Introduction
Os sinusóides do fígado contêm numerosos subtipos de leucócitos de várias actividades imunes críticos para o organismo. Por exemplo, marginating hepática células natural killer (MH) (NK), também conhecidas como células pit, são caracterizados morfologicamente como grandes linfócitos granulares (LGLs) e funcionalmente como leucócitos com capacidade citotóxica espontânea, permitindo hepática resistência contra o estabelecimento de análises ao sangue metástases tumorais Borne. O objectivo do método aqui apresentado é o de permitir a colheita selectiva de leucócitos MH, a fim de estudar esta população de células importante e original (e compartimento imune), e para elucidar o impacto de várias manipulações (por exemplo, activação imune) sobre essas células específicas.
Apesar do fracasso da imunidade para eliminar o desenvolvimento de um tumor primário, provas em pacientes com cancro e em modelos animais indicam que o sistema imune pode controlar células tumorais, micrometástases e de doença residual que circula atraimunidade mediada por células GH (CMI). No entanto, existe uma aparente inconsistência entre estes em capacidades in vivo e in vitro em seres humanos e em animais, que demonstram que a maioria das células tumorais autólogas são resistentes a citotoxicidade pela circulação de leucócitos ou esplénicas 1,2. Esta inconsistência pode ser atribuída, pelo menos em parte, à existência in vivo de uma subpopulação de leucócitos distintas, a saber, os sinusóides (leucócitos) marginating-hepático e a sua sub-população de células NK activadas, nomeadamente células pit 3. Com efeito, dados não publicados do nosso laboratório indicaram que em ratos F344 células tumorais singénicas (MADB106), as quais foram consideradas resistentes à circulação e esplénicos leucócitos, foram submetidas a lise por células NK MH-4. Assim, as células tumorais que são "resistente NK-" alegadamente para leucócitos circulantes podem ser controlados por células NK-MH. Notável, em ratos o aumento da atividade de MH-NK é evidente apenas seguir in vivo imunológicoestimulação (por exemplo, através da utilização de poli I: C ou CpG-C) 5.
células NK específico do fígado (MH-NK) estão situados dentro do lúmen sinusoidais, aderir às células endoteliais e células de Kupffer. Células MH-NK são caracterizados exclusivamente por grânulos densos esféricas e vesículas com núcleo de haste 6, que contêm fosfatase ácida como enzimas lisossomais e perforina e granzimas como substâncias bioativas 7,8. Em comparação com células NK circulantes, células-NK MH exibem um maior número e tamanho dos grânulos e vesículas 9-11. Sob condições inflamatórias, células-NK foram MH mostrado exibir maior expressão de LFA-1 12, em comparação com células NK circulantes. Esta expressão aumentada pode constituir um mecanismo pelo qual as células NK-MH é mais citotóxico contra certas células tumorais do que as células NK circulantes 13,14. nterestingly, após incubação in vitro com a interleucina (IL) -2, células-NK MH tornou alargada, eo seu número e tamanho de grânulos de aumentar, os quais são consistentes com uma pro fi le de assassinas activadas por linfocina (LAK) células 15.
leucócitos MH activas não podem ser obtidos exclusivamente através dos métodos de colheita de leucócitos no fígado padrão, os quais são baseados na moedura e degradação biológica do tecido. A nossa abordagem perfusão aqui descrito possui duas grandes vantagens em comparação com os métodos normais. Em primeiro lugar, a abordagem de perfusão colhe seletivamente leucócitos MH, evitando a contaminação por outros leucócitos de outros compartimentos do fígado. Em segundo lugar, a técnica de perfusão melhor preserva a integridade, a actividade, e o meio fisiológico de leucócitos MH, ao contrário do processamento de tecidos abordagens que danificam as células ou alteram a sua morfologia, e devido ao dano do tecido, induzir a libertação de vários factores que marcadamente modular imune atividade.
O fígado é um dos principais alvos de metástase de câncer dend para várias infecções 16. Como as células MH apresentam características únicas que é importante estudar essa população específica sob várias condições no que diz respeito a estas patologias. Por exemplo, é digno de nota que a activação imunitária sistémica por vários BRMs (por exemplo, poli I: C ou CpG-C) têm mostrado activar MH-leucócitos mais do que 5 leucócitos circulantes.
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Protocol
Declaração de Ética: Procedimentos envolvendo indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Tel-Aviv.
Protocolo 1. Ratos
- preparativos
- Preparar a solução de PBS heparinizado (30 unidades / ml) para ser utilizado à temperatura ambiente (RT) por adição de 30 unidades de heparina livre de conservante por ml de tampão fosfato salino (PBS) 1x solução. Calcular 35 ml por animal.
- Passe heparinizado PBS através das linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para eliminar bolhas de ar.
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos - 2 pares de tesouras, fórceps embotados-2 gumes, hemostáticos, e uma pinça de dente-de tecido (autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco)).
- Perfusão do Fígado e Recolha de MH-leucócitos
- Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Como medida de precaução, coloque um tubo de 50 ml contendo um isofluranopad -soaked em torno da cabeça do rato até que a abertura de sua caixa torácica.
- Abrir as cavidades peritoneais e tórax para expor o fígado e o complexo cardiopulmonar imediatamente após a cessação da respiração. Evitar o sangramento através deste processo.
- Especificamente, iniciar a incisão no ponto da linha média abdominal inferior, sem órgãos internos prejudiciais, e progresso para ambos os lados na diagonal em direção as costelas, cortando-os a níveis peito-cavidade superior.
- Dentro de aproximadamente um minuto, recolher o máximo de sangue possível (~ 6 ml de um 250 g de animais) do ventrículo direito para uma seringa.
- Prender a veia cava caudal com uma pinça hemostática tão próximo quanto possível do coração, para permitir a recolha do perfundido.
- Retire os intestinos e lugar fora do animal para a direita do experimentador, para expor a veia portal.
- Inserir um cateter IV 25 L, ligado a uma bomba peristáltica, na veia porta, como caudal quanto possível,mas rostral à veia do baço.
- Inserir uma agulha G 25 borboleta, ligado a uma seringa de 5 ml, para a veia cava inferior, caudal para a pinça hemostática.
- Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 ml / min e recolhem suavemente os primeiros ml de perfusato que está contaminada com sangue para a seringa. Continue até que a cor do perfusato é ficar vermelho pálido (aproximadamente 3-5 ml). Note-se que a cor do fígado está mudando no sentido castanho claro.
- Sem parar a bomba peristáltica, substituir a seringa de 5 mL com uma seringa de colheita de 20 ml de colheita e recolha de pelo menos 20 ml de perfusato fígado empregando uma velocidade mais elevada de perfusão (até 4 ml / min). monitorar continuamente o fluxo de perfusato para a seringa de coleta, e evitar vácuo que é muito forte (que podem entupir a agulha através colapso das paredes da veia cava).
- Terminar a perfusão, quando a cor do fígado vira-se para castanho claro.
- leucócitos Extração
- Aspirar o sobrenadante
- Adicionar 10 ml de PBS, centrifugação a 400 xg durante 10 min, e o sobrenadante aspirado. Com base em metas de estudo, utilize preparação como está, ou realizar purificações adicionais (por exemplo, separação, em gradiente de densidade).
- Especificamente, a camada de 4 ml de perfusato mais de 4 ml de massa separação em gradiente de densidade num tubo de centrifugação de polipropileno de 50 cc. Gire os tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos com a quebra de fora.
- Obter as camadas mononucleares na interface de separação por gradiente de densidade de sobrenadante por pipetagem manual de, lavar em PBS, e inserir um tubo de 5 ml.
2. Rato Protocolo
- preparativos
- Preparar a solução de PBS heparinizado (30 unidades / ml) para ser utilizado à temperatura ambiente (RT) por adição de 30 unidades de heparina livre de conservante por ml de fosfato salino (PBS) tamponada 1x solution. Calcular 20 ml por animal.
- Passe heparinizado PBS através das linhas de bomba peristáltica e as agulhas borboleta para eliminar bolhas de ar.
- Esterilizar instrumentos cirúrgicos - 2 pares de tesouras, fórceps embotados-2 gumes, hemostáticos, e uma pinça de dente-de tecido (autoclave a 121 ° C durante pelo menos 30 min no ambiente gravidade (seco)).
- Perfusão do Fígado e Recolha de MH-Leucócitos
- Eutanásia do animal por uma overdose de 8% de isoflurano. Como medida de precaução, coloque um tubo de 15 ml contendo uma almofada encharcada de isoflurano em torno da cabeça do rato até a abertura de sua caixa torácica.
- Corrigir os membros do mouse para uma cama.
- Abrir as cavidades peritoneais e tórax para expor o fígado e o complexo cardiopulmonar imediatamente após a cessação da respiração, mantendo o aspecto inferior do diafragma intacto (para criar uma cavidade torácica piscina drenagem). Evitar o sangramento através deste processo.
- Especificamente, iniciar a incisão na parte inferiorponto abdominal na linha média, sem órgãos internos prejudiciais, e progresso para ambos os lados na diagonal em direção as costelas, cortando-os a níveis peito-cavidade superior.
- Arrancamento dos intestinos e lugar fora do animal para a direita do experimentador, para expor a veia portal.
- Inserir uma agulha 30 g, ligada a uma bomba peristáltica para a veia porta rostral à veia esplénica.
- Cortar a veia cava inferior acima do diafragma para permitir a drenagem e recolha do perfundido da cavidade torácica.
- Ligar a bomba peristáltica a uma velocidade de aproximadamente 3 ml / min e suavemente recolher os primeiros 3 ml de perfusato que está contaminada com sangue a partir da piscina cavidade torácica.
- Descarte este perfusato. Repita essa lavar novamente, se necessário, usando solução salina, e só então começar a recolher perfusato fígado.
- Re-iniciar a perfusão a uma velocidade de até 4 ml / min, e recolher 10 ml de perfusato da cavidade torácica usandouma borboleta ligado a uma seringa.
- Terminar a perfusão, quando a cor do fígado vira-se para castanho claro.
- leucócitos Extração
- Centrifugar o perfusado durante 10 min a 400 x g.
- Aspirar o sobrenadante.
- Adicionar 10 ml PBS, centrifugação a 400 xg durante 10 min, e aspirar o sobrenadante com base em metas de estudo, utilize preparação como é, ou realizar purificações adicionais (por exemplo, separação, em gradiente de densidade).
- Especificamente, a cada camada de 4 ml de perfusato mais de 4 ml de massa separação em gradiente de densidade num tubo de centrifugação de polipropileno de 50 cc. Gire os tubos a 754 xg, RT, durante 30 minutos com a quebra de fora.
- Obter as camadas mononucleares na interface de separação por gradiente de densidade de sobrenadante por pipetagem manual de, lavar em PBS, e inserir um tubo de 5 ml.
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Representative Results
Em ratos F344 comparou-se a citotoxicidade de células NK-MH (recolhida das sinusóides do fígado por perfusão do fígado forçada) para citotoxicidade de toda a população de células de fígado após trituração mecânica do tecido do fígado, e para a citotoxicidade de leucócitos circulantes. Todas as preparações celulares foram lavadas, pelo menos, 3 vezes, como rotina em ensaios imunológicos, e como linhas de células alvo foi utilizado o alogénico de YAC-1 ou as linhas de células alvo singeneicas MADB106. Tal como indicado nas Figuras 1 - 4, enquanto que as células de MH-NK exibiu profunda citotoxicidade contra a MADB106 e as linhas de células YAC-1 alvo (~ 80% até 100%, respectivamente), quer a população de células de fígado inteira (Figura 1) e leucócitos circulantes (Figuras 2 e 3) apresentaram níveis inferiores de citotoxicidade profundamente, e quase não matar contra a linha celular alvo MADB106 singeneicos. O mesmo relative níveis mais baixos de citotoxicidade foram evidentes quando os fígados tratados mecanicamente também foram submetidos a lavagem e separação por gradiente de densidade (Figura 4), os níveis que são típicas na literatura. Assim, as células NK-MH exibem unicamente níveis elevados de citotoxicidade em ratos F344. A análise FACS foi realizada e revelou diferenças profundas na composição dos seguintes sub-populações de células: monócitos (CD161dim), células NK (CD161 brilhantes), células T (CD3), células B (CD45), e as células NKT (CD161) e CD3. As principais diferenças no perfil de maturação (CD11b / CD27) também foram evidentes entre os diferentes compartimentos (Figura 5).
Figura 1: Uma comparação da citotoxicidade das células NK-MH, a citotoxicidade da toda a população celular do fígado (YAC-1 linha celular alvo) MH células-NK (colhidas a partir do compartimento MH-atra.gh a abordagem descrita aqui) exibiu actividade citotóxica contra profundo da linha de células-alvo YAC-1, ao passo que a totalidade da população de células do fígado, colhidas por meio de tratamento mecânico do fígado, apresentado níveis mínimos (p <0,05). eixo X representa relação de células efectoras-para-alvo. Os dados são apresentados como média ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Uma comparação da citotoxicidade das células NK-MH, a citotoxicidade de leucócitos circulantes (YAC-1 da linha celular-alvo). As células NK (MH-colhidas de MH-o compartimento através da abordagem aqui descrita) exibiu profunda citotoxicidade contra a linha celular-alvo YAC-1, ao passo que leucócitos circulantes apresentado níveis mínimos de citotoxicidade(P <0,05). eixo X representa relação de células efectoras-para-alvo. Os dados são apresentados como média ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Uma comparação da citotoxicidade de células MH-NK, a citotoxicidade de leucócitos circulantes (linha celular MADB106 alvo) células MH-NK (colhida do HM-compartimento através da abordagem aqui descrita) exibiu profunda citotoxicidade contra a MADB106 singeneicos linha celular alvo, ao passo que leucócitos circulantes apresentado níveis mínimos de citotoxicidade (p <0,05). eixo X representa relação de células efectoras-para-alvo. Os dados são apresentados como média ± SEM. Por favor clique aqui to visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Uma comparação da citotoxicidade das células NK-MH, a citotoxicidade do fígado Linfócitos inteiro que foi lavado e enriquecida através da separação em gradiente de densidade (YAC-1 A linha de células alvo) MH células-NK (colhido do MH-. compartimento através da abordagem aqui descrita) exibiu profunda citotoxicidade contra a linha celular-alvo YAC-1, ao passo que os linfócitos de fígado inteiras (seguintes processamento mecânico, o qual foi lavado e enriquecido através de separação em gradiente de densidade), exibiram níveis significativamente mais baixos de citotoxicidade (até 30%) (P <0,05) que são típicas na literatura. eixo X representa relação de células efectoras-para-alvo. Os dados são apresentados como média ± SEM. Por favorclique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Uma comparação de subpopulações de células mononucleares e subconjuntos de células NK Do mononucleares circulantes, o MH-mononucleares, e toda a células do fígado mononucleares FACS análise mostra diferenças claras na composição das seguintes subpopulações de células: monócitos (CD161dim), células NK (CD161 brilhante), as células T (CD3), células B (CD45), e as células NKT (CD161 e CD3), bem como diferenças no perfil de maturação (CD11b / CD27) entre diferentes compartimentos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de perfusão do fígado aqui apresentada permite uma colheita selectiva e estudo da população única de marginating leucócitos hepáticas. Células hepáticas NK, também chamados de células pit 3, constituem uma população distinta de células NK que residem nos sinusóides hepáticos. Eles são encontrados em ratos, ratos 17 e em humanos 18,19. Em comparação com células NK periféricas isoladas, células pit demonstraram maior citotoxicidade contra YAC-1 e CC531s linhas celulares alvo 20, mostraram ter um maior número de pequenos grânulos citoplasmáticos 20, e uma maior expressão de antigénios de superfície, tais como LFA-1 12 . Além disso, ao contrário das células NK isoladas de sangue, as células pit podem lisar células P815-resistentes a NK. Semelhantes a células pit de rato, células NK hepáticos humanos têm uma maior citotoxicidade contra células alvo K562 NK-sensíveis em comparação com células NK 18,19 circulante, e foram exibidas para lisar células alvo resistentes a NK 18. Overall, como o fígado é especificamente e exclusivamente envolvido em várias doenças, a imunidade deve ser estudada dentro deste órgão, e as células do compartimento de MH deve ser distinguido do parênquima, de Kupffer e células estreladas.
Como elaborada na introdução, a nossa abordagem de perfusão é vantajoso sobre os procedimentos de degradação comuns mecânicos trituração / biológicos na colheita seletiva leucócitos MH, e em melhor preservar a integridade, a atividade, e do meio fisiológico de leucócitos MH. Na verdade, avaliando NK citotoxicidade, leucócitos MH colhidas através de nossa abordagem exibiu uma acentuadamente maior citotoxicidade NK de leucócitos colhidos através do processo de trituração mecânica, apesar número semelhante de células NK.
A técnica de perfusão hepática só funciona em estudos com animais. diferenças no entanto, percepções específicos obtidos a partir desta abordagem com relação marcadas entre os compartimentos imunes podem questionar a biológicaal e significado clínico de observações baseadas unicamente em leucócitos circulantes. Os estudos em animais que medem índices imunológicos em diferentes compartimentos do sistema imunológico pode sugerir o grau em que cada um dos índices imunológicos na prática não corresponde ou se correlaciona com os seus níveis no compartimento de MH. Uma observação interessante refere-se ao emprego desta técnica em ratinhos, em que as células NK-MH perfundidos apenas apresenta actividade citotóxica significativa contra células alvo na sequência de uma a priori a estimulação imunológica do animal 21.
devem ser indicados alguns aspectos críticos da técnica. Em ambos os ratos e camundongos, a cavidade torácica deve ser aberto amplamente imediatamente após a cessação completa da respiração e, com sangramento mínimo. Em ratos, recomenda-se que a quantidade máxima de sangue cardíaco é retirada antes da perfusão. Em ratos, não é recomendado para o sangue retirado do coração, uma vez que reduz a pressão sanguínea na veia porta etorna mais difícil de inserir a agulha através dele para continuar o processo. Esta inserção da agulha deve ser feita adjacente mas rostral à veia esplénica, como se deseja assegurar que a distância a partir da inserção para a entrada da veia porta para o fígado é suficiente para que a agulha seja numa posição estável e permite que todo o lóbulos para se perfusão. A agulha deve ser inserida na veia portal, paralela à sua superfície, de modo que o risco de ruptura da parede do recipiente é minimizada. Em ratos, enquanto que a inserção de uma agulha para a veia cava caudal para a recolha do perfusado, é crucial manter o ponto de entrada tão estreita quanto possível para evitar uma potencial fuga de perfusado. Em ratinhos, é importante precocemente cortar a veia cava interior da cavidade torácica sem ruptura outros vasos sanguíneos ou os pulmões, a fim de evitar a contaminação do sangue desnecessária. A principal vantagem da utilização de uma bomba peristáltica é um controlo estável durante a taxa de perfusão, dentro e entreanimais. É importante manter um caudal baixo durante todo o procedimento, a fim de evitar a ruptura da veia porta. Como os primeiros ml de perfusato fígado estão contaminados com sangue, devem ser descartadas, conforme mostrado. Para alcançar a normalização entre os animais, o critério para começar a recolher o perfusato MH é baseada na transição de cor do marrom escuro ao castanho claro (em vez de coleção de um volume específico).
Junto a realização do processo, pode ocorrer vários problemas de funcionamento, mas a maioria são reversíveis. Se a agulha através do qual o PBS é transfundido no fígado desliza para fora, recomenda-se para parar a bomba peristáltica, mergulhe a área circundante do intestino (para conseguir uma melhor visibilidade), re-inserir a agulha em uma posição ligeiramente mais rostral, e re-ligar a bomba.
A técnica de perfusão do fígado aqui descrito permite uma colheita selectiva da população de leucócitos MH em um processo bastante simples. Dadoque esta população apresenta características distintivas em comparação com leucócitos de outros compartimentos do sistema imunológico, e pode ter importância biológica e clínica para o organismo, recomendamos o uso deste método quando viável, como leucócitos de outros compartimentos podem não refletir o perfil da população MH. Além disso, como esta técnica não é realizável em seres humanos, sugere-se adicionalmente que emprega-lo em animais para esclarecer biomarcadores específicos circulantes que se correlacionam com as características MH, em particular quando o estudo de processos e doenças relacionadas com a hepáticas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26 G | |
| Butterfly needle | OMG | 21 G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| 22 W Fluorescent Daylight Magnifier Lamp |
References
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