programa endosoma maduración estrechamente controlada.
Para evitar estos problemas, hemos adaptado un protocolo previamente desarrollado in vitro basado en el uso de la velocidad de centrifugación en gradiente de 17. A diferencia de otros intentos 21,22, 23,24, que se basan principalmente en combinaciones de escisión proteolítica y tratamiento con detergente seguido por análisis de EM, este enfoque permitió un resultado fácilmente cuantificable. La centrifugación a través de diferentes capas de gradiente permite que las partículas que sedimentan a estar expuestos a y reaccionan con las condiciones cambiantes de una manera controlada. En el protocolo presentado, IAV derivado de fluido alantoideo aclarado o partículas virales purificadas se sedimentan en un glicerol de dos capasgradiente en el que la capa inferior contiene el detergente no iónico NP-40 (Figura 1). A medida que el virus entra en la segunda capa, que contiene detergente, la envoltura de lípidos y glicoproteínas de la envoltura viral se solubilizan con suavidad y dejaron atrás. El núcleo, formado por el haz de ocho vRNP y rodeado por una capa de matriz, los sedimentos como una estructura estable en la fracción de sedimento. proteínas del núcleo viral, tales como M1 y nucleoproteína asociado-vRNP (NP), se pueden identificar en el sedimento por SDS-PAGE y tinción Coomassie. En particular, tomando ventaja de geles de gradiente disponibles en el mercado y la tinción con el coloidal Coomassie altamente sensible 25, permite una alta precisión y la detección de incluso pequeñas cantidades de proteínas del núcleo asociada virales.
Esto establece la base para probar si las diferentes condiciones tales como el pH, la concentración de sal, y los factores putativos Uncoating tener efectos sobre el comportamiento de sedimentación de los componentes del núcleo y de núcleo Stabil dad. Para este objetivo, solamente la capa que contiene detergente menor en el gradiente de glicerol se modifica mediante la introducción del factor o condición de interés. La técnica ha sido particularmente valiosa en la investigación del efecto de diferentes valores de pH y concentraciones de sal en la integridad del núcleo 16 IAV. Pasos intermedios de IAV uncoating podrían ser monitorizados incluyendo la disociación de la capa de la matriz a pH ligeramente ácido (<6,5), seguido de vRNP disociación a pH 5,5 e inferior 16,17 (Figura 1). Este último paso se ha mejorado aún más por la presencia de una alta concentración de K + en la capa de glicerol, lo que refleja un entorno endocítica finales 16. Por lo tanto, como el virus y el núcleo sedimentan a través del gradiente que experimentaron un medio de cambio que imita las condiciones en los endosomas. El resultado fue un desmontaje por etapas del núcleo viral in vitro, como complemento de los resultados derivados de los ensayos de biología celular.
t "> El método que aquí se presenta ha permitido el análisis rápido y altamente reproducible de IAV (X31 y A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) Uncoating desencadenada por pH ácido y el aumento de K +16,17, así como el desmontaje de núcleos de paramixovirus tras la exposición pH alcalino 17. es concebible que el enfoque se puede adaptar a otros virus con envoltura para obtener información sobre las propiedades bioquímicas de la estructura de la cápside viral y desmontaje de la cápside durante la entrada en la célula.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de tampones y soluciones de archivo
- Preparar tampón SM (MES 20 mM, Tris 30 mM y NaCl 100 mM) disolviendo 470 mg de clorhidrato de Tris, 390 mg de hidrato de MES y 580 mg de NaCl en 80 ml ddH2O Ajustar el tampón a pH 7,4 y llevarlo a un volumen final de 100 ml con ddH 2 O.
- Preparar tres soluciones idénticas de tampón MES 500 mM disolviendo 9,76 g de hidratos de MES en 80 ml de H2O destilada cada uno. Ajuste los tampones a pH 5,8, 5,4, y 5,0, respectivamente, por titulación con NaOH concentrado. Llevar a cada tampón a un volumen final de 100 ml con dH 2 O.
- Preparar dos soluciones idénticas de tampón Tris 500 mM disolviendo 7,88 g de Tris clorhidrato en 80 ml dH 2 O cada uno y ajustar el pH a 7,4 y 6,4, respectivamente, por titulación con HCl concentrado. Llevar el tampón a un volumen final de 100 ml con dH 2 O.
- Preparar una solución de glicerol al 50% en H2O destilada y mezclar bien hasta que el glycerol es homogéneamente mezclado. Filtrar la solución a través de una unidad de filtro Steritop (0,22 micras de tamaño de poro) en una botella de vidrio.
- Preparar una solución al 10% de NP-40 y 1 M NaCl en dH2O
- Preparar 25x inhibidor de la proteasa concentrada disolviendo dos tabletas en 4 ml ddH2O
2. Preparación de glicerol gradientes
- Preparar 5 ml de detergente mezcla maestra tampón (NaCl 300 mM, 2% de NP-40, 2x concentrado inhibidor de la proteasa) solución para cada condición de pH de ensayo (pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, y 5,0). Para este propósito, la mezcla 9 ml de 1 M NaCl, 6 ml de 10% de NP-40, 2,4 ml del inhibidor de la proteasa de 25x, y 9 ml ddH 2 0.
- Para cada condición de pipeta pH 4,4 ml de la mezcla maestra en un tubo cónico de 50 ml.
- Para valores de pH superiores a 5,8 añadir 0,6 ml de la respectiva solución de 500 mM Tris Stock pH ajustado al tubo. Para un pH de 5,8 y menor añadir 0,6 ml de la solución madre respectiva MES 500 mM de pH ajustado.
- hacer 5ml de solución tampón que contenía NaCl 300 mM, inhibidor de la proteasa 2x, 60 mM Tris ajustó a pH 7,4 y ddH 2 O. Esto servirá como tampón de gradiente de control sin detergente.
- Si es necesario, un ajuste preciso del pH de las soluciones a pH 7,4, 6,4, 5,8, 5,4, y 5,0 mediante la adición de soluciones de HCl o NaOH concentrado, respectivamente.
- Añadir 5 ml de la reserva de glicerol 50% a 5 ml de las mezclas de tampón que contiene detergente y libre de detergentes resultantes en seis soluciones de glicerol diferentes 25%. Verificar los valores de pH mediante el uso de tiras indicadoras de pH.
NOTA: En caso de que el pH medido difiere significativamente del valor deseado, las respectivas soluciones deben prepararse de nuevo. - Preparar la solución de glicerol 15% mediante la mezcla de 50% de glicerol con dH 2 O en una proporción de 3: 7.
3. La ultracentrifugación de IAV
- Añadir 3 ml de solución de glicerol al 15% en tubos de centrifugación ultra claras (13,2 ml, 14 mm x 89 mm) utilizando una jeringa de 5 ml y una neeDLE (21 g, 9 cm de largo). No dejar gotas en la pared interior del tubo ya que esto podría perturbar la integridad del gradiente. Repita este procedimiento para un total de seis tubos de centrifugación, una para cada una de las cinco condiciones de pH para probar y uno para la muestra de control.
- Coloque cuidadosamente solución de glicerol 3,4 ml 25% bajo la capa de glicerol 15% mediante el uso de una jeringa de 5 ml y una aguja larga. Tenga cuidado de no mezclar las dos capas. Repita este procedimiento para todas las seis condiciones para poner a prueba con las respectivas soluciones de glicerol con pH ajustado.
NOTA: El trabajo en clase II cabina de bioseguridad para los siguientes pasos. - superponer suavemente los gradientes de glicerol con 30 l aclarado líquido alantoideo que contiene IAV (X31, H3N2) diluido en 1 ml de tampón SM (corresponde a alrededor de 20-30 g de proteína viral total) para cada gradiente.
- Equilibrio oponerse tubos y colocarlos en un rotor SW41 ultracentrifugación. Se centrifuga durante 150 minutos, a 55.000 xg, y 12 ° C.
- Después de la centrifugación, cuidadosamenteEliminar el sobrenadante, es decir, las dos capas de glicerol mediante el uso de una pipeta Pasteur y limpia un aspirador. Resuspender el precipitado en 40 l (1x) no reductoras tampón de muestra LDS. Es importante pipetear arriba y abajo varias veces para disolver el precipitado completamente. Transferir la muestra en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. SDS-PAGE de las fracciones de pellets y tinción Coomassie
- Calentar todas las muestras a 95 ° C durante 10 min. En este punto las muestras se pueden almacenar a -20 ° C hasta que se analizaron por SDS-PAGE.
- Carga de 20 l de los gránulos disueltos en un gradiente de pre-cast (4-12%) de mini gel Bis-Tris y una duración de 1 hora a 200 V en 1x MOPS SDS funcionamiento de amortiguación.
- Hacer solución de fijación con 40% de metanol y ácido acético glacial 10% en ddH 2 O.
- Incubar el gel en solución de fijación durante 1 hora y manchar durante la noche en una placa de cultivo celular de 15 cm con un volumen suficiente de solución de Coomassie coloidal mientras que suavementeagitación a temperatura ambiente.
NOTA: Es importante cerrar el plato con el fin de evitar la evaporación de la solución de tinción. - Destain el gel en ddH2O Vuelva a colocar la ddH2O cada 15-20 minutos hasta que el fondo gel se vuelve clara. Almacenar el gel en ddH2O a 4 ° C hasta que se escanea para la cuantificación banda.
- Analiza el gel a alta resolución y el uso de software disponible o hecho a medida en el comercio para la cuantificación de la intensidad de la banda de proteína. Restar la señal de fondo de una región cerca de las respectivas bandas y normalizar estos valores para las muestras de control sin detergente (a pH 7,4).
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Representative Results
Como ya se ha comentado, el cebado en los endosomas que se requiere para hacer que el núcleo IAV uncoating competente. La protonación del núcleo debilita la interacción de M1 y vRNPs (compuesto del ARN viral, NP, y la polimerasa PB1 complejo / PB2 / PA). Este proceso se inicia cuando el virus entrante se expone a un pH de 6,5 (o inferior) en los endosomas tempranos (EEE) y continúa hasta que los fusibles de virus en torno a pH 5,0 en LES.
Con el fin de imitar la disminución del pH, la capa inferior de los gradientes de glicerol se ajustó a valores entre pH 7,4 y 5,0 a una concentración de sal constante. X31 derivado de fluido alantoideo aclarado se sometió a centrifugación en gradiente de velocidad y se analizó mediante SDS-PAGE (Figura 2A, B). Sin detergente presente en el gradiente (Figura 2A, carril 1) viriones intactos se sedimentan, como se refleja en el patrón característico debandas que representan HA (HA1 y HA2; 63 kDa), NP (56 kDa), y M1 (27 kDa) en el gel teñido con Coomassie. Dado que el gel se llevó a cabo bajo condiciones no reductoras, HA1 y HA2 proteolíticamente escindido todavía están conectados por enlaces disulfuro y funcionan a aproximadamente 64 kDa. En condiciones reductoras las bandas correspondientes a HA1 y HA2 aparecerían muy cerca de las bandas de NP y M1, respectivamente, por lo que es difícil de interpretar fielmente y determinar las intensidades de banda que se derivan únicamente del núcleo viral (Figura 2B).
Tras la adición de NP-40 a la parte inferior (25%) de glicerol capa de la envoltura viral incluyendo HA, NA, y M2 se solubilizaron y el núcleo viral solo sedimenta en el pellet durante la ultracentrifugación (Figura 1; la Figura 2, carril 2). A partir de un pH por debajo de 6,5, M1 se pierde gradualmente de la fracción de sedimento, alcanzando un mínimo entre pH 5,8 y 5,4 (Figura2A, B). Por debajo de pH 5,8 vRNPs se disociaron y por lo tanto pierden a partir del sedimento. Anteriormente, se ha demostrado que, de hecho, vRNPs enteros se liberan en la capa superior, ya que su liberación correlacionada con la pérdida de PB2 de la fracción de sedimento 16. Se determinaron las intensidades de las bandas de proteínas, revelando dos umbrales de pH diferentes para el desmontaje de la capa de M1 y la disociación de los haces de vRNP, respectivamente (Figura 2). las bandas adicionales podrían observarse en el gel, lo que podría corresponder a la proteínas de la polimerasa PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa) y M2 (11 kDa). Debido a sus bajos números de copias dentro de viriones IAV no hemos podido determinar con certeza su identidad y que en consecuencia, no se tuvieron en cuenta para la cuantificación.
Figura 1: Representación esquemática de la IAV 
Figura 2: IAV núcleo desmontaje in vitro tras la acidificación (A) desmontaje in vitro de núcleos X31 en diferentes condiciones de pH en la capa de glicerol inferior.. Como control, NP-40 fue omitido de la capa de glicerol inferior (primero carril). Las muestras se separaron mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras seguido por tinción Coomassie. bandas de proteínas virales se indican a la derecha. (B) densitométrico cuantificación de las intensidades de las bandas de proteínas virales que se muestran en (A). intensidades de las bandas de proteína para M1 y NP se normalizaron a los de pH 7,4 sin NP-40. Los datos se representan como medio de experimentos duplicados ± la desviación estándar (SD). Adaptado de Stauffer et al., 2014 16.ge.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
cápsides virales son complejos macromoleculares metaestables. Durante el montaje de los viriones requiere la encapsidación y la condensación del genoma del virus, el inicio de la siguiente ronda de infección depende de desmontaje de esta estructura de la cápside compacto. Los virus han evolucionado para explotar varios mecanismos celulares para controlar el ciclo de recubrimiento-uncoating, incluyendo receptores celulares, chaperones, enzimas proteolíticas, fuerzas físicas proporcionadas por proteínas motoras o helicases, así como pH y conmutadores iónicos 26,27. A continuación, describimos un método in vitro basado en una centrifugación en gradiente de glicerol para probar específicamente el efecto de los factores que promueven el desmontaje del núcleo IAV. La técnica puede ser potencialmente adaptada para la disección de los procesos uncoating de otros virus con envoltura.
Mediante el uso de Coomassie coloidal, las principales proteínas estructurales IAV M1, NP, y HA se puede detectar claramente en SDS-PAGE, incluso con una cantidad relativamente pequeña de virus particnúmero de archivo. Sin embargo, una caracterización más detallada de la estructura de la cápsida sedimentado y su composición requeriría análisis de seguimiento, tales como la microscopía electrónica (tal como se presenta anteriormente 28), Western Blot, dispersión de luz dinámica o espectrometría de masas. Es necesaria una ampliación del protocolo podría incluir el fraccionamiento de la parte baja (25%) fase de glicerol y el análisis de los componentes básicos específicos.
Ajuste de la capa de glicerol inferior al pH de fusión óptimo de 5,0 (para X31) condujo a una disociación casi completa de la capa de matriz (Figura 2) 16. Sin embargo, alrededor de 30% de la señal de entrada NP todavía se puede detectar a este pH. Es posible que debido a la ausencia de factores de uncoating celulares en esta configuración, como el recientemente identificado histona desacetilasa 6 (HDAC6) 18, se produce el desmontaje incompleto. Dentro de la célula, la acidificación lenta del núcleo viral y la exposición a un cambio de Na + a K + 16. No podemos excluir que, en nuestra configuración, el detergente no iónico interrumpe parcialmente el núcleo-ácido expuesto y desestabilizado. Sin embargo, ningún efecto sobre el núcleo sedimentación a pH neutro se observa indica por las intensidades de banda de proteínas similares en comparación con muestras no solubilizadas (Figura 2A, comparar los carriles 1 y 2). Aunque, el ensayo que aquí se presenta demostrado ser muy reproducible y (como tal es) lo suficientemente robusta como para la cuantificación de la banda, se pudo observar un cierto rango de variación.
El uso de glicerol en este protocolo es crítica para el resultado del experimento. Como se informó anteriormente 17, ultracentrifugación a través de un gradiente de sacarosa desestabiliza el núcleo IAV, que es probablemente debido a una alta fuerza osmótica creado por sacarosa. Purificación de IAV a través de gradientes de sacarosa podría ejercer efectos similares. Por lo tanto se compararon huevo crecido X31 deriva de cl arified fluido alantoideo y las existencias de sacarosa-purificado. No diferencia importante se puede observar con respecto a la influencia de pH ácido en la estabilidad de la base (datos no mostrados). Sin embargo, con el fin de excluir posibles efectos secundarios de la sacarosa osmóticamente activa, se recomienda realizar el ensayo in vitro con uncoating clarificados alantoideo sobrenadantes de cultivo de células de fluidos o concentrados.
Además de la elección del material del gradiente, es importante para mantener la integridad de la pendiente para no influir en el comportamiento de sedimentación de los núcleos virales lisadas y garantizar resultados reproducibles. Además, la resuspensión incompleta de la fracción de sedimento después de la ultracentrifugación probablemente conduce a resultados diferentes. Por último, se recomienda fuertemente ajustar el pH de las soluciones tampón que contiene detergente, preferiblemente, en el mismo día del experimento como pequeños cambios en la concentración iónica podrían tener un efecto drástico en la estabilidad de la base viral.
contenido "> Es importante tener en cuenta que, dependiendo de la cepa particular IAV, diferentes eficiencias de desmontaje podría ocurrir en base a las propiedades de la respectiva M1 y variantes NP. Esto también podría aplicarse para los virus mutantes. Por lo tanto, los umbrales de pH para la capa matriz y vRNP la disociación no se han determinado para la respectiva cepa de IAV antes de probar las influencias adicionales. para el análisis de las condiciones específicas sobre la estabilidad del núcleo viral, se aconseja ajustar la capa de glicerol inferior a un valor de pH de manera que se consigue desmontaje media máxima de M1. es posible para investigar la influencia de iones específicos o agentes reductores mediante la modificación de la capa que contiene detergente en consecuencia. factores uncoating celulares putativos podrían ser añadidos directamente al gradiente de glicerol. en el caso de los factores citoplásmicos, tercera capa de glicerol en la parte inferior de la pendiente podría ser introducido, que se ajusta a pH neutro, contiene el factor celular de interés, y es libre de detergente. de esta manera, THe gradiente de tres capas imitaría aún más de cerca el paso del virus a través del sistema endocítica y liberación de segmentos de genes en el citoplasma neutral.Tomados en conjunto, presentamos un simple pero sólido ensayo in vitro para estudiar IAV y no capa de imprimación, que tiene el potencial para modificaciones versátiles con el fin de abordar diversas cuestiones en el contexto de la entrada IAV. Además, se puede aplicar para investigar los procesos de entrada de otros virus con envoltura con mecanismos uncoating relacionados.
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Acknowledgments
Agradecemos a Yohei Yamauchi y Roberta Mancini para que nos proporciona reactivos. El laboratorio AH fue apoyada por las Redes de formación inicial Marie Curie (ITN), el Consejo Europeo de Investigación (CEI), y por la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (Sinergia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
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