Introduction
İnfluenza A virüsü (IAV) zarflı bir virüstür ve Ortomiksoviridae ailesine aittir. Bu genler, parça parça, negatif sens, tek iplikçikli bir RNA genomu üzerindeki kodlanır. İnsanlarda, IAV mevsimsel salgın salgınlar meydana solunum yolu enfeksiyonları, nedenleri ve küresel salgın hastalıklar 1 potansiyelini taşımaktadır. Ev sahibi hücre yüzeyi 2 sialik asit artıkları bağlanma üzerine, IAV klatrin bağlı endositoz ve klatrin bağımsız yollar 3-8 ile yerleştirilebilir. Endositik vakuollerde asidik ortam (pH <5.5), viral füzyonu ve geç endosomal zarı 9 sonuçlanır IAV başak glikoprotein hemaglutinin (HA), büyük bir yapısal değişim tetikler. Site o - IAV kapsid kez geç endosomes (LES), bu çekirdeğin içine viral ribonükleoproteinlerin (vRNPs) taşınması ve ardından sitozolde kaplanmamış olan kaçan (burada da viral "çekirdek" olarak anılacaktır)f virüs replikasyonu ve transkripsiyonu 10-13. HA asit aktivasyonu öncesinde virüs ileride bunun demontajı 14-16 çekirdek hazırlar endositik sistemi, pH tedrici bir azalma yaşar. Bu "priming" proton ve K +10,14,16 akını aracılık viral membran M2 iyon kanallarını adım. Virüs iç iyonik konsantrasyon değişim etkileşimleri, viral matriks protein M1 ve sekiz vRNP demet tarafından inşa rahatsız ve membran füzyon 10,14-17 aşağıdaki sitoplazmada IAV olmama kolaylaştırır.
hazırlama aşamasında doğrudan ve kantitatif analiz endozomlar deneysel ulaşılması zor olduğu gerçeği engel olmuştur. giriş süreci, dahası, son derece olmayan eşzamanlı olduğunu. Buna ek olarak, bu tür serbest viral RNA veya enfekte ölçümlerinin QRT-PCR gibi son nokta tahlilleri, viral capsi biyokimyasal durumu hakkında detaylı bir resmini sağlamazgiriş herhangi bir aşamasında, d. SiRNA veya ilaç tedavisi ile endozomlardan pertürbasyon anlamlı IAV girişi 18-20 anlayışına katkıda bulunurken, ince ayar sıkı kontrol endosome olgunlaşma programında belirsiz yan etkileri zor ve eğilimli.
Bu sorunları önlemek için, hız gradyanı ile santrifüjleme 17 kullanımına dayanmaktadır, daha önce geliştirilmiş in vitro protokol adapte edilmiştir. Çoğunlukla proteolitik bölünme EM analizi ile izlenmiştir deterjan muamelesi kombinasyonları dayanmaktadır diğer girişimlerde 21,22, 23,24, aksine, bu yaklaşım kolayca ölçülebilir bir sonuç sağladı. Farklı gradyan katmanları üzerinden Santrifüj çöktürülmesi parçacıklar maruz bırakılmış ve kontrollü bir şekilde değişen koşullara reaksiyona sağlar. Sunulan protokol olarak, IAV açıklık allantoik akışkan ya da saflaştınlmış viral parçacıkların elde edilen iki tabakalı bir gliserine çöktürülürgradyan olup, buradaki alt tabaka, iyonik olmayan bir deterjan NP-40 (Şekil 1) içerir. Virüs, ikinci deterjan içeren katmanı girdiğinde, viral lipid zarfı ve zarf glikoproteinleri yavaşça çözülmüş ve geride bırakılır. çekirdek, sekiz vRNP demet oluşan ve bir matris tabakasıyla çevrili, pelet fraksiyonu içine kararlı bir yapı olarak çökelleri. M1 ve vRNP ilişkili nükleoprotein (NP) ve viral çekirdek proteinleri, SDS-PAGE ve Coomassie boyama ile pelet içinde tespit edilebilir. Özel olarak, ticari olarak temin edilebilen gradyan jelleri yararlanarak ve son derece hassas Coomassie 25 ile boyama, yüksek hassasiyet ve viral çekirdek ilişkili proteinlerin küçük miktarlarda bile tespitini sağlar.
Bu pH, tuz konsantrasyonu ve varsayılan kılıfının faktörler temel bileşenleri ve çekirdek stabil ve sedimantasyon davranışları üzerindeki etkileri gibi farklı koşullar olup olmadığını test etmek için temel ayarlar Sığ. Bu amaç için, gliserol geçişi olarak sadece düşük, deterjan içeren katman faktörü ya da ilgi duyulan durum girerek modifiye edilir. Teknik IAV çekirdek 16 bütünlüğüne pH değerleri ve tuz konsantrasyonları farklı etkisini araştıran özellikle değerli olmuştur. IAV olmama arasında ara adımlar pH 5.5 ve daha düşük 16,17 (Şekil 1) vRNP ayrışma ardından hafif asidik pH'ta (<6.5) matris tabakasının dahil olmak üzere ayrılmasını takip edilebilir. Ikinci adım geç endositik ortamı 16 yansıtan gliserol tabakasında yüksek K + konsantrasyonu varlığında tarafından geliştirilmiştir. Virüs ve çekirdek degrade ile tortulaşmış Böylece, onlar bir değişen ortam endosemelerde taklit koşullar yaşadı. Sonuç hücre biyolojisi deneyleri türetilen sonuçları tamamlayan, in vitro viral çekirdek kademeli sökme oldu.
t "> Burada sunulan yöntem, hızlı etkin ve IAV son derece tekrarlanabilir analiz etti (X31 ve A / KAA / 33) ve IBV (B Lee / 40 /) asidik pH ile tetiklenir ve demontaj yanı sıra K +16,17 artan olmama Bu düşünülebilir alkali pH maruz 17 üzerine paramiksovirüs çekirdeklerin. yaklaşım hücre girişi sırasında viral kapsid yapısı ve kapsid sökme biyokimyasal özellikleri içgörü kazanmak için diğer zarflı virüsler adapte edilebilir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tamponlar ve Stok Çözümleri hazırlanması 1.
- 80 mi GKD 2 O 470 mg TRIS-hidroklorid, 390 mg MES hidrat ve 580 mg NaCI çözülmesiyle (20 mM MES, 30 mM Tris ve 100 mM NaCl) MNT tamponu hazırlayın PH 7.4 tampon ayarlamak ve GKD 2 O 100 ml'lik bir nihai hacme getirmek
- 80 ml dH 2 O her 9.76 gr MES hidrat çözerek 500 mM MES tamponu üç özdeş çözümler hazırlayın. konsantre NaOH ile titre edilerek, sırasıyla pH 5.8, 5.4 ve 5.0, tamponları ayarlayın. DH 2 O 100 ml'lik nihai hacme kadar her bir tampon getirmek
- DH 2 O 80 ml, her 7.88 gr TRIS-hidroklorid çözülmesiyle 500 mM Tris tamponu, iki özdeş çözüm hazırlanması ve konsantre HCI ile titre edilerek, sırası ile 7.4 ve 6.4, pH ayarlamak. DH 2 O 100 ml'lik nihai hacme kadar tampon getirmek
- DH 2 O% 50 gliserol çözeltisi hazırlayın ve glisin kadar iyice karıştırınerol berrak bir karışım. Bir cam şişe içine Steritop filtre birimi (0.22 um gözenek boyutu) ile çözelti filtre.
- 10% NP-40 çözeltisi ve DH 2 O 1 M NaCl hazırlanması
- 4 ml GKD 2 O. iki tablet çözerek 25x konsantre proteaz inhibitörü hazırlayın
Gliserol Gradyanların 2. Hazırlık
- 5 mi deterjan tamponu ana karışımı hazırlanması (pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 ve 5.0) test etmek için, her bir pH durumu için çözeltisi (300 mM NaCl,% 2 NP-40, 2 x proteaz inhibitörü konsantre edildi). Bu amaçla, 1 M NaCI 9 mi, 10% NP-40, 6 ml 25x proteaz inhibitörü stokunun 2.4 mi, 9 mi GKD 2 0 karıştırın.
- Her pH koşulu pipet için 50 ml konik tüp içine ana karışımı 4.4 ml.
- pH değerleri 5.8 üzerinde tüp için ilgili pH'ı ayarlanmış 500 mM Tris stok çözeltisi 0.6 ml ekleyin. pH 5.8 ve daha düşük için ilgili pH'ı ayarlanmış 500 mM MES, stok çözeltisi 0.6 ml ekleyin.
- 5 yapmak300 mM NaCl ihtiva eden tampon çözeltisi mi, 2x proteaz inhibitörü, 60 mM Tris pH 7.4, GKD 2 O ayarlandı Bu deterjan içermeyen kontrol degrade tampon olarak görev yapacak.
- Gerekirse, sırasıyla konsantre edildi HCI ve NaOH çözeltileri eklenerek pH 7.4, 6.4, 5.8, 5.4 ve 5.0 için çözeltilerin pH ince ayarlar.
- altı farklı% 25 gliserol Çözeltilerin elde edilen deterjan içeren deterjan içermeyen tampon karışımları, 5 ml% 50 gliserol stokunun 5 ml. pH indikatör şeritleri kullanarak pH değerlerini kontrol edin.
Not: ölçülü bir pH istenen değerden önemli ölçüde farklıdır durumda, ilgili çözümleri tekrar hazırlanmalıdır. - 7 oranında a 3 dH 2 O ile% 50 gliserol stok karıştırılarak% 15 gliserol çözeltisi hazırlayın.
IAV 3. Ultrasantrifüj
- 5 ml'lik bir şırınga ve bir öncesine kullanılarak ultra net santrifüj tüpleri içine (13.2 mi, 14 mm x 89 mm), 3 ml% 15 gliserol solüsyonu ilavedle (9 cm uzunluğunda 21 G). Bu eğim bütünlüğünü bozacağı olarak borunun iç duvarında damla bırakmayın. Altı santrifüj tüpleri test beş pH koşulları her biri için, kontrol örneği için bir toplam için tekrarlayın.
- Dikkatli bir şekilde 5 ml şırınga ve uzun bir iğne kullanılarak% 15 gliserol tabakasının altında 3.4 mL% 25 gliserol çözeltisi yerleştirin. iki kat karıştırmak değil özen gösterin. ilgili pH ayarlı gliserol çözeltileri test etmek altı koşulları için tekrarlayın.
NOT: Aşağıdaki adımlar için sınıf II biyogüvenlik kabini içinde çalışmak. - Yavaşça 1 mi MNT tamponu içinde seyreltilmiş IAV (X31, H3N2) içeren alantoik akışkan açıklık 30 ul gliserol gradyanlar Bindirme her gradient (20-30 ug toplam viral proteinin karşılık gelir).
- Denge tüpleri karşı ve SW41 Ultrasantrifügasyon rotor içine koyun. 55.000 x g'de 150 dakika, ve 12 ° C santrifüj.
- Santrifüj işleminden sonra, dikkatli bir şekildeTemiz bir Pasteur pipeti ve bir aspiratör kullanarak süpernatant, yani hem gliserol katmanlarını kaldırmak. 40 ul (1 x), LDS numune tamponu indirgeyici olmayan pelletini. Tamamen pelet çözülür aşağı birkaç kez pipetleyin ve önemlidir. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine örnek aktarmak.
Topak bölümleri ve Coomassie boyama 4. SDS-PAGE
- 10 dakika boyunca 95 ° C 'de, tüm numuneler ısıtın. bu, SDS-PAGE ile analiz edilinceye kadar, bu noktada numune -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Yük bir prekast gradyanı (% 4-12) üzerinde eritildi pellet 20 ul Bis-Tris Mini jeli ve çalışan tampon 1x MOPS SDS içinde 200 V de 1 saat boyunca çalışır.
- GKD 2 O'da% 40 metanol ve% 10 buzlu asetik asit ile sabitleme çözeltisi yapmak
- 1 saat için tespit çözeltisi içinde jel inkübe ve Coomassie solüsyonu yeterli bir hacmi ile 15 cm'lik bir hücre kültür kabı içinde gece boyunca hafifçe lekeOda sıcaklığında çalkalayarak.
NOT: boyama çözeltisi buharlaşmasını önlemek için yemek kapatmak için önemlidir. - GKD 2 O. jel destain Jel arka plan berrak hale gelinceye kadar GKD 2 O her 15-20 dakikada bir değiştirin. Bu bant ölçümü için taranır kadar 4 ° C 'de GKD 2 O jel saklayın.
- yüksek çözünürlükte jel tarayın ve protein bandı yoğunluklarının ölçümü için piyasada mevcut veya ısmarlama yazılımı kullanın. İlgili bantları yakın bir bölgeden arka plan sinyalini çıkartın ve (pH 7.4'te) deterjan içermeyen kontrol numunelerine bu değerleri normalize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce tartışıldığı gibi, endosemelerde priming yetkili olmama IAV çekirdeğini oluşturmak için gereklidir. çekirdeğin protonlanma M1 ve vRNPs etkileşimini zayıflatır (viral RNA, NP oluşan ve polimeraz kompleksi PB1 / PB2 / PA). Gelen virüsü erken endozomlarda (AİS) 6.5 (veya daha düşük) bir pH değerine maruz kalmış ve LES yaklaşık pH 5.0'a virüs sigorta kadar devam eder, bu işlem başlatılır.
pH düşmesi taklit etmek amacıyla, gliserol gradyanlar alt tabakanın sabit bir tuz konsantrasyonunda, pH 7.4 ve 5.0 arasında bir değere ayarlanmıştır. Açıklık alantoik akışkandan elde X31, SDS-PAGE ile hız gradyanı santrifüje tabi tutulur ve analiz edilmiştir (Şekil 2A, B). Karakteristik modeli ile yansıtılan gradyanı (Şekil 2A, Lane1) içinde mevcut olan deterjan olmadan bozulmamış virionların, topaklanırHA (HA1 ve HA2; 63 kDa) temsil eden bantlar Coomassie, NP (56 kDa) ve M1 (27 kDa) jel boyandı. Jel indirgeyici olmayan koşullar altında bu yana, proteolitik klivaj HA1 ve HA2 de disülfid bağları ile bağlı olan ve yaklaşık olarak 64 kDa çalıştırılır. Indirgeyici koşullar altında HA1 ve HA2 tekabül eden bantlar sadakatle yorumlamak ve sadece viral çekirdek (Şekil 2B) elde edilir bant yoğunlukları belirlemek güçleştirir sırasıyla PN ve M1 bantlar çok yakın görünür.
Alt NP-40 eklenmesi üzerine (% 25) gliserol HA, NA dahil olmak üzere viral zarf tabaka, ve M2 çözündürülmüş ve viral çekirdek başına ultra-santrifüj (Şekil 1, Şekil 2, bölme 2) boyunca pelet haline çökeltilmiştir. 6.5 altında bir pH değerine sahip başlayarak, M1 yavaş yavaş pH 5.8 ve 5.4 (şekil arasında en az ulaşan Pellet fraksiyonunda kaybolurŞekil 2A, B). pH altında 5.8 vRNPs ayrışmış ve bu şekilde pelet kaybetti. Daha önce, bu da açma Pellet fraksiyonunda 16 PB2 kaybı ile ilişkili olarak, aslında bütün vRNPs üst tabaka salınır, gösterilmiştir. Protein bant yoğunlukları vRNP demetleri, sırasıyla (Şekil 2) M1 tabakası ve ayrışma sökmesi iki farklı pH eşiklerini açığa belirlendi. Ek şeritler polimeraz proteinleri PB1 (87 kDa), PB2 (86 kDa), PA (83 kDa), ve • M2 (11 kDa) karşılık gelebilir jeli üzerinde gözlenebilir. IAV virionlar içinde kendi alt kopya sayılarına nedeniyle biz güvenilir kimliklerini belirleyemedi ve dolayısıyla ölçümü için dikkate alınmamıştır.
Şekil 1: IAV şematik gösterimi 
Şekil 2: asitleştirme üzerine in vitro IAV çekirdek demontaj (A) daha düşük gliserol tabakasından farklı pH koşullarında X31 çekirdek in vitro demontaj.. Bir kontrol olarak, NP-40 taban gliserol tabaka (ilk şerit) çıkartılmıştır. Numuneler, Coomassie boyaması ile indirgeyici olmayan koşullar altında SDS-PAGE ile ayrıldı. Viral protein bantları sağda gösterilmiştir. (B) (a) 'da gösterilen, viral protein bantlarının yoğunluğu dansitometrik miktar. M1 ve NP protein Bant yoğunlukları NP-40 olmadan, pH 7.4'te olanlara göre normalize edildi. Veriler, standart sapma (SD) ± çift deney aracı olarak temsil edilir. Stauffer ve diğ., 2014, 16 uyarlanmıştır.ge.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viral kapsidler metastabil makromoleküler kompleksler bulunmaktadır. virionlar montaj virüs genomunun encapsidation ve yoğunlaşmayı gerektirir, enfeksiyon sonraki turda başlanması bu kompakt kapsid yapısının sökülmesi bağlıdır. Virüsler hücresel reseptörler, şaperonlar, proteolitik enzim, motor protein ve helikazlar yanı sıra pH ve iyonik anahtarları 26,27 tarafından sağlanan fiziksel kuvvetler de dahil olmak üzere kılıf kılıfının döngüsü kontrol etmek için çeşitli hücresel mekanizmalar yararlanmaya gelişmiştir. Burada, özellikle IAV çekirdeğin sökme teşvik faktörlerin etkisini test etmek için bir gliserol gradyan santrifüj göre bir in vitro yöntem anlatılmaktadır. teknik, potansiyel olarak, diğer kılıflı virüsler kılıfının işlemleri kesme için adapte edilebilir.
colloidal coomassie M1 ve NP, ve HA açık şekilde nispeten küçük bir virüs katılımı ile SDS-PAGE içinde tespit edilebilir önemli yapısal IAV proteinleri kullanılarakle numarası. Oysa, bir daha derinlemesine tortulaşmış kapsid yapısının karakterizasyonu ve takibini gerektirecek kompozisyon analizleri, (daha önce 28 olarak sunulan) elektron mikroskopisi gibi, Western blot, dinamik ışık saçılımı veya kütle spektrometresi. protokol fazla uzama spesifik çekirdek bileşenlerinin düşük (% 25) gliserol faz ve analiz fraksiyonasyon içerebilir.
(X31 için) 5.0 optimal füzyon pH daha düşük gliserol tabakasından ayarlanması matriks tabakasının hemen hemen tam bir ayrışma (Şekil 2) 16 yol açmıştır. Bununla birlikte, giriş NP sinyalinin yaklaşık% 30 de bu pH değerinde tespit edilebilir. Nedeniyle böyle son zamanlarda tanımlanmış histon deasetilaz 6 (HDAC6) 18 olarak bu kurulum hücresel kılıfının faktörlerin, yokluğu, eksik sökme meydana mümkündür. Hücre içinde Na + 'dan bir anahtar viral çekirdek ve maruz kalma yavaş asitlenme + K 16 faktörleri olmama tarafından kontrol tam vRNP serbest bırakılması için virüs asal. Bizim kurulumunda, non-iyonik deterjan kısmen asit maruz kalan ve istikrarsız çekirdek bozduğunu gözardı edilemez. Bununla birlikte, nötr pH'ta çöktürülmesi çekirdek üzerinde bir etkisi olmayan çözündürülmüş numune ile karşılaştırıldığında benzer bir protein bandı yoğunlukları ile gösterilen görülmektedir (Şekil 2A, kuşak 1 ve 2). (Örneğin olduğu gibi), burada sunulan kanıtlanmıştır deney grubu ölçümü için yeterince sağlam oldukça üretilebilir ve olmak rağmen, varyasyon, belirli bir aralık gözlenebilir.
Bu protokolde, gliserol kullanılması deney sonucu için kritik öneme sahiptir. Daha önce 17 bildirdiği gibi, bir sukroz aşamasına göre ultrasantrifügasyon bağlı sakroz tarafından oluşturulan yüksek bir ozmotik kuvvet muhtemeldir IAV çekirdek, stabilize eder. sakaroz geçişlerini aracılığıyla IAV saflaştırılması benzer etkilere neden olabilir. Bu nedenle yumurta yetiştirilen X31 cl elde karşılaştırıldığında arified allantoik sıvı ve sükroz-saflaştırılmış stokları. Önemli bir farklılık temel stabilitesi üzerindeki asidik pH etkisi ile ilgili olarak gözlenebilir (veriler gösterilmemiştir). Bununla birlikte, ozmotik açıdan aktif sukroz potansiyel yan etkilerinin dışta bırakılması amacıyla, allantoik açıklık sıvı veya konsantre hücre kültürü süpernatanları ile in vitro olmama tahlilin gerçekleştirilmesi önerilir.
degrade malzeme seçimi yanında, parçalanmış viral çekirdeklerin sedimantasyon davranışını etkilemek ve tekrarlanabilir sonuçlar garanti değil degrade bütünlüğünü korumak için çok önemlidir. Buna ek olarak, ultra-santrifüj sonrasında pelet fraksiyonunun tam olmayan yeniden süspansiyon haline olasılıkla farklı sonuçlara yol açar. iyonik konsantrasyon küçük değişiklikler viral çekirdek istikrar üzerinde ciddi bir etkiye sahip olabilir Son olarak, şiddetle deney aynı gün ideal deterjan içeren tampon çözeltiler pH ayarlanması önerilir.
içerik "> Özellikle IAV gerginlik bağlı olarak, farklı sökme verimlilikleri ilgili M1 özelliklerine göre meydana olabileceğini dikkat etmek önemlidir ve NP Bu da mutant virüs söz konusu olabilir. varyantları. Böylece, matris katmanı ve vRNP pH eşikleri ayrışma etkiyi; test etmeden önce, ilgili IAV suşu için belirlenmemiştir. Bu M1 yarı maksimal sökme elde edildiği şekilde, pH değerinin alt gliserol tabaka ayarlanması tavsiye viral esas stabilitesi üzerindeki özel koşullar analizi için. mümkündür Bu duruma göre, deterjan içeren bir tabaka değiştirerek belirli bir iyon veya indirgeyici maddelerin etkisini araştırmak. farzedilen hücresel kılıfının faktörler gliserol gradyanı doğrudan ilave edilebilir. sitoplazmik faktörler durumunda, gradyan altındaki üçüncü gliserol tabakası olabilir nötr pH'a ayarlanır olan kişiye ilgi hücresel faktör içerir ve deterjan ihtiva etmez. Bu şekilde, incie Üç katlı degrade daha yakından nötr sitoplazmaya endositik sistemi ve gen segmentlerinin serbest bırakılması yoluyla virüsün geçişini taklit ediyorum.Birlikte ele alındığında, biz IAV girişi bağlamında çeşitli soruları ele almak üzere çok yönlü değişiklikler için potansiyele sahiptir IAV emişli ve olmama, incelemek için sağlam ama basit in vitro test sunuyoruz. Buna ek olarak, ilgili kılıfının mekanizmaların diğer kılıflı virüsler giriş işlemlerini incelemek için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz reaktif bize sağlamış Yohei Yamauchi ve Roberta Mancini teşekkür ederiz. AH laboratuvar Marie Curie ilk Eğitim Ağları (ITN) tarafından desteklenmiştir, ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) (Sinergia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 G, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS sample buffer (4x) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer (20x) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0-7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 mm x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4 °C |
References
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
- de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
- Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
- Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
- White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
- Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
- Palese, P., Shaw, M. L. Chapter 47. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Lippincott Williams & Wilkins. 1647-1690 (2006).
- Chou, Y. -Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
- Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
- Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
- Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
- Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
- Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
- Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
- Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
- Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
- Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
- Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
- Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
- Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
- Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
- Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
- Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).
