Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء

Published: July 21, 2016 doi: 10.3791/53918
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Sagol School of Neuroscience & School of Psychological Sciences, Tel-Aviv University
* These authors contributed equally

Introduction

الجيوب الكبد تحتوي على العديد من الأنواع الفرعية الكريات البيض لمختلف الأنشطة المناعي شديدة الأهمية للكائن الحي. على سبيل المثال، تتميز marginating الكبدي (MH) القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، التي تعرف أيضا باسم الخلايا حفرة، الخلايا الليمفاوية الحبيبية شكليا الكبيرة و(LGLs) وظيفيا كما الكريات البيض مع قدرة السامة للخلايا عفوية، مما الكبدي المقاومة ضد إنشاء بالدم الانبثاث ورم المنقولة. الهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تمكين الحصاد الانتقائي من الكريات البيض MH، من أجل دراسة هذه الفئة من السكان الخلية مهم وفريد ​​(ومقصورة المناعة)، وإلقاء الضوء على تأثير مختلف التلاعب (على سبيل المثال تنشيط جهاز المناعة) على هذه الخلايا المحددة.

وعلى الرغم من عدم الحصانة للقضاء على الورم الرئيسي النامية، الأدلة في مرضى السرطان والنماذج الحيوانية تشير إلى أن نظام المناعة يمكن التحكم تعميم الخلايا السرطانية، micrometastases، والمرض المتبقية throuغ مناعة خلوية (CMI). ومع ذلك، هناك عدم تناسق واضح بين هذه القدرات في الجسم الحي والدراسات المختبرية في البشر والحيوانات، والتي تثبت أن معظم الخلايا السرطانية ذاتي مقاومة لسمية الخلايا من خلال تعميم أو الكريات البيضاء الطحال 1،2. قد يعزى هذا التناقض، جزئيا على الأقل، إلى وجود في الجسم الحي من جزء من السكان الكريات البيض متميزة، وهي (الجيوب) الكريات البيض-marginating الكبد وحيوانية من خلايا NK تفعيلها، وهي خلايا حفرة 3. في الواقع، تشير بيانات غير منشورة من مختبرنا أنه في الفئران F344 كانت هي lysed الخلايا السرطانية مسانج (MADB106)، التي وجدت مقاومة للتعميم والطحال الكريات البيضاء، خلايا MH-NK 4. وهكذا، الخلايا السرطانية التي هي "مقاومة NK" بزعم الكريات البيض تعميم يمكن التحكم بها عن خلايا MH-NK. الجدير بالذكر، في الفئران النشاط المعزز للMH-NK هو واضح التالية فقط في الجسم الحي المناعةالتحفيز (على سبيل المثال من خلال استخدام بولي الأول: C أو الدليل السياسي الشامل-C) 5.

تقع الخلايا القاتلة الطبيعية الكبد معين (MH-NK) داخل التجويف الجيبية، والتمسك الخلايا البطانية وخلايا كوبفر. وتتميز الخلايا MH-NK حصرا حبيبات كثيفة كروية والحويصلات محفور قضيب 6، والتي تحتوي على حمض الفوسفاتيز كما الانزيمات الليزوزومية، وبيرفورين وgranzymes كما المواد النشطة بيولوجيا 7،8. مقارنة مع تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية، والخلايا MH-NK يحمل عددا أكبر وحجم الحبيبات والحويصلات 9-11. في ظل ظروف التهابات، وعرضت خلايا MH-NK لعرض تعبير أعلى من LFA-1 12، بالمقارنة مع تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية. قد يشكل هذا التعبير تعزيز الآلية التي الخلايا MH-NK هي أكثر السامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية بعض من تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية 13،14. nterestingly بعد في المختبر الحضانة مع انترلوكين (ايل) -2، وخلايا MH-NK تصبح الموسع، وعدد وحجم حبيبات زيادة، والتي تنسجم مع الموالية فاي لو القاتل تنشيط مفوكين (LAK) خلايا (15).

الكريات البيض MH النشطة لا يمكن الحصول عليها إلا عن طريق أساليب حصاد الكريات البيض الكبد القياسية، والتي تقوم على طحن وتدهور البيولوجي في الأنسجة. نهج نضح لدينا الموصوفة هنا اثنين من المزايا الرئيسية مقارنة بالاساليب التقليدية. أولا، النهج نضح يحصد انتقائي الكريات البيض MH، ومنع التلوث الكريات البيض أخرى من المقصورات الكبد الأخرى. ثانيا، تقنية نضح أفضل تحافظ على سلامة والنشاط، والوسط الفسيولوجية من الكريات البيض MH، على عكس النهج معالجة الأنسجة التي تتلف الخلايا أو يغير التشكل، ويرجع ذلك إلى تلف الأنسجة، تحفز إطلاق سراح من العوامل المختلفة التي تعدل بشكل ملحوظ في مأمن نشاط.

الكبد هو العضو المستهدف الرئيسي لسرطان خبيث لالثانية لمختلف العدوى 16. كخلايا MH يحمل خصائص فريدة من المهم دراسة هذه سكانية محددة في ظل ظروف مختلفة فيما يتعلق بهذه الأمراض. على سبيل المثال، فإنه تجدر الإشارة إلى أن تنشيط جهاز المناعة النظامية من قبل مختلف BRMS (مثل بولي الأول: C أو الدليل السياسي الشامل-C) وقد ثبت أن تفعيل MH-الكريات البيض أكثر من تعميم الكريات البيض 5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أخلاقيات الإعلان: إجراءات التي تجرى على الحيوانات تم اعتمادها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) في جامعة تل أبيب.

بروتوكول 1. الجرذان

  1. الاستعدادات
    1. إعداد heparinized حل برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) لاستخدامها في درجة حرارة الغرفة (RT) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين خالية من المواد الحافظة لكل مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 1X الحل. حساب 35 مل لكل حيوان.
    2. تمرير heparinized برنامج تلفزيوني من خلال خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة للقضاء على فقاعات الهواء.
    3. تعقيم الأدوات الجراحية - 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، 2 المرقأة، وملقط الأسنان الأنسجة (الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على) إعداد الجاف الجاذبية ().
  2. نضح من الكبد وجمع MH-الكريات البيض
    1. الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. كإجراء احترازي، ووضع أنبوب 50 مل تحتوي على الأيزوفلورينلوحة -soaked حول الرأس الفئران حتى فتح تجويف صدره.
    2. فتح تجاويف البريتوني والصدر لفضح الكبد والقلب والرئة مجمع فور وقف التنفس. تجنب النزيف من خلال هذه العملية.
      1. على وجه التحديد، بدء شق في الجزء الأسفل من نقطة خط الوسط في البطن، دون الأعضاء الداخلية المدمرة، والتقدم لكلا الجانبين بشكل مائل نحو الأضلاع، وقطع من خلالهم إلى مستويات تجويف الصدر العلوية.
    3. ضمن ما يقرب من دقيقة، وجمع أكبر قدر من الدم ممكن (~ 6 مل من 250 غرام الحيواني) من البطين الأيمن إلى حقنة.
    4. المشبك الوريد الأجوف الذيلية مع مرقئ أقرب وقت ممكن إلى القلب، لتمكين جمع سائل الإرواء.
    5. سحب الأمعاء ومكان خارج الحيوان إلى اليمين المجرب، ولفضح الوريد البابي.
    6. ادخال قسطرة 25 G الرابع، متصلة مضخة تحوي، في الوريد البابي، والذيلية وقت ممكن،لكن منقاري إلى الوريد الطحال.
    7. إدراج 25 G فراشة إبرة، متصلة حقنة 5 مل، إلى الوريد الأجوف السفلي، الذيلية إلى مرقئ.
    8. بدوره على مضخة تحوي بسرعة حوالي 3 مل / دقيقة، وجمع بلطف مل الأولى من الإرواء التي تلوثت الدم إلى المحقنة. تستمر حتى اللون سائل الإرواء هو يتحول شاحب اللون الأحمر (حوالي 3-5 مل). لاحظ أن لون الكبد يتغير نحو البني الفاتح.
    9. دون توقف المضخة تحوي استبدال حصاد حقنة 5 مل مع حقنة 20 مل الحصاد وجمع ما لا يقل عن 20 مل من سائل الإرواء الكبد يعمل بسرعة أعلى من نضح (تصل إلى 4 مل / دقيقة). تراقب باستمرار تدفق سائل الإرواء في حقنة جمع، وتجنب الفراغ الذي هو قوي جدا (التي قد تسد الإبرة من خلال انهيار جدران الوريد الأجوف).
    10. إنهاء نضح عندما يتحول لون الكبد إلى البني الفاتح.
  3. الكريات البيض استخراج أجهزة الطرد المركزي سائل الإرواء لمدة 10 دقيقة في 400 x ج، 24 ° C.
  4. نضح طاف
  5. إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف. استنادا إلى أهداف الدراسة، استخدم إعداد كما هو، أو إجراء التنقيات إضافية (على سبيل المثال، الكثافة التدرج الفصل).
    1. على وجه التحديد، طبقة 4 مل من سائل الإرواء أكثر من 4 مل من كتلة فصل كثافة التدرج في 50 سم أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي. تدور الأنابيب في 754 x ج، RT، لمدة 30 دقيقة مع نهاية الشوط الاول من المباراة.
    2. الحصول على طبقات وحيدات النوى في واجهة كثافة التدرج-فصل طاف قبل pipetting اليدوي، ويغسل في برنامج تلفزيوني، وإدراجها في أنبوب 5 مل.

2. بروتوكول ماوس

  1. الاستعدادات
    1. يعد حل heparinized برنامج تلفزيوني (30 وحدة / مل) لاستخدامها في درجة حرارة الغرفة (RT) وذلك بإضافة 30 وحدة من الهيبارين خالية من المواد الحافظة لكل مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 1X محلولن. حساب 20 مل لكل حيوان.
    2. تمرير heparinized برنامج تلفزيوني من خلال خطوط مضخة تحوي والإبر فراشة للقضاء على فقاعات الهواء.
    3. تعقيم الأدوات الجراحية - 2 أزواج من مقص، ملقط اضعافها ذو حدين، 2 المرقأة، وملقط الأسنان الأنسجة (الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل على) إعداد الجاف الجاذبية ().
  2. نضح من الكبد وجمع MH-الكريات البيضاء
    1. الموت ببطء الحيوان جرعة زائدة من 8٪ الأيزوفلورين. كإجراء احترازي، ووضع أنبوب 15 مل تحتوي على وسادة غارقة الأيزوفلورين حول الرأس الماوس حتى فتح تجويف صدره.
    2. إصلاح أطرافه من الماوس لسرير.
    3. فتح تجاويف البريتوني والصدر لفضح الكبد والقلب والرئة مجمع فور وقف التنفس، والحفاظ على الجانب السفلي من الحجاب الحاجز سليمة (لإنشاء تجمع تجويف الصدر يستنزف). تجنب النزيف من خلال هذه العملية.
      1. على وجه التحديد، بدء شق في أسفلنقطة البطن خط الوسط، دون الأعضاء الداخلية المدمرة، والتقدم لكلا الجانبين بشكل مائل نحو الأضلاع، وقطع من خلالهم إلى مستويات تجويف الصدر العلوية.
    4. انسحاب الأمعاء ومكان خارج الحيوان إلى اليمين المجرب، ولفضح الوريد البابي.
    5. ادخال ابرة 30 غراما، متصلة مضخة تحوي في منقاري الوريد البابي إلى الوريد الطحال.
    6. قطع الوريد الأجوف السفلي فوق الحجاب الحاجز للسماح الصرف الصحي وجمع سائل الإرواء من تجويف الصدر.
    7. بدوره على مضخة تحوي بسرعة حوالي 3 مل / دقيقة، وجمع بلطف أول 3 مل من سائل الإرواء أن تكون ملوثة بالدماء من تجمع تجويف الصدر.
    8. تجاهل هذا الإرواء. تكرار مثل هذا الغسيل مرة أخرى إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام المياه المالحة، وبعد ذلك فقط البدء في جمع سائل الإرواء الكبد.
    9. إعادة بدء نضح بسرعة تصل إلى 4 مل / دقيقة، وجمع 10 مل من سائل الإرواء من تجويف الصدر باستخدامفراشة متصلة حقنة.
    10. إنهاء نضح عندما يتحول لون الكبد إلى البني الفاتح.
  3. الكريات البيض استخراج
    1. أجهزة الطرد المركزي في الإرواء لمدة 10 دقيقة على 400 ز س.
    2. نضح طاف.
    3. إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني، الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة، ونضح طاف بناء على أهداف الدراسة، استخدم إعداد كما هو، أو إجراء التنقيات إضافية (على سبيل المثال، الكثافة التدرج الفصل).
      1. على وجه التحديد، طبقة كل 4 مل من سائل الإرواء أكثر من 4 مل من كتلة فصل كثافة التدرج في 50 سم أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي. تدور الأنابيب في 754 x ج، RT، لمدة 30 دقيقة مع نهاية الشوط الاول من المباراة.
      2. الحصول على طبقات وحيدات النوى في واجهة كثافة التدرج-فصل طاف قبل pipetting اليدوي، ويغسل في برنامج تلفزيوني، وإدراجها في أنبوب 5 مل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في الفئران F344 قارنا السمية الخلوية للخلايا MH-NK (التي تم جمعها من الجيوب الكبد عن طريق نضح الكبد القسري) لسمية الخلايا من السكان خلية الكبد كامل بعد طحن الميكانيكية للأنسجة الكبد، وإلى سمية الخلايا تعميم الكريات البيض. تم غسلها كافة الاستعدادات الخلية على الأقل 3 مرات، وروتين في المقايسات المناعية، وكخطوط الخلية المستهدفة استخدمنا الصنعية YAC-1 أو خطوط الخلايا MADB106 الهدف مسانج. كما هو مبين في الأرقام 1-4، في حين خلايا MH-NK أظهرت سمية الخلايا العميقة ضد MADB106 وخطوط الخلايا YAC-1 هدف (~ 80٪ وتصل إلى 100٪ على التوالي)، فإن كلا من إجمالي عدد السكان خلايا الكبد (الشكل 1) و تعميم الكريات البيض (الشكلان 2 و 3) عرض مستويات أقل عميقا للخلايا، ويكاد لا يوجد القتل ضد خط الخلية MADB106 الهدف مسانج. نفس relatiلقد كانت مستويات أقل للخلايا واضحة عندما خضع كبد معالجتها آليا أيضا غسل وكثافة الفصل الانحدار (الشكل 4)، ومستويات التي هي نموذجية في الأدب. وهكذا، وخلايا MH-NK يحمل مستويات عالية فريد للخلايا في الفئران F344. أجري تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية وعن خلافات عميقة في تكوين القطعان خلية التالية: حيدات (CD161dim)، الخلايا القاتلة الطبيعية (CD161 مشرق)، خلايا تي (CD3)، الخلايا البائية (CD45)، وNKT (CD161 وCD3) الخلايا. وكانت خلافات كبيرة في التشكيل النضج (CD11b / CD27) واضحة بين المقصورات مختلفة أيضا (الشكل 5).

شكل 1
الشكل 1: مقارنة بين السمسة الخلايا MH-NK، لالسمسة من سكان الكبد الخلية بأكملها (YAC-1 الهدف الخط الخلية) خلايا MH-NK (حصادها من MH-مقصورة throu.GH النهج الموصوفة هنا) عرضت النشاط السامة للخلايا عميقة ضد خط الخلية المستهدفة YAC-1، في حين أن إجمالي عدد السكان خلية الكبد، تحصد من خلال معالجة ميكانيكية للكبد، عرض مستويات الحد الأدنى (ف <0.05). يمثل المحور العاشر خلايا نسبة المستجيب إلى الهدف. وتقدم البيانات كما يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مقارنة بين السمسة الخلايا MH-NK، لالسمسة من تعميم الكريات البيضاء (YAC-1 الهدف الخط الخلية). خلايا MH-NK (حصادها من MH-المقصورة من خلال نهج الموصوفة هنا) أظهرت سمية الخلايا العميقة ضد خط الخلية المستهدفة YAC-1، في حين عرض الكريات البيض تعميم مستويات الحد الأدنى للخلايا(ف <0.05). يمثل المحور العاشر خلايا نسبة المستجيب إلى الهدف. وتقدم البيانات كما يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: مقارنة بين السمسة الخلايا MH-NK، لالسمسة من تعميم الكريات البيضاء (MADB106 الهدف الخط الخلية) خلايا MH-NK (حصادها من MH-المقصورة من خلال نهج الموصوفة هنا) عرضت سمية الخلايا العميقة ضد MADB106 مسانج استهداف خط الخلية، في حين عرض الكريات البيض تعميم مستويات الحد الأدنى للخلايا (ع <0.05). يمثل المحور العاشر خلايا نسبة المستجيب إلى الهدف. وتقدم البيانات كما يعني ± SEM. الرجاء انقر هنا رس عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: مقارنة بين السمسة الخلايا MH-NK، لالسمسة من كامل الكبد الخلايا اللمفاوية التي تم غسلها والمخصب خلال فصل الكثافة التدرج (YAC-1 هدف خط خلية) خلايا MH-NK (حصادها من MH-. المقصورة من خلال نهج الموصوفة هنا) أظهرت سمية الخلايا العميقة ضد خط الخلية المستهدفة YAC-1، في حين أن الخلايا الليمفاوية الكبد بالكامل (بعد المعالجة الميكانيكية، والتي كان غسلها والتخصيب خلال فصل كثافة التدرج)، عرض مستويات أقل بكثير للخلايا (إلى 30٪) (ف <0.05) التي هي نموذجية في الأدب. يمثل المحور العاشر خلايا نسبة المستجيب إلى الهدف. وتقدم البيانات كما يعني ± SEM. الرجاءانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: مقارنة بين مجموعات فرعية خلية وحيدة النواة ومجموعات فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية من تعميم وحيدات النوى، وMH-وحيدات النوى، وبكل خلايا الكبد وحيدات النوى FACS يظهر تحليل اختلافات واضحة في تكوين القطعان خلية التالية: حيدات (CD161dim)، الخلايا القاتلة الطبيعية (CD161 مشرق)، خلايا تي (CD3)، الخلايا البائية (CD45)، وNKT (CD161 وCD3) خلايا فضلا عن الاختلافات في ملف تعريف النضج (CD11b / CD27) بين الأجزاء المختلفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طريقة نضح الكبد المقدمة هنا تمكن حصاد انتقائي وتدرس من السكان فريدة من marginating الكريات البيض الكبد. خلايا الكبد NK، وتسمى أيضا خلايا حفرة 3، تشكل المميز السكان الخلايا القاتلة الطبيعية الموجودة في الجيوب الكبدية. فهي موجودة في الفئران، الفئران 17 وفي البشر 18،19. مقارنة مع الخلايا القاتلة الطبيعية الطرفية المعزولة، أظهرت الخلايا حفرة ارتفاع السمية الخلوية ضد YAC-1 وCC531s خطوط الخلايا الهدف 20، وعرضت أن يكون لها عدد أكبر من حبيبات هيولية أصغر 20، وتعبير أعلى من المستضدات السطحية، مثل LFA-1 12 . بالإضافة إلى ذلك، على عكس الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم معزولة، يمكن خلايا حفرة ليز خلايا P815 المقاومة للNK. مماثلة لخلايا الفئران حفرة، الخلايا القاتلة الطبيعية الكبدية البشرية لديها السمية الخلوية أعلى ضد خلايا K562 الهدف NK حساسة مقارنة تعميم الخلايا القاتلة الطبيعية 18،19، وعرضت لليز الخلايا المستهدفة المقاومة للNK 18. أوفيرالل، كما أن الكبد هو على وجه التحديد فريد تشارك في مختلف الأمراض، ينبغي دراسة الحصانة داخل هذا الجهاز، وينبغي التمييز بين خلايا مقصورة MH من متني، كوبفر، والخلايا النجمية.

كما وضعت في مقدمة نهج نضح لدينا هو مفيد على / إجراءات الميكانيكية المشتركة طحن البيولوجية تدهور في حصاد انتقائي الكريات البيض MH، وأفضل والحفاظ على سلامة والنشاط، والوسط الفسيولوجية من الكريات البيض MH. في الواقع، وتقييم NK السمية الخلوية، الكريات البيض MH تحصد من خلال نهجنا عرضت على NK السمية الخلوية أعلى بشكل ملحوظ من الكريات البيض التي تحصد من خلال إجراء طحن الميكانيكية، على الرغم من عدد مماثل من الخلايا القاتلة الطبيعية.

تقنية نضح الكبدية هي قابلة للتشغيل فقط في الدراسات الحيوانية. الخلافات ومع ذلك، رؤى محددة تم الحصول عليها من هذا النهج فيما يتعلق ملحوظ بين المقصورات المناعة قد التشكيك في البيولوجيةالقاعدة وأهمية سريرية من الملاحظات التي تستند فقط على تعميم الكريات البيض. الدراسات على الحيوانات التي تقيس المؤشرات المناعية في مقصورات مناعية مختلفة قد تشير إلى الدرجة التي كل مؤشر المناعية في الدورة الدموية يعكس أو يرتبط مستوياته في المقصورة MH. تشير ملاحظة مثيرة للاهتمام لتوظيف هذه التقنية في الفئران، حيث الخلايا MH-NK perfused سوف تظهر فقط النشاط السامة للخلايا كبير ضد الخلايا المستهدفة بعد التحفيز المناعي للحيوان 21 بداهة.

ويجب توضيح بعض الجوانب الهامة من هذه التقنية. في كل من الفئران والجرذان، يجب فتح تجويف الصدر على نطاق واسع مباشرة بعد التوقف التام للتنفس، ومع الحد الأدنى من النزيف. في الفئران، فمن المستحسن أن كمية ممكنة من الدم في القلب يتم سحب قبل التروية. في الفئران، فإنه ليس من المستحسن أن الدم المسحوب من القلب، كما أنه يقلل من ضغط الدم في الوريد البابي ويجعل من الصعب ادخال الإبرة من خلال ذلك لمواصلة العملية. وينبغي بذل هذا الإدراج إبرة المجاور ولكن منقاري إلى الوريد الطحال، كما كان أحد يرغب في التأكد من أن المسافة من الإدراج إلى مدخل الوريد البابي في الكبد كافية للإبرة ليكون في وضع مستقر ويتيح لجميع فصوص للحصول على perfused. ينبغي إدخال الإبرة في الوريد البابي بينما يتم تصغير مواز لسطحها، وذلك من مخاطر تمزق جدار الوعاء الدموي. في الفئران، في حين إدخال إبرة إلى الوريد الأجوف الذيلية لجمع سائل الإرواء، فمن المهم للحفاظ على نقطة مدخل ضيقة قدر الإمكان لتجنب تسرب محتمل من الإرواء. في الفئران، من المهم أن precociously قطع الوريد الأجوف داخل تجويف الصدر دون تمزيق الأوعية الدموية الأخرى أو الرئتين، وذلك لتجنب تلوث الدم لا لزوم له. والميزة الرئيسية لاستخدام مضخة تحوي هو استقرار السيطرة على معدل نضح داخل وبينالحيوانات. فمن المهم للحفاظ على معدل تدفق منخفض خلال الإجراء بأكمله من أجل تجنب تمزق الوريد البابي. كما وتلوث ملليلتر الأولى من الإرواء الكبد مع الدم، وينبغي التخلص منها كما هو مبين. لتحقيق التوحيد بين الحيوانات، ويستند إلى المعايير اللازمة لبدء جمع سائل الإرواء MH على تحول لون من البني الداكن إلى البني الفاتح (وليس مجموعة من حجم معين).

جنبا إلى جنب على هذه الممارسة، قد تحدث عدة الأعطال، ولكن معظمها عكسها. إذا كانت الإبرة التي يتم من خلالها المنقول برنامج تلفزيوني في الكبد ينزلق خارج، فمن المستحسن لوقف ضخ تمعجية، نقع المنطقة المحيطة بها من القناة الهضمية (لتحقيق رؤية أفضل)، وإعادة إدراج الإبرة في موقف أكثر قليلا منقاري، وإعادة بدء تشغيل المضخة.

تقنية نضح الكبد الموصوفة هنا تمكن الحصاد الانتقائي للسكان الكريات البيض MH في عملية بسيطة نسبيا. معطىأن هذه الفئة من السكان يعرض السمات المميزة مقارنة الكريات البيض من المقصورات المناعية الأخرى، ويمكن أن يكون الأهمية البيولوجية والسريرية للكائن الحي، من المستحسن استخدام هذه الطريقة عندما يكون ذلك ممكنا، والكريات البيض من المقصورات الأخرى قد لا يعكس الشخصية من السكان MH. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذا الأسلوب غير قابلة للتنفيذ في البشر، ونحن نقترح أيضا توظيفها في الحيوانات لتوضيح المؤشرات الحيوية تعميم المحددة التي ترتبط مع خصائص MH، وخاصة عند دراسة العمليات والأمراض المتصلة الكبد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle OMG 26 G
Butterfly needle OMG 21 G*3/4"
Syringe Pic solution 1 ml
Syringe Pic solution 2.5 ml
Syringe Pic solution 5 ml
Syringe Pic solution 10 ml
Syringe Pic solution 25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
  2. Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
  3. Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
  4. Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
  5. Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
  6. Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
  7. Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G. A central role of perforin in cytolysis? Annu Rev Immunol. 9, 129-157 (1991).
  8. Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
  9. Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
  10. Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
  11. Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
  12. Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
  13. Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
  14. Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
  15. Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
  16. Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
  17. Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
  18. Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
  19. Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
  20. Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
  21. Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).

Tags

علم المناعة، العدد 113، الكبد، كريات الدم البيضاء، والخلايا حفرة، الجرذان والفئران، marginating كبدي، القاتلة الطبيعية، والخلايا القاتلة الطبيعية الكبد محددة، الجيوب، الحصانة، الانبثاث السرطان، ونضح
حصاد الانتقائي للMarginating-الكبدية الكريات البيضاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sorski, L., Shaashua, L., Melamed,… More

Sorski, L., Shaashua, L., Melamed, R., Matzner, P., Ben-Eliyahu, S. Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes. J. Vis. Exp. (113), e53918, doi:10.3791/53918 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter