Summary
L'utilisation de souris rapporteurs couplés à la montagne entière et section coloration, la microscopie et des essais in vivo facilite l'analyse des mécanismes sous - jacents la structuration normale des voies respiratoires. Ici, nous décrivons comment ces techniques ont contribué à l'analyse de la signalisation Wnt au cours du développement de la trachée.
Introduction
Le développement des voies respiratoires est initiée par jour embryonnaire 9 (E9) avec l'apparition de cellules positives Nkx2.1 dans le endodermique ventral foregut 1,2. Tube de séparation oesophagien-trachéale résoudra par E11.5 lorsque les tubes peuvent être distingués comme des entités distinctes, chacune entourée d' un tissu mésenchymateuses 3. Wnt joue un rôle clé dans la description des voies respiratoires comme la suppression de Wnt2 et WNT2B, exprimé par le mesenchyme splanchnique et la suppression de β-caténine de l'épithélium respiratoire endodermique entraîne agenesis du poumon 4,5. Nos études antérieures ont déterminé que la suppression de Wls, un récepteur de chargement médiation de la sécrétion de tous les ligands Wnt, à partir des résultats des voies respiratoires dans endodermiques hypoplasie pulmonaire, des défauts dans le développement vasculaire pulmonaire et une mauvaise formation de motifs du mésenchyme trachéale 6,7. Ces données confirment l'importance de la cro épithéliale-mésenchymateusess parler dans la différenciation cellulaire et la spécification, comme il a également été démontré dans d' autres études 8,9.
L'étude des premiers stades du développement du poumon repose sur génétique, in vitro et ex vivo techniques qui nous ont permis de mieux comprendre les mécanismes d' entraînement identité respiratoire 10-16. Entières cultures d'explants du poumon à l'interphase liquide de l' air ont été largement utilisés pour étudier les effets de facteurs de croissance dans les premiers stades de ramification pulmonaire morphogenèse 10,17,18. Bien que cette méthode est utilisée en tant que lecture des changements morphologiques, tels que la morphogenèse de ramification, et la modulation de l' expression génique, il est limité à l'étude des premières étapes du processus de développement, car la culture elle - même ne supporte pas le développement du système vasculaire 17. Développement du cartilage trachéal nécessite de plus longues durées d'incubation qui peut-être pas compatible avec cette technique de culture.
Pour Analyze le rôle de la signalisation Wnt pendant la formation des voies respiratoires, nous avons adapté des techniques standard pour répondre aux besoins de nos études embryonnaires. Nous avons modifié les volumes, les temps de coloration, le vélo de traitement pour l'inclusion en paraffine et le calendrier pour la compensation du tissu trachéal-poumon. L'objectif principal d'optimiser les techniques décrites dans la présente étude était d'analyser les premiers stades du développement trachéale chez les souris qui ont lieu à partir de E11 à E14.5. Utilisation de la souris reporters ligne Axin2LacZ nous sites précisément déterminés de Wnt activité / β-caténine dans le trachéale mésenchyme en développement. Nous avons également adapté lectine procédure de coloration pour les tissus ensemble trachéale monture. Ainsi, nous avons pu visualiser condensations mésenchymateuses et de prédire les sites où chondrogenèse aura lieu. Coloration de la montagne ensemble et sections de tissus embryonnaires obtenues à partir de souris WlsShhCre, couplées avec des techniques de microscopie de pointe, nous a permis de dévoiler le rôle des ligands Wnt produits par le traépithélium trachéale en trachéale patterning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les animaux ont été logés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes. Les souris ont été traitées selon des protocoles approuvés par CCHMC Institutional Animal Care et utilisation Comité (Cincinnati, OH USA). Les souris utilisées au cours de ces études ont été maintenues dans un fond mixte.
1. Whole Mont X-galactosidase Coloration
- Euthanasier femme enceinte à E11.5 à E14.5, par inhalation de CO 2. Placez les animaux en CO 2 chambre, charger la chambre avec du CO 2. Maintenir les animaux dans la chambre pour un minimum de 5 min. Effectuer méthode secondaire de l'euthanasie par dislocation cervicale.
- région abdominale Clean avec de l'éthanol (EtOH) 70% et d'effectuer une laparotomie avec une seule incision médiane abdominale. Utiliser des ciseaux chirurgicaux et modèle standard (dentelées droite) de forceps.
- Isoler cornes utérines à l'aide de pinces et de ciseaux fins et immédiatement placer le tissu dans un plat de Pétri contenant réfrigéré solution PBS. Maintenir le tissu sur la glace jusqu'à procédurel'isolement des embryons.
- Isoler embryons de cornes utérines. Disséquer tissu trachéal pulmonaire embryonnaire en utilisant un microscope binoculaire. Utiliser des pinces et ciseaux à pointe fine pour maintenir et perforer le tissu utérin et concepti libérant les embryons.
- Retirer les membranes restantes embryonnaires. Avec l'aide de lames d'aiguille couper la tête d'embryons et de la partie inférieure du corps en dessous du diaphragme. Localiser foie comme un point de repère.
- Après l'isolement de la région thoracique de l'embryon, passez à retirer les côtés latéraux de la paroi du corps, la colonne vertébrale et le cœur en utilisant des lames d'aiguille. Faites attention tout en retirant le cœur pour éviter de blesser le tissu trachéal. Enfin, soigneusement, séparer l'œsophage de la trachée en tirant l'oesophage avec l'aide de lames d'aiguille. Maintenir le tissu dans une solution PBS sur la glace.
- Placez le tissu dans 4 ml vis flacons de chapeau à l'aide de verre ou de transfert pipettes. Fixer le tissu pulmonaire dans la trachée 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS pendant 30 min. Après fixation,rincer le tissu avec du PBS. Lors du rinçage, préparer la solution de coloration X-gal (ajouter 5 mM K 3 Fe (CN) 6, (100 ul de 0,5 M stock) 5 mM K 4 Fe (CN) 6 (100 ul de 0,5 M stock) MgCl2 2 mM, ( 20 pi 1 M actions) 0,01% NADOC (50 pi 2% stock), 0,02% de NP 4 O (100 pi 2% stock), 1 mg / ml X-gal (500 pi de 20 mg / stock ml) et 9,13 ml de l'eau distillée pour amener à un volume final de 10 ml).
- Retirez tout PBS restant et ajouter 2 ml de solution de coloration X-gal dans le flacon de verre. Placer les flacons dans le bac sur un agitateur. tissus Tache 1 à 2 heures dans une solution de coloration X-gal. Incuber le tissu en solution X-gal pendant 4 heures pour un traitement ultérieur et l'intégration.
- Arrêter la réaction par les tissus de lavage dans 3% de diméthylsulfoxyde-PBS. Rincer dans du PBS, 3 fois pendant 5 minutes chaque lavage et stocker dans 70% d'éthanol.
- Remplir des boîtes de Pétri avec une solution / PBS 1% d'agarose. Laisser agarose à se solidifier. Utilisation de pipettes de transfert de verre, placer le tissu sur la coopération agaroseplaques ATED remplis de solution PBS. Photographie montures entières en utilisant un microscope à dissection. Sélectionnez le filtre approprié pour fond clair.
- Pour mieux distinguer les sites d'échantillons de procédés de coloration X-gal pour inclusion dans la paraffine et la coupe. Placer les échantillons dans de fines cassettes d'écran.
- Pour traiter des échantillons pour l'inclusion en paraffine utilisent un processeur automatisé et mis en place un cycle court comme suit: six changements d'alcool: 5 min premier changement et 3 min par chaque changement restant. Trois changements de Xylène: 5 min premier changement et 3 min deux prochaines modifications. Les étapes précédentes sont effectuées à 30 ° C. Enfin, effectuer trois changements de paraffine à 62 ° C: 25 min, 8 min et 5 min.
- échantillons Orient pour l'intégration avec le tissu à plat sur le fond du bateau. intégration Ajouter délicatement la paraffine pour remplir le bateau enrobage. Refroidir immédiatement sur la plaque froide d'incorporer la station jusqu'à ce solidifie paraffine. Retirer le bloc de bateau intégration. L'utilisation d'un microtome, générer 6 um sexions. sections de montage sur-diapositives prétraités et diapositives sèches sur diapositive chaud réglé à 42 ° C pendant 1 heure.
- Cuire glisse pendant la nuit dans un four à 56 ºC. Placez les diapositives dans les racks. Déparaffiner glisse avec trois changements de 100% Xylène, 10 min chacun. Utiliser la coloration des plats remplis avec 200 ml de xylene.
- Réhydrater lames à l'aide d'EtOH série graduée (100%, 70%, 50% et 30%, 1 min par étape) pour PBS avant avec contre-coloration nucléaire rouge rapide pendant 10 à 30 secondes. Rincer les lames avec de l'eau du robinet à trois reprises pendant 5 minutes à chaque fois pour éliminer l'excès de Nuclear Fast Red.
- Déshydrater les lames dans une série EtOH gradué (50%, 70% et 100% EtOH) avant le lavage en trois changements de Xylène (20 trempettes chaque changement) et la couverture de glissement avec les médias de montage à base de xylène.
2. lectine Coloration
- Disséquer le tissu pulmonaire E13.5 et E14.5 trachéale, comme décrit dans les étapes 1.1 à 1.4. Utilisation de pipettes de transfert de verre lieu tissu dans des flacons à bouchon à vis. Fixer le tissu pulmonaire trachéale avec 2 ml d'solution PFA 2% durant la nuit à 4 ° C. Après fixation, rincer les échantillons dans du PBS trois fois pendant 10 min à chaque lavage.
- Préparer un tampon de blocage, habituellement un volume final de 10 ml de solution. Ajouter 0,1 g de BSA (1%) à 8 ml de PBS. Laisser BSA se dissoudre. Ajouter 0,2 ml de sérum de chèvre (2%), de 0,03 ml de Triton X-100 (0,3%). Amener le volume final à 10 ml avec du PBS. échantillons de bloc pendant 1 heure dans 0,5 ml de tampon de blocage à la température ambiante.
- Éliminer le tampon de blocage à l'aide d'une pipette de transfert et de le remplacer par une solution de lectine constituée de 50 pg / pl de la lectine, du sérum de chèvre à 10% et du PBS. En utilisant 250 pi de solution de lectine par échantillon. Incuber une nuit à 4 ° C. Assurez-vous de couvrir le flacon en verre contenant du tissu avec une feuille d'aluminium. Après incubation avec une solution de lectine, rincer les échantillons dans du PBS trois fois pendant 10 minutes.
- La place explants dans des boîtes de Pétri d'agarose enduit contenant assez PBS pour couvrir les échantillons. Photographie monte entier en utilisant un microscope à fluorescence-dissection. Sélectionnez le appropFiltre riée pour détecter la fluorescence. Lectine PNA est généralement couplée à la GFP.
3. Le total du Mont immunofluorescence et microscopie confocale
- Isoler tissu pulmonaire trachéale, transfert à 4 ml flacons de bouchon à vis en verre et fixer une nuit dans 4% PFA. E11.5 tissu peut être fixé dans 2% de PFA. Magasin dans le méthanol à 100%. Les échantillons peuvent être stockés jusqu'à plusieurs mois à -20 ° C.
- Retirer le méthanol en utilisant le transfert pipette et perméabiliser échantillons en utilisant l'eau de Javel de Dent (4 parties de méthanol, 1 partie DMSO et 1 partie 30% de H 2 O 2) pendant 2 heures. tissu hydraté dans une série graduée de méthanol dilué dans du PBS comme suit: 100% de methanol, 75% de methanol, 50% de methanol, 25% de methanol à 100% PBS. Incuber 10 minutes à la température ambiante pendant chaque étape d'hydratation.
- Bloc tissu dans 0,5% de réactif de blocage dilué dans du PBS (voir Matériaux pour les détails) pendant deux heures à la température ambiante sous agitation.
- Diluer l'anticorps primaire à bloquersolution (Sox9 1: 100, Nkx2.1 1: 200, αSMA 1: 250) et incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ° C. échantillons Laver avec du PBS cinq fois à la température ambiante. Effectuez chaque lavage pendant 1 h.
- Appliquer un anticorps secondaire à une dilution de 1: 500 dans une solution de blocage à 0,5%. Sélectionnez soigneusement les anticorps secondaires pour empêcher la liaison entre les anticorps secondaires. Incuber une nuit à 4 ° C en chambre noire. échantillons Laver trois fois pendant 20 min à température ambiante. Déshydrater les échantillons dans une série graduée de méthanol dilué dans du PBS comme suit: 25% de methanol, 50% de methanol 75% de methanol, 100% de methanol, 10 minutes à chaque étape.
REMARQUE: Veiller à ce que les échantillons restent recouverts de papier d'aluminium et de minimiser l'exposition à la lumière. Le tissu peut alors être stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines jusqu'à ce que photographier. - Échantillons de transfert à fait personnalisé plaques d'étape, enlever le méthanol et clair avec environ 200 pi de solution claire de Murray 19,20 (2 parties benzoate de benzyle, 1 partie alcool benzylique) immédiatement befimagerie du minerai. Photographie à l'aide d'un microscope confocal. Traiter et analyser l'image en utilisant un logiciel d'imagerie.
Prolifération 4. Cell
- Injecter des souris gravides de E11.5 par voie intrapéritonéale avec une solution de BrdU à une concentration de 100 ug BrdU / g de poids corporel. Sacrifiez femelle comme décrit dans l'article 1 du protocole et d'isoler les embryons à E12.5 ou E13.5. En utilisant des lames de couteau, des têtes d'accise et la partie inférieure du corps en dessous de la cavité thoracique.
- Placez le tissu thoracique dans 4 ml vis flacons de chapeau et fixer dans 1 ml de 4% PFA pendant la nuit. Laver avec du PBS des échantillons deux fois pendant 5 min et déshydrater les échantillons à travers une série d'éthanol dilué dans de l'eau distillée jusqu'à 70% d'éthanol comme suit: 30%, 50% et 70% d'éthanol, pendant 5 minutes à chaque étape.
- Placer les échantillons à écran cassettes de taille moyenne. tissu de processus pour l'incorporation de la paraffine en utilisant et un processeur automatisé. Mettre en place un cycle comme suit: six changements d'alcool pendant 8 min chacun, trois changements de Xylène pour 6 min chacun, trois changements de paraffine, pour 25 min, 9 min et 8 min.
- Incluez dans de la paraffine orienter le tissu dans la position désirée pour générer 6 um transversales ou des sections longitudinales tel que décrit dans la section 1. sections de place sur des lames et permettre au tissu d'adhérer à glisser sur la lame chaude ensemble à 42 ° C pendant 1 heure.
- diapositives Cuire, sur leurs côtés, une nuit dans un four à 56 ° C. Placez les diapositives dans les racks en plastique. diapositives De-paraffinize par immersion dans trois changements de 100% Xylène, 10 min par changement. Utiliser 200 ml de Xylène pour submerger complètement les diapositives. Réhydrater lames à l'aide d'EtOH série graduée (100%, 70%, 50% et 30%, 5 minutes par étape avec agitation) à du PBS (5 minutes).
- Effectuer la récupération de l'antigène à l'aide tampon citrate 10 mM, pH 6. Pour préparer 100 ml de mélange de tampon de citrate 18 ml de 0,1 M d'acide citrique monohydraté et 82 ml de 0,1 M de citrate de sodium.
- Placer les échantillons en plastique bocaux Coplin remplis avec une solution de récupération d'antigène et micro-ondes pendant 6,5 min à puissance élevée. Ajouter dislabouré eau pour bocal de Coplin pour compenser évaporées-tampon citrate et réchauffer à 40% de puissance pendant 6 min.
- Remplissez jarre Coplin vers le haut avec de l'eau, et réchauffer à nouveau à 40% de puissance pendant 6 min. temps de micro-ondes peut varier en fonction des micro-ondes utilisé.
- Laisser les lames refroidir pendant 20 min à température ambiante avant des lames de lavage dans de l'eau distillée pendant 1 min, puis du PBS pendant 5 min. Après la PBS laver, bloc glisse pendant 2 heures dans une solution de blocage contenant TBS (2,425 g de base Tris et 8,765 g de NaCl dilué dans 1 litre d'eau distillée) 10% de sérum d'âne et 1% de BSA.
- Ajouter des anticorps primaires dilués dans une solution de blocage (TBS contenant 10% de sérum d'âne et 1% BSA). BrdU (marqueur de la mitose), Nkx2.1 (de l'épithélium des voies respiratoires), Sox9 (cellules qui donneront lieu à du cartilage) et αSMA (cellules musculaires lisses). Incuber les lames pendant une nuit, à 4 ° C. Utiliser la méthode de superposition pour conserver des anticorps. Appliquer 180 pi d'anticorps à un joint, puis fixez slide comme si lamelleping.
- Détachez joint en plongeant les lames dans l'eau distillée. Après le retrait du joint, laver l'anticorps primaire non lié en effectuant six 5 min lavages avec du TBS contenant 0,1% de Tween-20.
- Incuber les lames avec de l'anticorps secondaire dilué dans une solution de blocage à une dilution de 1: 200, pendant 1 h à température ambiante. Sélectionnez Anticorps secondaires soigneusement pour empêcher la liaison indésirable parmi eux. Retirer l'anticorps secondaire non lié en effectuant trois lavages de cinq minutes avec du TBS contenant 0,1% de Tween.
- Laver les lames à 0,1 base M Tris deux fois pendant 5 min puis 0,05 base M Tris deux fois pendant 5 min. Les lames peuvent être laissés dans 0,05 base M Tris tout coversliping en utilisant les médias de montage avec ou sans DAPI (1,5 pg / ml). Stocker les lames dans le dossier de diapositives à 4 ° C et protéger de la lumière, en recouvrant le dossier avec une feuille d'aluminium.
- Visualisez la coloration et de la photographie en utilisant un microscope à fluorescence automatisé. Nombre de cellules marquées et cellules totales par champ photographié au20X et 40X pour déterminer les rapports des cellules en prolifération aux cellules totales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wnt activité / β-caténine
Toute coloration mount Lac-Z a été détectée dans le tissu trachéal-poumon d'embryons isolés de journaliste Axin2 Lac -Z souris 11. Sites de coloration indiquent Wnt activité / β-caténine. L'analyse des coupes de toute coloration de montage a déterminé que l'activité Wnt / β-caténine est présent dans le mesenchyme de la trachée et dans mésenchyme des régions périphériques des poumons en développement. Dans les embryons WlsShhCre (dans laquelle la sécrétion de ligands Wnt de l'épithélium des voies respiratoires a été abrogée) Lac-Z coloration était presque absente (Figure 1).
condensations mésenchymateuses dans trachéale mésenchyme
Une étape cruciale dans la chondrogenèse est le processus par lequel les cellules mésenchymateuses vouées à donner rise au cartilage se condensent. Ces agrégations serrés de cellules sont appelées condensations mésenchymateuses. Pour tester si le manque de cartilage observé chez les souris WlsShhCre était due à une absence de condensations mésenchymateuses, les tissus pulmonaires trachéaux d'âges gestationnels E12.5 à E14.5 ont été colorées avec PNA lectine. À E13.5 et E14.5, la fluorescence est détectée sous forme de bandes périodiques dans le mesenchyme trachéale au niveau des sites où le cartilage sera formé. Absence de fluorescence détectable dans le tissu de la trachée d'embryons WlsShhCre endodermique indique que la signalisation Wnt au mésenchyme trachéal est nécessaire pour les condensations mésenchymateuses (figure 2).
spécification des cellules des voies respiratoires
Whole immunofluorescence montage des tissus pulmonaires trachéales a déterminé le profil d'expression de Sox9, Nkx2.1 et αSMA à E11.5. Dans le tissu trachéal, expression Sox9 est limiteed pour le mesenchyme de la trachée forme d' une bande continue (flèche sur la figure 3A et B) , tandis que dans le développement de poumon Sox9 est observée à la périphérie de l'épithélium respiratoire (têtes de flèche sur la figure 3A, B et C). Nkx2.1 présente un motif d'expression distinct limité à l'épithélium de la trachée du poumon. La prévention de la sécrétion de ligands Wnt provoque l'expression de l'épithélium de la diminution Sox9 dans trachéale mésenchyme mais ne modifie pas l'expression Sox9 dans l'épithélium pulmonaire périphérique. L' expression de αSMA n'a pas été facilement détectée dans trachéale mésenchyme, cependant coloration n'a été détectée au niveau du larynx (flèche jaune, figure 3) et de l' estomac (figure 3).
La prolifération cellulaire dans la trachée en développement
Prolifération dans l'épithélium et mésenchymede la trachée a été détectée après un marquage in vivo des tissus avec du BrdU. Des sections de tissu trachéal ont été colorées avec des anticorps reconnaissant la BrdU, et Sox9 αSMA. Le profil de prolifération dans le mesenchyme trachéale indique que le niveau de prolifération des cellules colorées Sox9 subissant est supérieur au niveau de αSMA cellules colorées en train de proliférer. Ce modèle de prolifération semble être revenue dans trachées WlsShhCre (figure 4).
Figure 1: activité Wnt / β-caténine est fonctionnel dans le tissu trachéal mésenchyme E13.5 trachéale du poumon, isolé à partir Axin2-LacZ et WlsShhCre. Axin2 souris-LacZ, ont été colorées avec X-gal (A et B). Sections de tissu trachéal du poumon ont été contre - rouge rapide (A ', B'). Notez l'absence de X-galcoloration au WlsShhCre; Axin2-Lac-Z souris démontrent l' absence d'activité Wnt / β-caténine (B '). Tissu E14.5 de souris Axin2 LacZ colorées avec X-gal représente des sites d'anneaux cartilagineux futurs (C); toutefois, l' activité Axin2 a été limitée à la périphérie (tête de flèche) des condensations mésenchymateuses (flèche) (D). Barre d'échelle A, B et C = 500 pm; B ', D' et D = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Condensation mésenchymateuses dans le développement du tissu trachéal E13.5 explants trachéale-pulmonaires ont été colorées avec PNA lectine. Tissu trachéal de contrôle représentant les régions étaient des cellules mésenchymateuses condensés est montré (flèches A C). Aucun condensations mésenchymateuses ont été détectés chez les souris WlsShhCre (B et la flèche en D). C et D représentent plus faible grossissement du tissu trachéal-poumon montré en A et B. Barre d'échelle A et B = 1 mm; C et D = 2 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: schéma d'expression dans la prechondrogenic monter la trachée Nkx2.1 et Sox9 coloration a été détectée dans des explants de E11.5.. Le panneau A représente une image d'un tissu de contrôle, tandis que le panneau B montre une section optique d'un tissu 20 um de commande. Notez l'absence d'expression mésenchymateuses de Sox9 dans le tissu WlsShhCre (flèche en C), but maintien de l' expression périphérique de Sox9 (pointe de flèche en C). αSMA coloration a été détectée à des niveaux faibles dans trachealmesenchyme du tissu E11.5 mais observée dans la région laryngée (tête de flèche jaune D et E), de l' estomac (S) et le reste du tissu cardiaque (CT) (E). Nkx2.1 est exprimée dans l' épithélium de développer trachée et les poumons (D, E). Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. Motif de la prolifération cellulaire dans mésenchyme prechondrogenic Sections d'embryons de E13.5 ont été colorées avec des anticorps anti BrdU, Sox9 et anticorps αSMA. Les panneaux C et D sont des grossissements plus élevés d'un B respectivement. lignes pointillées représentent les limites de l'épithélium de la trachée. Remarque Sox9 cellule colorée proliférante (flèche C) et αSMA prolifération cellulaire colorée (pointe de flèche en D). T = trachée, E = œsophage. Barre d' échelle A et B = 50 um, C et D = 20 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evénements sous-tendent la morphogenèse des voies respiratoires ne sont pas complètement compris, en particulier les processus nécessaires à la structuration des voies aériennes. Des études antérieures ont utilisé des techniques ex vivo dans lequel explants en développement sont cultivées à l'interphase air-liquide ou incorporé dans matrigel 21,22. Ces études ont montré que les facteurs de croissance influent sur la formation de motifs de la trachée et le développement de la formation de cartilage trachéal. Une limitation de ces études est que l'architecture du tissu est pas entretenu correctement et par conséquent, ils ne peuvent pas tout à fait récapituler le processus in vivo de la chondrogenèse.
L'approche que nous avons entrepris d'étudier le rôle de la signalisation Wnt dans le processus de réalisation des voies aériennes de motifs inclus dans les études in vivo couplées à des techniques de coloration de montage entières, immunofluorescence et de l' imagerie. X-gal coloration de tissu toute la montagne suivie par soictioning et contre-coloration, présente des avantages par rapport à la coloration des coupes en paraffine. Toute coloration de montage permet la détection directe des sites où l'activité Wnt / β-caténine est opérationnel. En outre, sectionnant des explants tachés déterminé des endroits précis dans le mésenchyme dans lequel l'activité a été localisé que le développement progresse. Ce dernier est une lecture meilleure et plus précise que la détection de l'expression de la β-galactosidase, enzyme dans des coupes en paraffine. Alors que l'activité enzymatique peut être détectée dans les sections, cette procédure nécessitera cryosections qui ne seront pas toujours faciles à générer et peuvent ne pas préserver l'architecture de petits échantillons. Une limitation dans le protocole décrit dans le présent document, est que le traitement des échantillons pour l'inclusion en paraffine après toute coloration de montage provoque une perte du signal. Par conséquent, les échantillons doivent rester plus longtemps en solution X-gal et un cycle plus court pour l'incorporation de la paraffine devraient être utilisés pour obtenir bon signal sur les sections.
D'autre part, la procédure entière d'immunofluorescence mount, modifiée après la technique décrite par Ahnfelt-Ronne 23, a permis pour la visualisation tridimensionnelle de développer trachéale et le tissu pulmonaire, avec un motif d'expression défini des protéines codées par des facteurs clés de transcription tels que Nkx2.1 et Sox9. Si on le désire, toute coloration de montage peut être présenté comme confocale assistée z piles d'images, représentant différentes profondeurs du tissu trachéal du poumon. Alors que l'imagerie des petits explants, la compensation du tissu doit être effectué dans une plaque de platine. Nous avons utilisé une épaisseur métalliquefait sur mesure des plaques de scène avec fond optique où les échantillons sont effacés et imagées. Cela empêche la perte de matière tout en transférant petit tissu après l'étape de compensation. Alors que toute immunofluorescence monture est une technique appropriée pour la coloration des petits tissus, nous reconnaissons les limites de la technique. En particulier, nous avons observé des performances inégales des anticorps qui reconnaissent l'antigène mieux dans les sections par opposition à la montagne entière. Ce problème peut empêcher l'exécution de la technique si aucun anticorps de remplacement sont disponibles. Il est également possible que l'utilisation de méthanol et de compensation avec du clair Murray peut avoir un impact négatif sur le signal observé. À l'avenir, nous allons tester d' autres solutions de compensation non-organiques et d' ajuster le protocole correctement à cet effet 24. Une dernière considération est que la montagne entière permettra l'étude de quelques protéines exprimées dans un tissu à un moment donné.
Les rapports précédents ont montré l'utilité dePNA lectine de coloration afin de détecter les condensations mésenchymateuses dans des sections de tissu trachéal 21,25. Dans la présente étude, nous présentons une méthodologie par laquelle la coloration a été réalisée dans la montagne entière, ce qui facilite une meilleure visualisation des régions de la trachée dans laquelle le cartilage sera formé. Tout en exécutant lectine soins de coloration doit être placé dans l'utilisation de la concentration appropriée de lectine de ne pas trop tache, comme disponible dans le commerce PNA-lectine est couplée à la GFP. Auto-fluorescence du tissu peut masquer les résultats faisant difficiles à distinguer des bandes correspondant aux mésenchymateuses condensations.
Enfin, l' étiquetage des tissus avec BrdU in vivo suivie en sectionnant et immunofluorescence est une technique possible de déterminer la prolifération cellulaire qui présente des avantages sur la coloration typique et statique tel que PPh3 ou PCNA 26,27. Cette dernière technique présente des limitations, car la coloration varie en fonction de lal'étape du cycle cellulaire. Ce problème est éliminé par notre technique décrite. La combinaison de marquage in vivo suivie par l' incorporation, sectionner et immunofluorescence a permis de déterminer que épithéliale Wnt ligands équilibrer la prolifération différentielle de Sox9 et α-SMA exprimant les cellules qui donneront lieu à trachéale cartilage et le muscle 7.
En résumé, une approche multi-technique pour l'étude de la structuration des voies respiratoires en développement permet une analyse approfondie du rôle de la signalisation Wnt dans la conduite des voies respiratoires morphogenèse. Ces études ont déterminé les emplacements précis des Wnt / β-caténine dans le tissu de la trachée, ainsi que la signalisation inductif et instructive fourni par l'épithélium trachéal qui est nécessaire pour la spécification, la prolifération différentielle des lignées de cellules trachéales mésenchymateuses, ainsi que la formation de cartilage. Nos orientations futures comprennent l'optimisation de l'ensemble de la coloration de montage pour Wls récemment identifiésgènes cibles, ainsi que d'effectuer toute immunofluorescence montage en combinaison avec la lectine coloration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
"Les auteurs n'ont rien à dévoiler."
Acknowledgments
Nous reconnaissons l'aide de Mike Muntifering et Matt Kofron avec l'imagerie confocale et Gail Macke avec les procédures histologiques. Ce travail a été partiellement financé par les Instituts nationaux de la santé-NHLBI (K01HL115447 DS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti Sox9 ab. | Millipore | AB5535 | 1:400 , rabbit |
| Anti Sox9 ab. | Santa Cruz | Sc-20095 | 1:50, rabbit |
| Anti Smooth Muscle Actin ab. | Sigma | A5228 | 1:2k, mouse |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:100, guinea pig |
| Anti NKX2.1 ab. | Seven Hills | n/a | 1:400, mouse |
| Anti Brdu ab. | Abcam | AB1893 | 1:200, sheep |
| Anti Brdu ab. | Santa Cruz | Sc-32323 | 1:4k, mouse |
| PNA Lectin | Sigma | L 7381 | |
| Secondary antibodies | Life technologies | Alexa fluor Molecular probes | |
| K3Fe(CN)6 | Sigma | P8131 | |
| K4Fe(CN)6 | Sigma-Aldrich | P3289 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| NaDOC | Life Technologies | 89905 | |
| NP4O | Life Technologies | 85124 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A-3157 | |
| Fisher brand super-frost plus | Fisher | 12-550-15 | |
| PFA (16%) | EMS | 15710 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma | 11K413 | |
| Blocking reagent | Invitrogen | Component of TSA kit #2 ( T20932) | |
| BrDu | Sigma | B5002-5g | |
| Vectashield mounting medium | Vector labs | H-1000 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Tissue-loc cassettes Histoscreen | Fisher | C-0250-GR | |
| Biopsy cassettes | Premiere | BC0109 | Available in different colors |
| Nuclear fast red Kernechtrot 0.1% | Sigma | N3020 | |
| Citric acid | Sigma | C1909-500G | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | S4641-1Kg | |
| Trizma hydrochloride | Sigma | T5941-500G | |
| Xylene | Pharmco-AAPER | 399000000 | |
| Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Micro knives | FST | 10318-14 | |
| Dumont #5 ceramic coated | FST | 11252-50 | |
| Dumont #5CO | FST | 11295-20 | |
| Dumont # 5 | FST | 91150-20 | |
| Thermo/Shandon Excelsior ES | Thermo Fisher | ||
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Nikon i90 | Nikon | Wide field microscope | |
| NikonA1Rsi | Nikon | Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10X. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. | |
| Leica MS 16 FA | Leica | Fluorescence Dissecting microscope | |
| Zeiss | Zeiss | Automated fluorescence microscope | |
| Leica Application suite | Leica | Leica imaging software | |
| NIS | Nikon | Nikon imaging software | |
| IMARIS | Bitplane | Imaging processing software |
References
- Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
- Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
- Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
- Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
- Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
- Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
- Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
- Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
- Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
- Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
- Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
- Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
- Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
- Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
- Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
- Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
- Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
- Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
- Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
- Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
- Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
- Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
- Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
- Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
- Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).
