Introduction
在肝血窦包含对生物体关键的各种免疫活动，众多的白细胞亚型。例如，marginating肝（MH +）自然杀伤（NK）细胞，也被称为坑的细胞，特征在于形态为大颗粒淋巴细胞（LGLs）和功能作为自发性细胞毒性的能力的白细胞，使肝-抵抗建立血 - 源性肿瘤转移。本文提出的方法的目标是使氢白细胞选择性收割，为了研究这个重要和独特的细胞群体（和免疫隔室），并阐明各种操作对这些特定细胞的影响（ 例如 ，免疫激活）。
尽管免疫的故障消除显影原发性肿瘤，在癌症患者和动物模型的证据表明免疫系统可控制循环肿瘤细胞，微转移，和残留病THROUGH细胞介导的免疫（CMI）。然而， 在体内的功能和在人的体外研究和在动物中，这表明，大多数的自体肿瘤细胞是通过循环或脾白细胞1,2-细胞毒性抗这些之间的明显不一致。此不一致可能归因，至少部分地明显的白细胞亚群，即marginating肝（正弦）白细胞和其活化NK细胞，即坑细胞3的亚群在体内存在。的确，从我们的实验室未发表的数据表明，在F344大鼠的同基因肿瘤细胞（MADB106），其被发现循环和脾白细胞抗性，通过MH-NK细胞4裂解。因此，是所谓的“NK抗性”，以循环白细胞的肿瘤细胞可以通过MH-NK细胞来控制。值得注意的是，在小鼠中只有下列体内免疫MH-NK的增强的活性是明显的刺激（ 例如，通过使用保利我的：C或CpG的-C）5。
肝特异性NK细胞（MH-NK）位于正弦管腔内，附着在血管内皮细胞和枯否氏细胞。 MH-NK细胞是专门特征在于球形致密颗粒和杆芯囊泡6，其含有酸性磷酸酶如溶酶体酶，和穿孔和粒酶作为生物活性物质7,8。与循环NK细胞相比，MH-NK细胞表现出的颗粒和囊泡9-11的较高数目和大小。下炎性病症，被示出的MH-NK细胞表现出的LFA-1 12的更高的表达相比，循环NK细胞。这种增强的表达可能构成了一个机制，MH-NK细胞是针对某些肿瘤细胞比循环NK细胞13,14多种细胞毒性。 nterestingly， 下列体外孵育白细胞介素（IL）-2，MH-NK细胞变大，并它们的数量和颗粒的尺寸增加，所有这些都与一个亲音响淋巴因子激活的杀伤的勒细胞（LAK）15相一致。
活性氢白细胞不能通过的标准肝白细胞采收方法，其基于研磨和组织的生物降解独占获得。相比于标准的方法本文描述的我们的灌注方法有两个主要优点。首先，灌注的方法选择性地收割MH白细胞，防止污染由其他肝病车厢其他白细胞。其次，灌注技术更好保持完整性，活性，和MH白细胞的生理环境，不像组织处理方法损害细胞或改变它们的形态，和由于组织损伤，诱导各种因素的释放是显着调节免疫活动。
肝脏是癌转移所涉及的主要靶器官第二对各种感染16。当MH细胞表现出独特的特点是，研究在各种条件下该特定人群相对于这些疾病是很重要的。例如，它是值得注意的各种生物反应调节剂是全身性免疫激活（ 如聚I：C或CpG的-C）已经显示激活比循环白细胞5 MH-白细胞多。
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Protocol
伦理学声明：涉及动物主题程序已在特拉维夫大学被批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）。
1.大鼠协议
- 准备工作
- 制备肝素的PBS（30单位/ ml）溶液在室温（RT）加入每毫升磷酸盐的不含防腐剂的肝素的30个单位被用来缓冲盐水（PBS）1×溶液。计算每个动物35毫升。
- 通过蠕动泵线和蝴蝶针传递肝素的PBS，以消除气泡。
- 消毒手术工具 - 2对剪刀，钝边镊子，2止血，和牙齿组织镊（高压釜在121℃下对重力（干燥）设定为至少30分钟）。
- MH-白细胞的肝脏和收集灌注
- 8％的异氟醚过量安乐死的动物。作为预防措施，将含有异氟醚50ml管周围的老鼠头-soaked垫，直到其打开胸腔。
- 打开腹腔和胸腔空腔后呼吸停止，立即露出肝脏和心肺复杂。避免通过这个过程出血。
- 具体而言，对角开始在下腹正中一点进步两侧切口，不破坏内脏，向排骨，通过它们切割胸上部腔水平。
- 在大约分钟，收集尽可能多的血越好（〜从250克动物6ml）中自右心室到注射器中。
- 夹紧尾腔静脉尽可能接近到心脏止血钳，使灌流液的收集。
- 拉出肠子和地点动物实验者的权利外，揭露门静脉。
- 插入地下25 IV导管，连接到蠕动泵，进入门静脉，如尾越好，但喙脾静脉。
- 插入地下25蝴蝶针，连接到5毫升注射器，进入下腔静脉，尾椎止血。
- 打开蠕动泵以约3毫升/分钟的速度，并轻轻收集第一毫升被污染的血液到注射器灌注液。继续，直到灌流液颜色变成浅的红色（约3-5毫升）。注意，肝脏的颜色向浅棕色的变化。
- 不停止蠕动泵，替换20ml的收割注射器中的5毫升收获注射器和收集至少20毫升采用灌注的更高的速度（最多4毫升/分钟）肝灌注液。连续监视灌注液流入收集注射器，并且避免真空是太强（这可通过折叠腔静脉壁堵塞针）。
- 终止灌注时肝脏的颜色即变为浅棕色。
- 提取白细胞
- 吸出上清液
- 加入10毫升的PBS，离心，在400×g离心10分钟，吸出上清液。根据学习目标，用准备原样，或进行额外的纯化（ 如密度梯度分离）。
- 具体地，层4毫升灌洗液超过4毫升密度梯度分离质量，在50毫升聚丙烯离心管中。旋管在754 xg离心，RT，用于与所述脱离30分钟。
- 获得在通过手动移液的密度梯度分离的上清液接口单核层，在PBS中洗涤，并插入到5ml的管中。
2.鼠标协议
- 准备工作
- 通过每毫升磷酸盐加入不含防腐剂的肝素的30个单位制备肝素的PBS（30单位/ ml）溶液在室温（RT）的使用缓冲盐水（PBS）1×搜索解决方案ñ。计算每个动物20毫升
- 通过蠕动泵线和蝴蝶针传递肝素的PBS，以消除气泡。
- 消毒手术工具 - 2对剪刀，钝边镊子，2止血，和牙齿组织镊（高压釜在121℃下对重力（干燥）设定为至少30分钟）。
- MH-白细胞的肝脏和收集灌注
- 8％的异氟醚过量安乐死的动物。作为预防措施，将含有约鼠标头部异氟醚浸泡垫15毫升管，直至其打开胸腔。
- 固定鼠标的四肢在床上。
- 打开腹腔和胸腔空洞，露出肝脏，并立即心肺复时呼吸停止，保持完好的隔膜的高宽（以创建一个引流胸腔池）。避免通过这个过程出血。
- 具体而言，在较低的启动切口腹部中线来看，不损伤内脏，进步到两侧朝斜筋，通过它们切割胸上部腔水平。
- 拉出肠子和地点动物实验者的权利外，揭露门静脉。
- 插入30克针，连接到蠕动泵向门静脉喙脾静脉。
- 切隔膜上方的下腔静脉，以允许从胸腔灌注液引流和收集。
- 打开蠕动泵以约3毫升/分钟的速度，并轻轻收集前面的3 mL被污染从胸腔池血液灌注液。
- 弃掉此灌流液。如果需要的话再重复这样的洗涤，使用生理盐水，然后才开始收集肝脏灌注。
- 重新发起灌注在多达4毫升/分钟的速度，并且使用从胸腔收集10毫升灌注液连接到注射器蝴蝶。
- 终止灌注时肝脏的颜色即变为浅棕色。
- 提取白细胞
- 离心机灌注液在400×g下10分钟。
- 吸出上清液。
- 加入10毫升的PBS，离心，在400×g离心10分钟，吸出基于学习目标上清液，按原样使用制备，或进行额外的纯化（ 例如 ，密度梯度分离）。
- 具体地，每4毫升灌洗液超过4毫升密度梯度分离质量，在50毫升聚丙烯离心管层。旋管在754 xg离心，RT，用于与所述脱离30分钟。
- 获得在通过手动移液的密度梯度分离的上清液接口单核层，在PBS中洗涤，并插入到5ml的管中。
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Representative Results
在F344大鼠我们比较MH-NK细胞的以下肝组织的机械研磨的细胞毒性（从通过强制肝灌注的肝血窦收集）到整个肝脏细胞群的细胞毒作用，并以循环白细胞的细胞毒性。所有细胞制备物洗涤至少3次，如在免疫学测定程序中，并作为靶细胞系，我们使用了同种异体YAC-1或同基因MADB106靶细胞系。如在图1所示- 4，而MH-NK细胞表现出对MADB106和YAC-1靶细胞系（〜80％和最多100％）深刻的细胞毒性，这两个整个肝细胞群体（ 图1）和循环白细胞（ 图2和3）显示深刻较低水平的细胞毒性，并且对同基因MADB106靶细胞系几乎没有杀伤。同样relati已经细胞毒性的较低水平是显而易见的，当机械加工肝脏也经历清洗和密度梯度分离（ 图4），这是在文献中典型的水平。因此，MH-NK细胞表现出F344大鼠独特的高层次的细胞毒性。 FACS分析进行，并揭示了以下细胞亚群的组成深刻分歧：单核细胞（CD161dim），NK细胞（CD161亮），T细胞（CD3），B细胞（CD45）和NKT（CD161和CD3）细胞。在成熟的个人资料（细胞CD11b / CD27）的主要区别也不同室之间明显（ 图5）。
图1： 比较MH-NK细胞的细胞毒性的，对整个肝脏细胞群的细胞毒性（YAC-1靶细胞系）MH-NK细胞（从MH-车厢THROU收获。GH在本文中所描述的方法）表现出针对YAC-1靶细胞系深刻细胞毒活性，而整个肝细胞群体，通过肝脏的机械加工收获，显示最低水平（P <0.05）。 X轴表示执行到靶细胞比。数据以平均值±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2： 比较MH-NK细胞杀伤的，以循环白细胞（YAC-1靶细胞系）的细胞毒性 。 MH-NK细胞（通过本文所述方法从MH-车厢收获）展出针对YAC-1靶细胞系的细胞毒性深刻，而循环白细胞显示毒性最低水平（P <0.05）。 X轴表示执行到靶细胞比。数据以平均值±SEM。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3： 比较MH-NK细胞的细胞毒性，为循环中的白细胞（MADB106靶细胞系）MH-NK细胞（从通过本文所述方法的MH-车厢收获） 的细胞毒性表现出深刻的细胞毒性对同系MADB106靶细胞系，而循环白细胞显示细胞毒性（p <0.05）的最低水平。 X轴表示执行到靶细胞比。数据以平均值±SEM。 请点击此处ŤØ查看此图的放大版本。
图4： 比较MH-NK细胞的细胞毒性的，对整个肝脏淋巴细胞的细胞毒性然后依次和丰富通过密度梯度分离（YAC-1靶细胞系）MH-NK细胞（从MH-收获。通过本文中所描述的方法隔室）表现出针对YAC-1靶细胞系深刻的细胞毒性，而整个肝脏淋巴细胞（以下机械加工，将其洗涤并通过密度梯度分离富集），显示细胞毒性的显著较低水平（高达30％）（p <0.05），该文献中的典型。 X轴表示执行到靶细胞比。数据被表示为平均值±SEM表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5： 单核细胞亚群和NK细胞亚群从循环单核中，MH-单核，而整个肝脏单个核细胞比较 FACS分析显示，以下细胞亚群的构成明显的区别：（CD161dim）单核细胞，NK细胞（CD161亮），T细胞（CD3），B细胞（CD45）和NKT（CD161和CD3）细胞，以及在不同的车厢之间的成熟曲线（细胞CD11b / CD27）的区别。 请点击此处查看大图这一数字。
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Discussion
本文提出的肝脏灌注方法使选择性采伐和marginating肝白细胞的独特人口的研究。肝NK细胞，也被称为坑细胞3，构成驻留在肝窦鲜明的NK细胞群。它们在大鼠，小鼠17和在人类18,19找到。相比孤立外周血NK细胞，坑的细胞表现出较高的细胞毒性对YAC-1和CC531s靶细胞系20中 ，显示出具有更高的数目较小的胞质颗粒20，和表面抗原，诸如LFA-1的12的高表达。另外，与血液中分离NK细胞，陷窝细胞可以溶解NK-耐P815细胞。大鼠类似坑细胞，人肝NK细胞具有针对NK敏感的K562靶细胞较高的细胞毒性相比，循环NK细胞18,19，并分别显示出裂解NK抗性靶细胞18。全部测试升，因为肝脏是具体地和唯一地参与的各种疾病，免疫应该器官内的研究，和对MH隔室的细胞应从实质，枯否，和星状细胞区分开来。
如在引言中阐述，提供了灌注的方法是在普通机械研磨/生物降解过程有利的选择性收获MH白细胞，和更好的保护的完整性，活性，和MH白细胞的生理环境。事实上，评估NK细胞活性，通过我们的方法收获MH白细胞表现出显着高于NK细胞活性不是通过机械研磨过程收获的白细胞，尽管NK细胞的数量相近。
肝灌注技术仅在动物研究中可操作。免疫室可以质疑生物之间。然而，从这种方法获得的具体见解有关已显着差异人与仅基于循环白细胞观测临床意义。该测量在不同的免疫区室免疫指标动物研究可能会建议这在循环的每个免疫指数反映或与其在MH室水平相关的程度。一个有趣的观察是指使用在小鼠中这种技术，其中，灌注MH-NK细胞只展示针对靶细胞显著细胞毒性活性以下的动物21的先验免疫刺激。
该技术的几个重要方面应予以说明。在大鼠和小鼠，胸腔应立即广泛打开以下呼吸完全停止，并以最少的出血。在大鼠中，建议的心脏血液最大量在灌注之前撤回。在小鼠中，它是不建议抽取的血液从心脏的，因为它减少了在门静脉中的血压和使得它更难插入针通过它来继续该过程。这种针插入应相邻但喙脾静脉，因为人们希望确保从插入到门静脉进入肝脏的入口的距离足以使针是在一个稳定的位置，并允许所有叶得到灌注。而平行于其表面上，从而破裂血管壁的风险降至最低针应插入门静脉。在大鼠中，而将针向尾腔静脉的灌注液的集合，它是维持入口点尽可能窄以避免灌注液的一个潜在的泄漏是至关重要的。在小鼠中，重要的是早熟切开胸腔内的腔静脉而不破裂其他血管或肺中，为了避免不必要的血液污染是重要的。使用蠕动泵的主要优点是在灌注率稳定的控制，内部和之间动物。以保持在整个过程中的低流率，以避免门静脉的破裂是很重要的。作为肝灌注液的第一毫升的血液污染，如图它们应被丢弃。实现动物之间的标准化，开始收集的MH灌洗液的标准是基于从黑褐色至浅棕色的（而不是一个特定体积的集合）的颜色过渡。
沿传导的方法，可能会出现一些误动作，但大部分是可逆的。如果通过该PBS被输注进入肝脏针滑出，建议停止蠕动泵，泡肠道的周围区域（以达到更好的可见性），在一个稍微喙位置重新插入针，并重新启动水泵。
本文所述的肝脏灌注技术使得MH白细胞种群的选择性收获在一个相当简单的过程。特定这个人群相比从其他免疫车厢白细胞鲜明的特点，并可能有生物体的生物及临床意义显示，我们推荐使用这种方法的时候不可行的，因为从其他车厢白细胞可能没有反映MH人口的轮廓。此外，由于该技术不是在人类中可行的，我们还建议使用它在动物中，以澄清特定循环生物标志物与该MH特征相关，特别是研究肝相关的处理和疾病时。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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