Introduction
Les sinusoïdes hépatiques contiennent de nombreux sous-types de leucocytes de diverses activités immunitaires importantes pour l'organisme. Par exemple, marginating hépatique (MH) tueuses naturelles (cellules NK), aussi appelées cellules de la fosse, se caractérisent morphologiquement comme grands lymphocytes granuleux (LGL) et fonctionnellement comme leucocytes avec une capacité cytotoxique spontanée, permettant hépatique résistance contre l'établissement de encéphalique métastases tumorales supportés. L'objectif de la méthode présentée ici est de permettre la récolte sélective des leucocytes MH, afin d'étudier cette population cellulaire importante et unique (et le compartiment immunitaire), et d'élucider l'impact des diverses manipulations (par exemple l' activation immunitaire) sur ces cellules spécifiques.
En dépit de l'absence d'immunité pour éliminer une tumeur primaire en développement, la preuve chez les patients cancéreux et les modèles animaux indiquent que le système immunitaire peut contrôler les cellules tumorales circulantes, des micrométastases et des maladies résiduelles Throul'immunité à médiation cellulaire gh (CMI). Cependant, il y a une contradiction apparente entre ces capacités dans vivo et des études in vitro chez l' homme et chez les animaux, qui démontrent que la plupart des cellules tumorales autologues sont résistantes à la cytotoxicité par circulation ou leucocytes spléniques 1,2. Cette incohérence peut être attribuée, au moins en partie, à l'existence in vivo d'une sous - population leucocytaire distincte, à savoir les (sinusoïdes) leucocytes marginating-hépatique et leur sous - population de cellules NK activées, à savoir les cellules de la fosse 3. En effet, les données non publiées provenant de notre laboratoire ont indiqué que des rats F344 cellules tumorales syngéniques (de MADB106), qui se sont révélées résistantes aux leucocytes circulants et spléniques, ont été lysées par les cellules MH-NK 4. Ainsi, les cellules tumorales qui sont prétendument "NK-résistant" aux leucocytes circulants peuvent être contrôlées par les cellules MH-NK. Il convient de noter, chez la souris l'activité accrue de MH-NK est évident qu'à la suite in vivo immunitairela stimulation (par exemple , par l'utilisation de poly I: C , ou le CpG-C) 5.
Les cellules NK spécifiques hépatiques (MH-NK) sont situés à l'intérieur de la lumière sinusoïdales, adhérant aux cellules endothéliales et les cellules de Kupffer. Cellules MH-NK sont caractérisées exclusivement par des granules denses sphériques et des vésicules de tige-évidée 6, qui contiennent de la phosphatase acide que les enzymes lysosomales et perforine et granzymes comme substances bioactives 7,8. Par rapport à circulation des cellules NK, les cellules MH-NK présentent un plus grand nombre et la taille des granules et des vésicules 9-11. Dans des conditions inflammatoires, des cellules MH-NK ont été révélés présenter une expression plus élevée de LFA-1 12 par rapport à la circulation des cellules NK. Cette expression accrue peut constituer un mécanisme par lequel les cellules MH-NK sont plus cytotoxiques contre certaines cellules tumorales circulantes que les cellules NK 13,14. nterestingly, après une incubation in vitro avec l' interleukine (IL) -2, les cellules MH-NK se dilatent etleur nombre et la taille des granules augmentent, qui sont tous compatibles avec un pro fi le du tueur de lymphokine activé (LAK) cellules 15.
leucocytes actifs MH ne peuvent pas être exclusivement obtenues par les méthodes de récolte leucocytaires du foie standard, qui sont basées sur le broyage et la dégradation biologique du tissu. Notre approche de perfusion décrit ici présente deux avantages majeurs par rapport aux approches standard. Premièrement, l'approche de perfusion récolte sélective des leucocytes MH, empêchant la contamination par d'autres leucocytes d'autres compartiments du foie. Deuxièmement, la meilleure technique de perfusion préserve l'intégrité, l'activité, et le milieu physiologique des leucocytes MH, contrairement au traitement des tissus approches qui endommagent les cellules ou modifier leur morphologie, et en raison de lésions tissulaires, induisent la libération de divers facteurs qui modulent nettement immunitaire activité.
Le foie est un organe cible majeur pour les métastases du cancer and pour diverses infections 16. Comme les cellules MH présentent des caractéristiques uniques, il est important d'étudier cette population spécifique dans diverses conditions à l'égard de ces pathologies. Par exemple, il est intéressant de noter que l' activation immunitaire systémique par divers BRM (par exemple poly I: C ou CpG-C) ont été montré pour activer MH-leucocytes plus de leucocytes 5 circulation.
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Protocol
Déclaration d'éthique: Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels (IACUC) à l'Université de Tel-Aviv.
Protocole 1. Rats
- Les préparatifs
- Préparer du PBS héparinisé (30 unités / ml) de solution pour être utilisé à la température ambiante (RT), par addition de 30 unités d'héparine sans conservateur, par ml de solution saline de phosphate (PBS) 1 x solution tampon. Calculer 35 ml par animal.
- Passer du PBS héparinisé par les lignes de pompe péristaltique et les aiguilles à ailettes pour éliminer les bulles d'air.
- Stériliser outils chirurgicaux - 2 paires de ciseaux, une pince émoussée-avivés, 2 hémostatiques, et des pinces à dents tissus (autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec)).
- Perfusion du foie et de la collection de MH-leucocytes
- Euthanasier l'animal par une surdose de 8% isoflurane. Par précaution, placez un tube de 50 ml contenant un isofluranepad -soaked autour de la tête de rat jusqu'à l'ouverture de sa cavité thoracique.
- Ouvrez les cavités péritonéale et de la poitrine pour exposer le foie et le complexe cardiorespiratoire immédiatement après la cessation de la respiration. Évitez les saignements à travers ce processus.
- Plus précisément, commencer l'incision au niveau du point médian abdominale basse, sans organes internes dommageables, et les progrès des deux côtés en diagonale vers les côtes, coupe à travers eux à des niveaux de la poitrine-cavité supérieure.
- Dans environ une minute, de recueillir autant de sang que possible (~ 6 ml de 250 g animale) du ventricule droit dans une seringue.
- Fixer la veine cave caudale avec un hémostatique aussi près que possible du coeur, afin de permettre la collecte de perfusat.
- Tirez sur les intestins et en dehors de l'animal à la droite de l'expérimentateur, pour exposer la veine porte.
- Insérer un cathéter 25 G IV, relié à une pompe péristaltique, dans la veine porte, comme caudale que possible,mais rostrale à la veine splénique.
- Insérer une aiguille de calibre 25 de papillon, relié à une seringue de 5 ml, dans la veine cave inférieure, caudale par rapport à la pince hémostatique.
- Allumez la pompe péristaltique à une vitesse d'environ 3 ml / min et de recueillir doucement les premiers ml de perfusat qui sont contaminés par du sang dans la seringue. Continuez jusqu'à ce que la couleur perfusat est tour à tour rouge pâle (environ 3-5 ml). Notez que la couleur du foie évolue vers brun clair.
- Sans arrêter la pompe péristaltique, remplacer la seringue de 5 ml de récolte avec une seringue de 20 ml, la récolte et la collecte d'au moins 20 ml d'une solution de perfusion du foie en utilisant une plus grande vitesse de perfusion (jusqu'à 4 ml / min). Surveiller en permanence le flux de perfusat dans la seringue de collecte, et d'éviter le vide qui est trop forte (qui peut obstruer l'aiguille à travers l'effondrement des murs de veine cave).
- Terminate perfusion lorsque la couleur du foie se transforme en brun clair.
- leucocytes Extraction
- Aspirer le surnageant
- Ajouter 10 ml de PBS, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le surnageant. Sur la base des objectifs de l' étude, utiliser la préparation en est, ou de procéder à des purifications supplémentaires (par exemple, séparation par gradient de densité).
- Plus précisément, la couche 4 ml de solution de perfusion sur 4 ml de séparation de masse à gradient de densité dans un tube de centrifugation de polypropylene de 50 ml. Faites tourner les tubes à 754 xg, RT, pendant 30 min avec la pause au large.
- Obtenir les couches mononucléaires à la séparation-surnageant interface gradient de densité par pipetage manuel, lavage dans du PBS, et l'insérer dans un tube de 5 ml.
2. Protocole de souris
- Les préparatifs
- Préparer une solution de PBS héparinisé (30 unités / ml) à utiliser à la température ambiante (RT), par addition de 30 unités d'héparine sans conservateur par ml de tampon phosphate salin (PBS) 1 x solution. Calculer 20 ml par animal.
- Passer du PBS héparinisé par les lignes de pompe péristaltique et les aiguilles à ailettes pour éliminer les bulles d'air.
- Stériliser outils chirurgicaux - 2 paires de ciseaux, une pince émoussée-avivés, 2 hémostatiques, et des pinces à dents tissus (autoclave à 121 ° C pendant au moins 30 minutes sur la gravité paramètre (sec)).
- Perfusion du foie et de la collection de MH-Leucocytes
- Euthanasier l'animal par une surdose de 8% isoflurane. Par précaution, placez un tube de 15 ml contenant un tampon imbibé isoflurane autour de la tête de la souris jusqu'à l'ouverture de sa cavité thoracique.
- Fixer les membres de la souris à un lit.
- Ouvrez les cavités péritonéale et de la poitrine pour exposer le foie et le complexe cardiorespiratoire immédiatement après la cessation de la respiration, en gardant l'aspect inférieur de la membrane intacte (pour créer un pool de cavité thoracique de drainage). Évitez les saignements à travers ce processus.
- Plus précisément, commencer l'incision dans la partie inférieurePoint abdominale médiane, sans organes internes dommageables, et les progrès des deux côtés en diagonale vers les côtes, coupe à travers eux à des niveaux de la poitrine-cavité supérieure.
- Gigognes les intestins et en dehors de l'animal à la droite de l'expérimentateur, pour exposer la veine porte.
- Insérer une aiguille de 30 g, relié à une pompe péristaltique dans le rostre de la veine dans la veine splénique.
- Couper la veine cave inférieure au-dessus du diaphragme pour permettre le drainage et la collecte de la solution de perfusion à partir de la cavité thoracique.
- Allumez la pompe péristaltique à une vitesse d'environ 3 ml / min et doucement recueillir les 3 premiers ml de perfusat qui sont contaminés par du sang de la piscine de la cavité thoracique.
- Jeter cette perfusat. Répéter un tel lavage à nouveau si nécessaire, à l'aide d'une solution saline, et ensuite seulement commencer à recueillir perfusat du foie.
- Ré-amorcer la perfusion à une vitesse pouvant aller jusqu'à 4 ml / min, et de recueillir 10 ml de liquide de perfusion à partir de la cavité de la poitrine à l'aideun papillon relié à une seringue.
- Terminate perfusion lorsque la couleur du foie se transforme en brun clair.
- leucocytes Extraction
- Centrifuger la solution de perfusion pendant 10 minutes à 400 x g.
- Aspirer le surnageant.
- Ajouter 10 ml de PBS, centrifuger à 400 g pendant 10 min, et aspirer le surnageant en fonction des objectifs de l' étude, utiliser la préparation comme est, ou effectuer des purifications supplémentaires (par exemple, séparation par gradient de densité).
- Plus précisément, chaque couche 4 ml de solution de perfusion sur 4 ml de séparation de masse à gradient de densité dans un tube de centrifugation de polypropylene de 50 ml. Faites tourner les tubes à 754 xg, RT, pendant 30 min avec la pause au large.
- Obtenir les couches mononucléaires à la séparation-surnageant interface gradient de densité par pipetage manuel, lavage dans du PBS, et l'insérer dans un tube de 5 ml.
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Representative Results
Chez les rats F344, nous avons comparé la cytotoxicité des cellules MH-NK (collectées à partir des sinusoïdes du foie par perfusion du foie forcée) à la cytotoxicité de l'ensemble de la population de cellules du foie suite à un broyage mécanique du tissu hépatique et à la cytotoxicité des leucocytes circulants. Toutes les préparations de cellules ont été lavées au moins 3 fois, de routine dans des essais immunologiques, et en tant que lignées de cellules cibles, nous avons utilisé les lignées syngéniques les cellules cibles YAC-allogénique MADB106 1 ou. Comme cela est indiqué sur les figures 1 - 4, tandis que les cellules MH-NK présentent une profonde cytotoxicité contre les MADB106 et les lignées de cellules YAC-1 cible (~ 80% et jusqu'à 100% , respectivement), à la fois l' ensemble de la population de cellules du foie (figure 1) et leucocytes circulants (figures 2 et 3) affichent des niveaux inférieurs de cytotoxicité profondément, et presque pas de mise à mort contre la lignée cellulaire cible de MADB106 syngénique. La même chose relaticinq niveaux inférieurs de cytotoxicité sont évidents lorsque les foies traités mécaniquement ont également subi le lavage et la séparation par gradient de densité (figure 4), des niveaux qui sont typiques dans la littérature. Ainsi, les cellules MH-NK présentent des niveaux élevés de cytotoxicité unique chez les rats F344. l'analyse FACS a été effectuée et a révélé des différences profondes dans la composition des sous-populations cellulaires suivantes: monocytes (CD161dim), des cellules NK (CD161 en clair), les lymphocytes T (CD3), des lymphocytes B (CD45) et les cellules NKT (CD161 et CD3). Les principales différences dans le profil de maturation (CD11b / CD27) étaient également évidentes entre les différents compartiments (figure 5).
Figure 1: Comparaison de la cytotoxicité des cellules NK-MH, à la cytotoxicité de la population cellulaire du foie entière (YAC-1 cible lignée cellulaire) des cellules MH-NK (récoltées à partir de la MH-compartiment throu.gh l'approche décrite ici en) ont présenté une activité cytotoxique contre la lignée profonde des cellules cibles YAC-1, tandis que l'ensemble de la population des cellules hépatiques, récoltées par un traitement mécanique du foie, affiche des niveaux minimaux (p <0,05). axe X représente le rapport effecteur à des cellules cibles. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Comparaison de la cytotoxicité des cellules MH-NK, à cytotoxicité des leucocytes circulants (YAC-1 Target Cell Line). cellules MH-NK (récoltées à partir de la MH-compartiment à travers l'approche décrite de la présente) présentaient une profonde cytotoxicité contre la lignée cellulaire YAC-1 cible, tout en leucocytes circulants affichent des niveaux minimaux de cytotoxicité(P <0,05). axe X représente le rapport effecteur à des cellules cibles. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Une comparaison de la cytotoxicité des cellules MH-NK, à cytotoxicité des leucocytes circulants (MADB106 Target Cell Line) cellules MH-NK (récoltées à partir de la MH-compartiment à travers l'approche décrite de la présente) présentait une cytotoxicité profonde contre le MADB106 syngénique lignée cellulaire cible, tandis que les leucocytes circulants affichent des niveaux minimaux de cytotoxicité (p <0,05). axe X représente le rapport effecteur à des cellules cibles. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. S'il vous plaît cliquez ici to voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Comparaison de la cytotoxicité des cellules MH-NK, à cytotoxicité du foie entier Lymphocytes qui a été lavé et enrichie par gradient de densité de séparation (YAC-1 lignée cellulaire cible) des cellules MH-NK (récoltées à partir du MH-. compartiment à travers l'approche décrite à présent mémoire) présentait une profonde cytotoxicité à l'encontre de la lignée cellulaire YAC-1 cible, tandis que les lymphocytes du foie entier (après un traitement mécanique, qui a été lavé et enrichie par séparation par gradient de densité), affichent des niveaux significativement inférieurs de cytotoxicité (jusqu'à 30%) (p <0,05), qui sont typiques dans la littérature. axe X représente le rapport effecteur à des cellules cibles. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur type. S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. Comparaison des mononucléaires sous - ensembles cellulaires et NK sous - ensembles cellulaires De l'mononucléaires circulantes, le MH-mononucléaires, et l'ensemble des cellules du foie mononucléaires FACS analyse montre de nettes différences dans la composition des sous - populations de cellules suivantes: monocytes (CD161dim), les cellules NK (CD161 lumineux), les cellules T (CD3), les cellules B (CD45), et les cellules NKT (CD161 et CD3) ainsi que des différences dans le profil de maturation (CD11b / CD27) entre les différents compartiments. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
La méthode de perfusion du foie présenté ici permet une récolte sélective et à l'étude de la population unique de marginating leucocytes hépatiques. Cellules NK hépatiques, également appelées cellules fosse 3, constituent une population de cellules NK distinctif qui résident dans les sinusoïdes hépatiques. On les trouve chez les rats, les souris 17 et chez les humains 18,19. Par rapport aux cellules périphériques isolées NK, des cellules de puits montré une cytotoxicité plus élevée contre YAC-1 et CC531s lignées de cellules cibles 20 ont été montré pour avoir un plus grand nombre de petits granules cytoplasmiques 20, et une expression plus élevée des antigènes de surface, telles que LFA-1 12 . En outre, contrairement aux cellules NK de sang isolées, les cellules de la fosse peuvent lyser des cellules P815 NK-résistantes. Semblables à des cellules de rat de la fosse, les cellules NK hépatiques humains ont une cytotoxicité plus élevée contre des cellules cibles K562 sensibles à NK en circulation par rapport aux cellules NK 18,19 et ont été montrés à des cellules cibles NK-18 lysent résistantes. overall, comme le foie est spécifiquement et uniquement impliqué dans diverses maladies, l'immunité devrait être étudiée au sein de cet organe, et les cellules du compartiment MH doit être distingué de parenchyme, Kupffer et les cellules étoilées.
Comme il est précisé dans l'introduction, notre approche de perfusion est avantageux par rapport aux procédures communes / mécaniques de broyage biologiques de dégradation de la récolte sélective des leucocytes MH, et mieux préserver l'intégrité, l'activité, et le milieu physiologique des leucocytes MH. En effet, l'évaluation de la cytotoxicité des NK, les leucocytes MH récoltés grâce à notre approche présentaient une cytotoxicité NK nettement plus élevé que les leucocytes récoltés à travers la procédure de broyage mécanique, malgré le même nombre de cellules NK.
La technique de perfusion hépatique ne fonctionne que dans les études animales. différences Cependant, des idées spécifiques obtenues à partir de cette approche en ce qui concerne marqué entre les compartiments immunitaires peut remettre en question le produit biologiqueal et la signification clinique des observations fondées uniquement sur les leucocytes circulants. Des études animales qui mesurent les indices immuns dans différents compartiments immunitaires peuvent indiquer le degré auquel chaque indice immunologique dans la circulation réfléchit ou est en corrélation avec les niveaux dans le compartiment MH. Une observation intéressante se réfère à l' utilisation de cette technique dans des souris, dans lesquelles les cellules NK MH-perfusés seront seulement de démontrer l' activité cytotoxique significative contre les cellules cibles après une stimulation immunitaire de l'animal 21 a priori.
Quelques aspects essentiels de la technique doivent être indiqués. Chez les rats et les souris, la cavité thoracique doit être largement ouvert immédiatement après la cessation complète de la respiration, et avec peu de saignements. Chez les rats, il est recommandé que la quantité maximale de sang cardiaque est retirée avant la perfusion. Chez les souris, il est recommandé de ne pas retirer le sang du coeur, car il réduit la pression artérielle dans la veine porte etil est plus difficile d'insérer l'aiguille à travers elle pour continuer le processus. Cette insertion de l'aiguille doit être adjacente mais rostrale à la veine splénique, comme on le souhaite faire en sorte que la distance de l'insertion à l'entrée de la veine porte vers le foie est suffisante pour que l'aiguille soit dans une position stable et permet à tout le lobes pour obtenir perfusées. L'aiguille doit être insérée dans la veine porte tout en parallèle à sa surface, de sorte que le risque de rupture de la paroi du récipient est réduite au minimum. Chez le rat, tout en insérant une aiguille à la veine cave caudale pour la collection du perfusat, il est essentiel de maintenir le point d'entrée aussi étroite que possible afin d'éviter une fuite potentielle de perfusat. Chez les souris, il est important de précocément couper la veine cave, à l'intérieur de la cavité thoracique, sans se rompre d'autres vaisseaux sanguins ou des poumons, afin d'éviter la contamination du sang inutile. L'avantage majeur de l'utilisation d'une pompe péristaltique est un contrôle stable sur le taux de perfusion, au sein et entreanimaux. Il est important de maintenir un faible débit pendant toute la procédure, afin d'éviter la rupture de la veine porte. Alors que les premiers millilitres de solution de perfusion du foie sont contaminées par le sang, ils doivent être mis au rebut comme indiqué. Pour parvenir à la normalisation entre les animaux, le critère de commencer à recueillir le perfusat MH est basé sur la transition de couleur du brun foncé au brun clair (plutôt que la collecte d'un volume spécifique).
En conduisant la procédure, plusieurs dysfonctionnements peuvent se produire, mais la plupart sont réversibles. Si l'aiguille à travers laquelle le PBS est transfusé dans le foie glisse, il est recommandé d'arrêter la pompe péristaltique, faire tremper la zone environnante de l'intestin (pour obtenir une meilleure visibilité), ré-insérer l'aiguille dans une position légèrement plus rostrale, et re-démarrer la pompe.
La technique de perfusion du foie décrit ici permet une récolte sélective de la population leucocytaire MH dans un processus assez simple. Donnéque cette population présente des caractéristiques distinctives par rapport aux leucocytes d'autres compartiments immunitaires, et peuvent avoir une signification biologique et clinique à l'organisme, nous recommandons l'utilisation de cette méthode lorsque cela est possible, comme les leucocytes d'autres compartiments peuvent ne pas refléter le profil de la population MH. De plus, comme cette technique est faisable chez les humains, nous proposons en outre l'employer chez les animaux afin de clarifier les biomarqueurs circulants spécifiques qui sont en corrélation avec les caractéristiques MH, en particulier lors de l'étude des processus et des maladies liées hépatiques.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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