Introduction
De lever sinusoïden bevatten talrijke leukocyt subtypen van verschillende immuun activiteiten kritisch voor het organisme. Zo worden marginating lever (MH) natural killer (NK) cellen, ook bekend als pitcelen kenmerk morfologisch als grote granulaire lymfocyten (LGLs) en functioneel als leukocyten spontane cytotoxische capaciteit dat hepatische weerstand tegen de vestiging van bloed- gedragen tumor uitzaaiingen. Het doel van de werkwijze die hierin wordt selectief oogsten van MH leukocyten, om deze belangrijke en unieke celpopulatie (en immuuncompartiment) bestuderen inschakelen en het effect van verschillende manipulaties (bijv immuunactivatie) de volgende specifieke cellen te helderen.
Ondanks het feit dat immuniteit voor een zich ontwikkelende primaire tumor te elimineren, bewijsmateriaal kankerpatiënten en diermodellen geven aan dat het immuunsysteem regelen circulerende tumorcellen, micrometastasen en residual disease gedugh-cel gemedieerde immuniteit (CMI). Er bestaat echter een duidelijke inconsistentie tussen de in vivo capaciteit en in vitro studies bij mensen en bij dieren die aantonen dat de meeste autologe tumorcellen resistent tegen cytotoxiciteit van circulerende leukocyten of milt 1,2. Deze inconsistentie kan worden toegeschreven, ten minste gedeeltelijk, om de in vivo er een afzonderlijke leukocyten subpopulatie, namelijk de marginating-lever (sinusoïden) leukocyten en de subpopulatie van geactiveerde NK-cellen, namelijk pitcelen 3. Inderdaad, ongepubliceerde gegevens uit ons laboratorium aangetoond dat in F344 ratten syngene tumorcellen (MADB106), die bestand zijn tegen circulerende leukocyten en milt werden gevonden, werden gelyseerd door MH-NK-cellen 4. Aldus kunnen tumorcellen die zogenaamd "NK-resistent" circulerende leukocyten worden gecontroleerd door MH-NK-cellen. Opmerkelijk, in muizen de verhoogde activiteit van de MH-NK is duidelijk alleen na in vivo immuunstimulatie (bijvoorbeeld door gebruikmaking van Poly I: C of CpG-C) 5.
Lever-specifieke NK-cellen (MH-NK) bevinden zich binnen de sinusvormige lumen, die vastzit aan de endotheelcellen en Kupffer cellen. MH-NK-cellen uitsluitend gekenmerkt door dichte bolvormige korrels en-rod uitgeboord vesicles 6, waarbij zuurfosfatase als lysosomale enzymen en perforine en granzymen bevatten bioactieve stoffen 7,8. Vergeleken met circulerende NK-cellen, NK-MH-cellen vertonen een grotere en kleinere granules en blaasjes 9-11. Onder ontstekingsaandoeningen werden MH-NK-cellen aangetoond hogere expressie vertonen van LFA-1 12 ten opzichte van circulerende NK cellen. Deze verhoogde expressie kan een mechanisme waardoor MH-NK-cellen zijn cytotoxischer tegen sommige tumorcellen dan circulerende NK cellen 13,14 vormen. nterestingly, na in vitro incubatie met interleukine (IL) -2, MH-NK-cellen worden vergroot, enhet aantal en de grootte van de korrels te vergroten, die stroken met een fi le of lymfokine geactiveerde killercellen (LAK) cellen 15.
Actieve MH leukocyten kan niet alleen worden verkregen door standaard lever leukocyten oogstmethodes, die gebaseerd zijn op het slijpen en biologische afbraak van het weefsel. Onze aanpak perfusie hierin beschreven heeft twee belangrijke voordelen ten opzichte van de standaard methoden. Ten eerste, de perfusie benadering oogst MH selectief leukocyten voorkomen van besmetting door andere leukocyten uit andere lever compartimenten. Ten tweede, de perfusie techniek beter behoudt de integriteit, de activiteit en de fysiologische milieu van MH leukocyten, anders dan het weefsel verwerking benaderingen die cellen beschadigen of hun morfologie te veranderen en door weefselbeschadiging, het induceren van de afgifte van verschillende factoren die duidelijk moduleren immuunsysteem activiteit.
De lever is een belangrijk doelwit orgaan voor kanker metastase eennd voor verschillende infecties 16. Zoals MH cellen unieke kenmerken is het belangrijk om deze specifieke populatie onder verschillende omstandigheden te bestuderen met betrekking tot deze pathologieën. Zo is het waard op te merken dat systemische activering van het immuunsysteem door verschillende BRM (bijvoorbeeld poly I: C of CpG-C) bleken te activeren MH-leukocyten meer dan 5 circulerende leukocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) goedgekeurd bij Tel Aviv University.
1. Ratten Protocol
- voorbereidingen
- Bereid gehepariniseerde oplossing PBS (30 eenheden / ml) bij kamertemperatuur (KT) te gebruiken door toevoeging van 30 eenheden conserveermiddel heparine per ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x oplossing. Bereken 35 ml per dier.
- Pass gehepariniseerde PBS door de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te verwijderen.
- Steriliseren chirurgische instrumenten - 2 scharen, forceps afgestompte randen, 2 hemostats en tand-weefsel tang (autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling).
- Perfusie van de lever en de collectie van MH-leukocyten
- Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Uit voorzorg, plaats een 50 ml buis met een isofluraan-soaked pad rond de rat hoofd tot het openen van de borstholte.
- Open de peritoneale en borstholte naar de lever en het hart-complex onmiddellijk bloot te leggen na het stoppen van de ademhaling. Vermijd bloeden door dit proces.
- In het bijzonder, beginnen de incisie in de onderbuik middellijn punt, zonder deze te beschadigen interne organen, en de vooruitgang naar beide zijden schuin in de richting van de ribben, snijden via hen borst holte levels.
- Binnen ongeveer een minuut, verzamel zoveel mogelijk bloed (~ 6 ml van een 250 g dier) vanaf het rechter ventrikel in een injectiespuit.
- Klem de caudale vena cava met een hemostaat zo dicht mogelijk bij het hart, aan de collectie van het perfusaat mogelijk te maken.
- Trek de darmen en buiten het dier het recht van de experimentator, om de poortader bloot te leggen.
- Plaats een 25 G IV katheter, verbonden met een peristaltische pomp, in de poortader, zo staartvin mogelijk,maar rostraal van de milt ader.
- Plaats een 25 G vlindernaald, verbonden met een 5 ml spuit, in de inferior vena cava, caudaal van de hemostaat.
- Schakel de peristaltische pomp met een snelheid van ongeveer 3 ml / min en voorzichtig laat de eerste ml perfusievloeistof die zijn verontreinigd met bloed in de injectiespuit. Ga door tot het perfusaat kleur bochten bleke rode (ongeveer 5/3 ml). Merk op dat de kleur van de lever veranderen en ze lichtbruin.
- Zonder stoppen van de peristaltische pomp, vervangt de 5 ml oogsten spuit met een 20 ml spuit oogsten en laat minstens 20 ml lever perfusaat gebruik van een hogere snelheid van perfusie (tot 4 ml / min). Permanent toezicht op het perfusaat stroom in het verzamelen spuit, en vacuüm dat is te sterk (die de naald kunnen verstoppen door middel van het instorten van de vena cava muren) te vermijden.
- Perfusie beëindigen wanneer de kleur van de lever wordt lichtbruin.
- leukocyten Extraction
- Zuig het supernatant
- Voeg 10 ml PBS, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de supernatant. Op basis van de studie doelen gebruiken voorbereiding zoals is, of extra zuiveringen (bv dichtheid-gradiënt scheiding) uit te voeren.
- In het bijzonder laag 4 ml perfusaat meer dan 4 ml van de dichtheid-gradiënt scheiding massa in een 50 cc polypropyleen centrifugebuis. Spin de buizen bij 754 xg, kamertemperatuur, gedurende 30 minuten met afbreken.
- Het verkrijgen van de mononucleaire lagen aan de dichtheid-gradiënt scheiding-supernatant interface van door handmatige pipetteren, wassen in PBS, en invoegen in een 5 ml buis.
2. Mouse Protocol
- voorbereidingen
- Bereid gehepariniseerde oplossing PBS (30 eenheden / ml) voor gebruik op kamertemperatuur (KT) door toevoeging van 30 eenheden conserveermiddel heparine per ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x solution. Bereken 20 ml per dier.
- Pass gehepariniseerde PBS door de peristaltische pomp lijnen en de vlinder naalden om luchtbellen te verwijderen.
- Steriliseren chirurgische instrumenten - 2 scharen, forceps afgestompte randen, 2 hemostats en tand-weefsel tang (autoclaaf bij 121 ° C gedurende ten minste 30 min de zwaartekracht (droog) instelling).
- Perfusie van de lever en de collectie van MH-leukocyten
- Euthanaseren het dier door een overdosis van 8% isofluraan. Uit voorzorg, plaats een 15 ml buis met daarin een-isofluraan gedrenkte pad rond de muis hoofd tot het openen van de borstholte.
- Bevestig de ledematen van de muis om een bed.
- Open de peritoneale en borstholte naar de lever en het hart-complex onmiddellijk na het stoppen van de ademhaling bloot te leggen, waardoor de lagere aspect van het membraan intact (het creëren van een drainerende borstholte zwembad). Vermijd bloeden door dit proces.
- Specifiek start de snede in de ondersteabdominale middellijn point, zonder deze te beschadigen interne organen, en de vooruitgang naar beide zijden schuin in de richting van de ribben, snijden via hen borst holte levels.
- Pullout de darmen en buiten het dier het recht van de experimentator, om de poortader bloot te leggen.
- Plaats een 30 g naald, verbonden met een peristaltische pomp in de poortader rostraal van de milt ader.
- Snijd de onderste vena cava boven het membraan afvoer en verzameling van het perfusaat uit de borstholte mogelijk.
- Schakel de peristaltische pomp met een snelheid van ongeveer 3 ml / min en voorzichtig laat de eerste 3 ml perfusievloeistof die zijn verontreinigd met bloed uit de borstholte zwembad.
- Gooi dit perfusaat. Herhaal dergelijke wassen opnieuw als nodig, met zoutoplossing en daarna pas het verzamelen van perfusaat lever.
- Begint opnieuw perfusie aan een snelheid van 4 ml / min en 10 ml verzamelen van perfusaat uit de borstholte viaeen vlinder verbonden met een injectiespuit.
- Perfusie beëindigen wanneer de kleur van de lever wordt lichtbruin.
- leukocyten Extraction
- Centrifugeer het perfusaat gedurende 10 min bij 400 x g.
- Zuig het supernatant.
- Voeg 10 ml PBS, centrifugeer bij 400 xg gedurende 10 min, en zuig de supernatant basis studiedoelen Gebruik preparaat zoals is, of extra reinigingen (bijvoorbeeld dichtheidsgradiënt scheiding) voeren.
- In het bijzonder laag om de 4 ml perfusaat meer dan 4 ml van de dichtheid-gradiënt scheiding massa in een 50 cc polypropyleen centrifugebuis. Spin de buizen bij 754 xg, kamertemperatuur, gedurende 30 minuten met afbreken.
- Het verkrijgen van de mononucleaire lagen aan de dichtheid-gradiënt scheiding-supernatant interface van door handmatige pipetteren, wassen in PBS, en invoegen in een 5 ml buis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In F344 ratten vergeleken we de cytotoxiciteit van MH-NK-cellen (vanuit de lever sinusoïden geforceerde leverperfusie) om cytotoxiciteit van de gehele lever celpopulatie na mechanisch malen van het leverweefsel, en de cytotoxiciteit van circulerende leukocyten. Alle celpreparaten werden ten minste 3 maal gewassen, zoals routine immunologische tests, en als doelwit cellijnen gebruikten we de allogene YAC-1 of syngene MADB106 doelwitcellijnen. Zoals aangegeven in figuren 1-4, terwijl MH-NK-cellen vertoonden ernstige cytotoxiciteit tegen MADB106 en YAC-1 doelwitcellijnen (~ 80% en tot 100%), die van de gehele lever celpopulatie (figuur 1) en circulerende leukocyten (figuren 2 en 3) weergegeven grondig lagere cytotoxiciteit en bijna geen doding tegen syngene MADB106 doelcellijn. Dezelfde relative lagere cytotoxiciteit was duidelijk toen machinaal bewerkt lever onderging wassen en dichtheid gradiënt scheiding (figuur 4), niveaus die typisch in de literatuur. Zo MH-NK-cellen vertonen een unieke hoge niveaus van cytotoxiciteit in F344 ratten. FACS analyse werd uitgevoerd en onthulde grote verschillen in de samenstelling van volgende celtypes: monocyten (CD161dim), NK cellen (CD161 helder), T-cellen (CD3), B-cellen (CD45) en NKT (CD161 en CD3) cellen. Grote verschillen in rijping profiel (CD11b / CD27) waren ook duidelijk tussen de verschillende compartimenten (Figuur 5).
Figuur 1: Een vergelijking van de cytotoxiciteit van NK MH-cellen, cytotoxiciteit van de gehele lever celpopulatie (YAC-1 doelcellijn) MH-NK-cellen (geoogst uit de MH-compartiment gedu.gh de hierin beschreven benadering) vertoonde ernstige cytotoxische activiteit tegen de YAC-1 doelwitcellijn, terwijl de gehele lever celpopulatie verzameld door mechanische bewerking van de lever, weergegeven minimale niveaus (p <0,05). X as effector-tot-doelcellen ratio. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Een vergelijking van de cytotoxiciteit van NK MH-cellen, cytotoxiciteit van circulerende leukocyten (YAC-1 doelcellijn). MH-NK-cellen (geoogst van de MH-compartiment door middel van de hierin beschreven benadering) vertoonde diepe cytotoxiciteit tegen de YAC-1 doel cellijn, terwijl circulerende leukocyten weergegeven minimale niveaus van cytotoxiciteit(P <0,05). X as effector-tot-doelcellen ratio. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. Een vergelijking van de cytotoxiciteit van MH-NK-cellen, cytotoxiciteit van circulerende leukocyten (MADB106 doelcellijn) MH-NK-cellen (geoogst uit de MH-compartiment door de hierin beschreven benadering) vertoonde diepe cytotoxiciteit tegen syngene MADB106 doelwitcellijn, terwijl circulerende leukocyten weergegeven minimale cytotoxiciteit (p <0,05). X as effector-tot-doelcellen ratio. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Klik hier to bekijk een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Een vergelijking van de cytotoxiciteit van NK MH-cellen, cytotoxiciteit van de gehele lever Lymfocyten die werd gewassen en verrijkt door dichtheidsgradiënt scheiding (YAC-1 doelcellijn) MH-NK-cellen (geoogst van de MH-. compartiment door middel van de hierin beschreven benadering) vertoonde diepe cytotoxiciteit tegen de YAC-1 doel cellijn, terwijl de gehele lever lymfocyten (na mechanische bewerking, dat werd gewassen en verrijkt door de dichtheid gradiënt scheiding), weergegeven aanzienlijk lagere niveaus van cytotoxiciteit (maximaal 30%) (p <0,05) die typisch in de literatuur. X as effector-tot-doelcellen ratio. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Zoomklik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Een vergelijking van mononucleaire cel subsets en NK cel subsets van de circulerende mononucleaire, de MH-Mononucleaire en de gehele lever mononucleaire cellen FACS-analyse vertoonde duidelijke verschillen in de samenstelling van volgende celtypes: monocyten (CD161dim), NK-cellen (CD161 helder), T-cellen (CD3), B-cellen (CD45), en NKT (CD161 en CD3-cellen), evenals verschillen in de rijping profiel (CD11b / CD27) tussen verschillende compartimenten. klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De lever perfusie methode die hierin maakt een selectief oogsten en het bestuderen van de unieke populatie van marginating lever leukocyten. Lever- NK-cellen, ook wel pit cellen 3, vormen een onderscheidende NK cel populatie die in de lever sinusoïden wonen. Ze zijn te vinden in ratten, muizen 17 en bij de mens 18,19. Vergeleken met geïsoleerde perifere NK cellen pitcelen aangetoond hogere cytotoxiciteit tegen YAC-1 en CC531s doelwitcellijnen 20, werden naar een groter aantal kleinere cytoplasmatische korrels 20 en een hogere expressie van oppervlakte-antigenen, zoals LFA-1 12 hebben . Bovendien, in tegenstelling tot geïsoleerde bloed NK-cellen, kan pit lyseren NK-resistente P815 cellen. Soortgelijke rat pit cellen, humane lever NK cellen een hogere cytotoxiciteit tegen NK gevoelige K562 doelcellen vergeleken met circulerende NK cellen 18,19, en werden naar lyse NK-resistente doelcellen 18. Overall, de lever specifiek en uniek betrokken bij diverse ziekten, immuniteit worden bestudeerd in dit orgaan en cellen van het MH compartiment moet worden onderscheiden van parenchymcellen, Kupffer en stellaatcellen.
Zoals uitgewerkt in de inleiding, onze perfusie aanpak is voordelig ten opzichte van de gemeenschappelijke mechanisch malen / biologische afbraak procedures in selectief oogsten MH leukocyten, en beter behoud van de integriteit, de activiteit, en de fysiologische milieu van MH leukocyten. Sterker nog, het beoordelen van NK cytotoxiciteit, MH leukocyten geoogst door middel van onze aanpak vertoonde een duidelijk hoger NK cytotoxiciteit dan leukocyten geoogst door het mechanisch malen procedure, ondanks vergelijkbare aantal NK-cellen.
De lever perfusie techniek werkt alleen bij dierproeven. Echter, specifieke inzichten verkregen uit deze aanpak met betrekking tot duidelijke verschillen tussen het immuunsysteem compartimenten kan de biologische vraagal en klinische betekenis van waarnemingen uitsluitend op basis van circulerende leukocyten. Dierstudies die immune indices in verschillende immunologische compartimenten meten kan de mate waarin elke immunologische index in het verkeer brengen of correleert met de niveaus in het compartiment MH suggereren. Een interessante waarneming betreft het gebruik van deze techniek bij muizen, waarbij de perfusie MH-NK-cellen enige significante cytotoxische activiteit tegen doelwitcellen zal blijken na een a-priori immuunstimulatie van het dier 21.
Er zijn maar weinig kritische aspecten van de techniek moet worden vermeld. Bij zowel ratten als muizen, moet de borstholte wijd meteen geopend na volledige stopzetting van de ademhaling, en met minimale bloeden. Bij ratten, is het raadzaam dat de maximale hoeveelheid van cardiale bloed, voordat de perfusie wordt ingetrokken. Bij muizen wordt afgeraden onttrokken bloed van het hart, zoals de bloeddruk in de poortader en vermindertmaakt het moeilijker om de naald steken er doorheen om het proces voort te zetten. Deze naald inbrengen moeten naast maar rostraal van de milt ader worden, aangezien men wil dat de afstand van de insertie aan de ingang van de poortader in de lever is voldoende voor de naald in een stabiele positie en laat de lobben te krijgen doorbloed. De naald moet worden ingebracht in de poortader, terwijl parallel aan het oppervlak, waardoor de kans op scheuren van de vaatwand wordt geminimaliseerd. In ratten, terwijl een naald aan het caudale vena cava voor het verzamelen van het perfusaat, is het cruciaal om het ingangspunt handhaven smal mogelijk een eventuele lekkage van perfusaat te vermijden. Bij muizen is het belangrijk precociously stuurde de vena cava in de borstholte zonder scheuren andere bloedvaten of longen, om onnodige bloed voorkomen. Het grote voordeel van het gebruik van een peristaltische pomp is een stabiele regeling via perfusiesnelheid, binnen en tussendieren. Het is belangrijk om een lage stroomsnelheid gedurende de gehele procedure te behouden om breuk van de poortader voorkomen. Als de eerste milliliters lever perfusievloeistof met bloed zijn besmet, moeten ze worden weggegooid, zoals getoond. Om standaardisatie tussen dieren te bereiken, is het criterium om te beginnen met het verzamelen van de MH perfusaat op basis van kleur overgang van donker bruin tot lichtbruin (in plaats van inzameling van een specifiek volume).
Langs het uitvoeren van de procedure, kan verschillende storingen optreden, maar de meeste zijn omkeerbaar. Als de naald waardoor de PBS wordt transfusie in de lever glipt uit, is het raadzaam om de peristaltische pomp te stoppen, genieten van de omgeving van de darm (om beter zicht te bereiken), re-steek de naald in een iets meer rostrale positie, en re-start de pomp.
De leverperfusie techniek hierin beschreven kan een selectief oogsten van de MH leukocytpopulatie in een relatief eenvoudig proces. Gegevendat deze populatie toont onderscheidende kenmerken in vergelijking met leukocyten uit andere immune compartimenten, en kunnen biologische en klinische betekenis aan het organisme, raden we het gebruik van deze methode als haalbaar is, zoals leukocyten van andere compartimenten kan het profiel van de MH bevolking niet overeen. Bovendien, aangezien deze techniek niet uitvoerbaar bij mensen suggereren verder we gebruik in dieren specifieke circulerende biomarkers die correleren met de MH kenmerken, met name bij het bestuderen hepatische processen en ziekten verduidelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Benish, M., Melamed, R., Rosenne, E., Neeman, E., Sorski, L., Levi, B., Shaashua, L., Matzner, M., Ben-Eliyahu, S. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunologic Research. 58, 28-39 (2014).
- Wisse, E., van't Noordende, J. M., van der Meulen, J., Daems, W. T. The pit cell: description of a new type of cell occurring in rat liver sinusoids and peripheral blood. Cell Tissue Res. 173, 423-435 (1976).
- Vermijlen, D., et al. Hepatic natural killer cells exclusively kill splenic/blood natural killer-resistant tumor cells by the perforin/granzyme pathway. J Leukoc Biol. 72, 668-676 (2002).
- Gao, B., Radaeva, S., Park, O. Liver natural killer and natural killer T cells: immunobiology and emerging roles in liver diseases. J Leukoc Biol. 86, 513-528 (2009).
- Kaneda, K. Liver-associated large granular lymphocytes: morphological and functional aspects. Arch Histol Cytol. 52, 447-459 (1989).
- Podack, E. R., Hengartner, H., Lichtenheld, M. G.
- Kamada, M. M., et al. Identification of carboxypeptidase and tryptic esterase activities that are complexed to proteoglycans in the secretory granules of human cloned natural killer cells. J Immunol. 142, 609-615 (1989).
- Wisse, E., et al. On the function of pit cells, the liver-specific natural killer cells. Semin Liver Dis. 17, 265-286 (1997).
- Bouwens, L., Remels, L., Baekeland, M., Van Bossuyt, H., Wisse, E. Large granular lymphocytes or "pit cells" from rat liver: isolation, ultrastructural characterization and natural killer activity. Eur J Immunol. 17, 37-42 (1987).
- Vanderkerken, K., et al. Origin and differentiation of hepatic natural killer cells (pit cells). Hepatology. 18, 919-925 (1993).
- Luo, D., et al. The role of adhesion molecules in the recruitment of hepatic natural killer cells (pit cells) in rat liver. Hepatology. 24, 1475-1480 (1996).
- Shresta, S., MacIvor, D. M., Heusel, J. W., Russell, J. H., Ley, T. J. Natural killer and lymphokine-activated killer cells require granzyme B for the rapid induction of apoptosis in susceptible target cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 5679-5683 (1995).
- Luo, D., et al. Involvement of LFA-1 in hepatic NK cell (pit cell)-mediated cytolysis and apoptosis of colon carcinoma cells. J Hepatol. 31, 110-116 (1999).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of mouse liver-associated natural killer activity by biologic response modifiers occurs largely via rapid recruitment of large granular lymphocytes from the bone marrow. J Immunol. 143, 372-378 (1989).
- Schluter, K., et al. Organ-specific metastatic tumor cell adhesion and extravasation of colon carcinoma cells with different metastatic potential. Am J Pathol. 169, 1064-1073 (2006).
- Wiltrout, R. H., et al. Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver. J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).
- Winnock, M., et al. Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis. Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).
- Hata, K., et al. Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver. Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).
- Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids. Hepatology. 12, 70-75 (1990).
- Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).
