Abstract
Protokoller for å generere populasjoner av cardiomyocytes fra pluripotente stamceller har blitt utviklet, men disse gir generelt celler av blandede fenotyper. Forskere er interessert i å forfølge studier med spesifikke myocyte subtyper krever en mer rettet differensiering tilnærming. Ved å behandle mus embryonale stamceller (ES-celler) med Grem2, en utskilt BMP-antagonist som er nødvendig for atrial kammeret dannelse in vivo, kan et stort antall hjerteceller med en atrial fenotype bli generert. Bruk av konstruert Myh6-DsRed-Nuc pluripotent stamcellelinje muliggjør identifisering, utvelgelse, og rensing av cardiomyocytes. I denne protokollen embryoid kropper er generert fra Myh6-DsRed-NUC celler ved hjelp av den hengende slipp-metoden og holdt i suspensjon inntil differensiering dag 4 (d4). Ved D4 cellene behandles med Grem2 og sådd ut på gelatin-belagte plater. Mellom d8-D10 store entreprenør områdene er observert i kulturer og fortsette å utvide og mperaturen gjennom D14. Molekylær, histologiske og electrophysiogical analyser indikerer celler i Grem2-behandlede celler skaffe atrial-lignende egenskaper som gir en in vitro modell for å studere biologi av atriale kardiomyocytter og deres respons på forskjellige farmakologiske midler.
Introduction
Pluripotente stamceller er et kraftig verktøy for å generere og studere celler fra en rekke vanskelig å få tilgang til vev for grunnleggende forskning og pre-kliniske studier, spesielt hos mennesker 1-5. Riktig modulering av utviklingssignalveier kan direkte differensiering av pluripotente stamceller til ønsket fenotypiske skjebne. Mange protokoller har blitt utviklet for å generere cardiomyocytes (CMS) fra pluripotente stamceller 6-14. Disse protokollene som regel innebære modulering av TFGβ super (activin, BMP, og TGFp) og Wnt trasé gjennom tidsbestemt tillegg av eksogene vekstfaktorer og / eller små molekyler 10,12-15. Disse protokollene er generelt effektive til å øke prosentandelen av celler som blir CMs, men mangler spesifisitet, generering av en blandet populasjon av celler som representerer atrial, ventrikulær og nodal / ledningssystem linjene. For å studere spesifikk hjerte subtyper en mer rettet differensiering approach kreves.
Gremlin2 (Grem2, også kalt Protein Relatert til Dan og Cerberus eller Prdc for kort) er en utskilt BMP antagonist som er nødvendig for riktig hjerte differensiering og atrial kammer formasjon under hjerte utvikling i sebrafisk 16. Behandling differensierende embryonale stamceller med Grem2 på differensiering dag 4, like etter peak uttrykk for mesodermal markører T-Brachyury og Cerberus som en, øker utbyttet av CMS og genererer en pool av celler hovedsakelig av atrial avstamning 14.
Rekombinant Grem2 brukes til å behandle de unike celler og kan gjøres ved hjelp av standard proteinproduksjonsteknikker 17 eller kan kjøpes kommersielt. Det er meget oppløselig i vandige oppløsninger og kan bli tilsatt eksogent til kulturene på det ønskede tidspunkt.
Differensiering kan spores ved hjelp RT-qPCR å kvantifisere uttrykk for markører representantav hjerte-stamfedre, hjertestamfedre, og engasjerte CMS. Immunfluorescens kan også brukes til å identifisere og visualisere romlig fordeling av hjertecelletyper.
Applikasjoner som krever rene populasjoner er lettere utført ved bruk av en reporter system for å identifisere og isolere CMS. For dette formålet, har vi innført αMHC-DsRedNuc konstruere i musen CGR8 ES cellelinje 14. CGR8 celler vokse og forbli pluripotent uten mateceller, tilrettelegging for utvidelse og differensierings analyser 18. ES cellelinje inneholder en DsRed fluorescerende proteinkodende sekvens med et kjernefysiske lokalisering signal under hjertespesifikke alpha Myosin Heavy Chain (a Mhc eller Myh6) genet promoter. Ved hjelp av disse cellene, kan CMs lett identifiseres og isoleres for kvantifisering, celle sortering, elektrofysiologi, narkotika-skjermer, og studere mekanismer for atrial differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Cell Culture Media, løsninger og reagenser.
- Forbered 500 ml Mouse embryonale stamceller (Mesc) medie ved å blande og steril filtrering (0,2 mikrometer porestørrelse) 445 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM), 50 ml varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS), 5 ml 100X konsentrert L- glutamin erstatning, 5 pl rekombinant mus leukemiinhiberende faktor (LIF) ved 1 x 10 7 enheter per ml og 1,43 ul ß-merkaptoetanol (endelig konsentrasjon er 50 uM). Oppbevar ved 4 ˚C til den er klar til bruk.
- Fremstille 500 ml embryoid Body (EB) differensiering media ved blanding og steril filtrering av 391 ml Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM), 100 ml varme-inaktivert FBS, konsentrert 5 ml 100 x L-glutamin erstatning, 5 ml 100X konsentrert, ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), og 2,86 pl ß-merkaptoetanol (endelig konsentrasjon er 100 uM). Oppbevares ved 4˚ C til den er klar til bruk.
- Forbered 0,2% w/ volum oppløsning av gelatin ved å blande 1 g svinehud gelatinpulver med 500 ml filtrert, destillert H2O Steriliser ved autoklave. Legg merke til at gelatinen ikke kan være fullstendig løselig i vann ved romtemperatur. Etter autoklavering gelatinen bør være fullstendig oppløst. Oppbevar ved romtemperatur til den er klar til bruk.
- Forbered Grem2 rekombinant protein alikvoter ved oppløsning av 50 ug pellet av lyofilisert Grem2 i 100 ul fosfatbufret saltvann (PBS) supplert med 0,1% BSA for å lage en 0,5 ug / ul stamløsning. Delmengde 20 mL av denne stamløsningen inn i fem sterile 1,5 ml sentrifugerør og oppbevares ved -80˚ C til den er klar til bruk.
- Forbered PBS ifølge publiserte protokoller eller kjøp som en 10X lager og fortynnet 1:10 med filtrert, destillert H 2 O for å lage en 1X arbeidsfortynning 19. Steriliser PBS ved autoklave før bruk. Oppbevar ved romtemperatur til den er klar til bruk. I enkelte trinn, DPBS uten Ca2 + og Mg2 + er brukt. Dette er purchased som en 1X-oppløsning. Bestillingsinformasjon er inkludert i tabellen av reagenser.
2. Utarbeidelse av Gelatin Coated 10 cm vevskulturskåler
- I en sterilisert vevskultur panseret tilsett 5 ml 0,2% gelatin løsning til hver 10 cm vev kultur parabolen for belegg. Plasser retter i inkubator ved 37 C i minst 30 minutter eller opp til 4 dager.
3. Utarbeidelse av Gelatin Coated 6-brønns vevskulturplater
- I et sterilisert vevskultur hette tilsett 1 ml 0,2% gelatin til hver brønn i en 6-brønners vevkulturplate. Plasser platene i inkubator ved 37 C i minst 30 minutter eller opp til 4 dager.
4. Embryonic Stem Cell Culture
- tining mESCs
- Forbered Mesc media ved oppvarming til romtemperatur i en sterilisert vev kultur hette. Tilsett 10 ml RT medier til en gelatin-belagt 10 cm tallerken.
- Fjern en ampulle med mESCs inneholder ca. 1 x 10 6 celler fracryostorage. Holding kryoampulle med tang, plass i en 37 ˚C vannbad. Virvle til cellesuspensjonen er tint, og bare en liten iskrystall forblir i midten av beholderen. Tørk av glasset med et engangs lofri tørke og sterilisere med 70% EtOH.
- I et sterilt vev kultur hette fjerne tinte celler ved hjelp av en P1000 tips fra kryoampulle og overføre til 10 cm tallerken utarbeidet i 4.1.1).
- Plasser 10 cm tallerken til 37 ˚C fuktet cellekultur inkubator med 5% CO 2 og fordele celler ved forsiktig å bevege platen forfra og bakover, for deretter side til side. Tillat celler å feste til platen O / N eller minst 6 timer.
- Først neste morgen sjekk celler for vedlegg ved hjelp av en lys feltet mikroskop. Noen cellerester og døde celler vil bli observert i media. Dette er normalt. Sug media fra retter og erstatte med 10 ml fersk Mesc medier.
- Fortsett å endre media på celler hver dag for å hindre differensiering.
- Passage cellene når 60-70% sammenflytende. Forbered celler for aging ved å aspirere media og skylling med 5 ml steril 1X DPBS uten MgCl2 og CaCl 2. Tilsett 2 ml 0,05% trypsin-EDTA løsning. Plasser i inkubator ved 37 C i 5 min.
- Mens celler ruger, forberede nye 10 cm tallerken ved å aspirere gelatin løsning og tilsette 10 ml RT Mesc medier. Etter 5 min sjekk cellene for løsrivelse. Hvis cellene er fortsatt festet, fortsette å ruge ved 37 C i 2 min om gangen til det er helt løsrevet.
- Slukk trypsin-EDTA ved å tilsette 3 ml Mesc medier. Overfør cellesuspensjonen til et 15 ml sentrifugerør og sentrifugering ved 200 xg i 5 minutter for å pelletere. Sug media fra pellet og re-suspendere i 10 ml Mesc medier.
- Avhengig av ønsket split ratio, tilsett 0,5-1,0 ml cellesuspensjon til hver parabolen utarbeidet i trinn 4.2.2). Sett fatet i kuvøse og fordele celler ved forsiktig å flytte tilbake til forsiden deretter fra side til side. Alleow celler for å feste O / N eller i minst 12 timer.
MERK: En splittet forhold på 1:10 til 1:20 er felles for de fleste Mesc linjer. Dette forholdet kan variere avhengig av linjen som brukes, passasje nummer, og ønsket løpet på den nye antenne. For en 01:10 split ratio overføring 1 ml cellesuspensjon inn i 9 ml Mesc media og plate i en nylaget gelatin-belagt 10 cm tallerken.
5. Utarbeidelse av embryoid Bodies
MERK: Alle trinn bortsett sentrifugering utføres i et sterilt vev kultur hette.
- Utarbeidelse av cellesuspensjon i EB Media
- Ved 70% konfluens (vanligvis 24-48 timer etter passasje), bruker cellene for EB formasjon. Forbered celler for EB formasjon ved å demontere og pelletering henhold til §§ 4.2.1) - 4.2.3).
Merk: (. F.eks svært lite celledød, ingen forurensning, riktig morfologi) Det er best å passasje cellene minst én gang etter tine og sjekk for helse og robust vekst (e.g., til populasjonsdoblinger forekommer hver 24-48 timer) før bruk for å lage EBS. - Re-suspendere pellet i 5 ml EB medier. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer eller automatisert celleteller.
- Fortynn cellesuspensjon i ønskede volum av EB media for å lage en sluttkonsentrasjon på 25 celler / ul (eller 2,5 x 10 3 celler / ml). Merk at hver lokket av en petriskål har ca 60 EBS og krever ca 1,3 ml cellesuspensjon. På dette trinnet, forberede tilstrekkelig volum cellesuspensjon å generere ønsket antall EBS. Hvis for eksempel 240 EBS er nødvendig for forsøket, forberede 5,2 ml på 2,5 x 10 3 celler / ml.
MERK: mESCs som ikke brukes for EB formasjon kan brukes for fremtidige eksperimenter ved å spinne ned, re-suspendering i Mesc media og platekledning som beskrevet i punkt 4.2.
- Ved 70% konfluens (vanligvis 24-48 timer etter passasje), bruker cellene for EB formasjon. Forbered celler for EB formasjon ved å demontere og pelletering henhold til §§ 4.2.1) - 4.2.3).
- Opprettelse av embryoid Bodies
- Fremstille sterile 10 cm bakterielle petriskåler for opphenging dråpedannelse ved tilsetning av 2 ml av 1 x PBS til bunnen av each.
- Overfør EB suspensjon fra trinn 5.1) til en steril løsning bassenget.
- Fjerne lokket fra klargjort petriskål og omhyggelig avsette seksti, 20 pl dråper av EB suspensjon på den indre overflate. Oppnå dette effektivt ved hjelp av en flerkanals pipette utstyrt med 6 tips. Hver 20 ul dråpe har nå 500 celler.
- Forsiktig erstatte lokket på nedre halvdel av bakteriell petriskål, være forsiktig med å løsne hengende dråper. Plasser retter inn i cellekulturinkubator ved 37˚ C. Etter 2 dager ble cellene er klare til å vaske ned som beskrevet i 5.3).
- Vask ned av embryoid Bodies
Merk: Alle vaske ned trinnene er utført i et sterilt vev kultur hette.- Etter 2 dager EB-er er klar for vask ned og overføre til 6 cm bakterielle petriskåler. Pre-varme 3 ml EB media per petriskål til RT. Hver 6 cm bakteriell petriskål effektivt kan holde 2 lokk verdt hengende dråper.
Merk: Sørg for å bruke en ikke-belagt petriskål feller dette trinn (se materialer tabell). Ikke bruk en vev kultur parabol eller annen overflate som oppmuntrer celle adhesjon. EBS bør forbli suspendert i media før du er klar til å bli belagt som beskrevet i kapittel 6. - Fjern 10 cm petriskåler fra inkubatoren og fyll i sterilt vev kultur hette. Fjern forsiktig lokket med EBS og vippe i en 45 graders vinkel.
- Ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette inneholder 3 ml RT EB media, vask forsiktig EBS i et basseng i bunnen av lokket. inspisere nøye lokket for EBS som sitter fast til overflaten og re-skyll om nødvendig.
- Etter vask alle EBS overføring til en 6 cm petriskål.
- Gjenta trinn 5.3.2) -5.3.4) for alle EBS. Hver 6 cm petriskål bør inneholde EBS fra to 10 cm lokk. Legg alle rettene tilbake i inkubator ved 37 ˚C i to dager.
MERK: EBS som er for nær hverandre i suspensjon kan holde sammen og danne store aggregater. Dette kan negativt påvirke hjerte differensiering effektivitetsamt redusere antall tilgjengelige EBS. For å forhindre aggregering, bør EBS kontrolleres hver dag og separert ved forsiktig bevegelse frem og tilbake, for deretter sideveis. Bruken av bakterie retter i den tidlige differensieringstrinn er nødvendig for å hindre EB feste til fatet og tillate EBS for å vokse i suspensjon.
- Etter 2 dager EB-er er klar for vask ned og overføre til 6 cm bakterielle petriskåler. Pre-varme 3 ml EB media per petriskål til RT. Hver 6 cm bakteriell petriskål effektivt kan holde 2 lokk verdt hengende dråper.
6. Plating og behandling av EBS Med Grem2
- Forbered Grem2 behandlingsmediet ved tilsetning av et tilstrekkelig volum av lager (0,5 ug / ul) Grem2 til RT EB medium for en endelig fortynning på 1-5 ug / ml.
MERK: effektiv konsentrasjon for behandling av EBS varierer avhengig av cellelinjen og spesifikk aktivitet av den aktuelle masse Grem2. Det anbefales at før bruk dosen titreres for å finne maksimal effektivitet. For CGR8 Mesc linjen vi bruker rutinemessig 3-5 ng / ml Grem2. Effektive konsentrasjoner av Grem2 for atrial myocyte generasjon vil produsere raskt kontrahering celler mellomdager 7-8 som er utbredt i hele hver brønn. Dersom oppdrags fenotype ikke er observert i behandlede kulturer er det anbefalt at Grem2 dosen titreres innenfor området som indikeres. - Fremstille seks-brønners vevkulturplater ved å aspirere gelatinbelegg løsning fra hver brønn og tilsetning av 2 ml RT Grem2 behandling media. Fjern EBS fra inkubatoren og fyll i sterilt vev kultur hette.
- Ved hjelp av en P1000 satt til 100 ul overførings 30 EBS fra 6 cm petriskåler til hver brønn. Plasser EBS i kuvøse og jevnt spre ved å forsiktig flytte plate tilbake til forsiden deretter fra side til side.
- Etter EBS har festet til gelatin belagt brønner, erstatte Grem2 media annenhver dag til dag 10. Etter dag 10, avbryte Grem2 behandling og legge friske EB media annenhver dag for å opprettholde sunne celler.
MERK: Når du har festet, vil EBS flate ut langs overflaten av den belagte platen.
- Etter EBS har festet til gelatin belagt brønner, erstatte Grem2 media annenhver dag til dag 10. Etter dag 10, avbryte Grem2 behandling og legge friske EB media annenhver dag for å opprettholde sunne celler.
7. celledissosiasjon for RT-qPCR Analysis
- Celledissosiasjon med Trypsin-EDTA
- Sug media fra hver brønn og skyll to ganger med 1 ml per brønn sterilt DPBS minus Ca 2+ og Mg 2+.
- Tilsett 0,5 ml 0,25% steril Trypsin-EDTA-løsning til hver brønn fra hvilken cellene vil bli oppsamlet.
- Plasser platen i inkubator ved 37 C i 5 min.
- Etter 5 min sjekk celler for dissosiasjon. Hvis cellene fortsatt forbli festet til bunnen av brønnen trykk forsiktig for å løsne. Hvis tapping ikke løsne cellene, plassere tilbake i kuvøse og overvåke hvert 2 min før cellene er helt løsrevet.
- Nøytralisere Trypsin-EDTA-løsning ved tilsetning av 0,5 ml EB media til hver brønn.
- Overfør hele 1 ml cellesuspensjon til et 1,5 ml mikro- sentrifugerør.
- Pellet-celler ved å spinne i en bordsentrifuge i 5 minutter ved 300 x g.
- Sug media fra pellet og gå videre til lyse umiddelbart eller butikk pellet ved -70 ° C til de er klare for lyse. Long-term lagring av pellets er ikke anbefalt da dette kan føre til degradering av RNA.
- Cell Lysis og molekylær analyse
- På dette punktet cellene er klare for RNA-isolering ved hjelp av et kommersielt kit kolonne ekstraksjon eller ved hjelp av RNA-ekstraksjon reagens i henhold til protokollene som leveres av produsenten (se tabell av materialer). Når isolert, revers transkribert RNA og bruk cDNA for RT-qPCR-analyse ved bruk av standardteknikker 20, 21.
MERK: Primere som brukes av denne lab for RT-qPCR er oppført i Tabell 1. atrial identitet bekreftes ved hjelp av en kombinasjon av RT-qPCR å se på uttrykket av atrial og ventrikulære gener og elektrofysiologi til posten aksjonspotensialer (se kapittel 8). Et utvalg av gener er inkludert i denne protokollen som et eksempel på pålitelige atrial og ventrikulære markører. Ytterligere informasjon om atrial og ventrikulær genekspresjon i sammenheng med pluripotent stamcelle differensiering finnes i referanse 14. </ Li>
- På dette punktet cellene er klare for RNA-isolering ved hjelp av et kommersielt kit kolonne ekstraksjon eller ved hjelp av RNA-ekstraksjon reagens i henhold til protokollene som leveres av produsenten (se tabell av materialer). Når isolert, revers transkribert RNA og bruk cDNA for RT-qPCR-analyse ved bruk av standardteknikker 20, 21.
8. Elektro Analysis
- Celledissosiasjon med Collage
- Sug media fra hver brønn og skyll to ganger med 1 ml per brønn steril PBS.
- Tilsett 0,5 ml av 1 mg / ml kollagenase-løsning til hver brønn.
- Plassere platen i inkubator ved 37 ° C i 10 min.
- Etter 5 min sjekk celler for dissosiasjon. Hvis cellene fortsatt forbli festet til hverandre eller i bunnen av brønnen trykk forsiktig for å løsne. Videre distansere cellene ved forsiktig gniing med en P1000.
MERK: For å forenkle patch clamp opptak celler bør gnidd inntil en encellet suspensjon er oppnådd. - Tilsett 0,5 ml EB media til hver brønn og blandes ved pipettering.
- Overfør hele 1 ml cellesuspensjon til et 1,5 ml mikro- sentrifugerør.
- Pellet-celler ved å spinne i en bordsentrifuge i 5 minutter ved 300 x g.
- Sug media fra celle pellets.
- Re-suspendere celler i 500mL PBS med 10% FBS, være sikker på å triturer til en enkelt celle suspensjon.
- Elektro Karakterisering.
MERK: Mange gode protokoller har blitt publisert i dette tidsskriftet om bruk enkelt celle patch clamp til å måle cellemembran potensialer. For detaljert informasjon om hvordan du utfører enkelt celle patch klemme nybegynner leseren blir referert til disse protokollene 21-24. Følgende inneholder spesifikk informasjon for denne protokollen som vil hjelpe den erfarne elektrofysiolog forberede og håndtere Mesc avledet CMS for subtype karakterisering.- Fremstille intracellulært opptak oppløsning sammensatt av følgende: 10 mM HEPES-buffer, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mM kaliumglutamat, 10 mM KCl og 10 mM NaCl. Justere oppløsningen til en pH-verdi på 7,2 ved hjelp av NaOH.
- Forbered ekstracellulære opptak (bad) oppløsning sammensatt av de følgende: 2 mM HEPES, 10 mM glukose, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5,4 mM KCI, og 137mM NaCl. Justere oppløsningen til en pH-verdi på 7,4 ved hjelp av NaOH.
- Forbered et glass pipette som måler 2-5 Megohm motstand når fylt med opptaksløsning ved bruk av standard borsilikatglass med glødetråd.
- Overføring 100 mL av suspenderte celler i opptaket kammeret inneholder ekstracellulære opptak løsning ved hjelp av en P200.
MERK: Celler kan lappes i suspensjon eller, for å lette håndtering og bruk for behandling og / eller perfusjon analyser, kan bli sådd ut på en gelatin-belagte dekkglass som beskrevet i 8.2.5). - Fremstille gelatin belagte dekkglass ved å plassere en 10 mm diameter dekkglass i hver brønn av en 6-brønns plate og kjørt med gelatinoppløsning, som beskrevet i avsnitt 3.1) på denne protokollen.
- Etter minst 30 minutter aspirate gelatinoppløsning og tilsett 100 pl av suspenderte celler direkte til dekkglass og plassere hele seks-brønns plate inn i inkubator i minst 2 timer eller inntil cellene er festet. Etter celler har festet, rEDra dekkglass og plasser i innspillingen kammer med ekstracellulære opptak løsning.
MERK: Hvis du bruker αMHC-DsRed fluorescerende hjerte reporter Mesc linje, kan CMs bli identifisert med sine røde fluorescerende kjerner. Hvis du ikke bruker en hjerte reporter linje, kan spontant kontrahering celler observeres og isolert for målinger. Pluripotente stamceller hentet CMS er vanligvis mindre og mer avrundet, mangler den karakteristiske rektangulære morfologi fullt dannet voksne hjertemuskelceller.
- Etter minst 30 minutter aspirate gelatinoppløsning og tilsett 100 pl av suspenderte celler direkte til dekkglass og plassere hele seks-brønns plate inn i inkubator i minst 2 timer eller inntil cellene er festet. Etter celler har festet, rEDra dekkglass og plasser i innspillingen kammer med ekstracellulære opptak løsning.
- Gjør alle opptak ved 37 ˚C. Patch enkeltceller ved hjelp av hele cellen klemme i dagens-klemme-modus med en borsilikatglass pipette av 2-5 Megohm motstand. Bruk milde negative press for å oppnå gigaohm segl før å få hele cellen tilgang. Påfør rask undertrykk til å sprekke membran og få hele cellen tilgang før innspillingen membranpotensialer.
- Fremkalle aksjonspotensialer ved hjelp av 4 ms depolariserende aktuelle injeksjoner.
NOTAT:For PSC-avledet CMs mengden av strøm som kreves for å utløse reproduserbart aksjonspotensialer kan variere. For å finne en optimal terskelstrøm, begynner ved en forholdsvis lav strøm og øker utløser strømamplitude på en trinnvis måte inntil reproduserbare aksjonspotensialer oppnådd.
MERK: Handling potensielle varighet for Grem2-indusert atrial muskelceller er vanligvis i størrelsesorden 20-40 ms og mangler en platåfasen (figur 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før differensiering, bør pluripotente stamceller være kompakt og fri for spontan differensiering. Cellene er vist i figur 1A er klar til å bli singularized og brukes til å henge dråper som beskrevet i 5.1 i protokollen delen. Cellene er vist på figur 1B er spontant differensiere og bør ikke brukes for fremstilling av hengende dråper.
Panelene er inkludert i Figur 2 viser en vellykket dannet EBS ved differensiering dag 2 Kvalitet EBS vanligvis danne best innenfor jevnt fordelt, synker vel avrundet hengende som vist i figur 2. Ved differensiering dag 2, bør EBS være synlig for det blotte øye som sfæriske ordninger differensiere stamceller på tuppen av de hengende dråper (figur 2). Disse EBS er klar for vask ned som beskrevet i 5.3 i protokollen delen.
I løpet av dagene 2-4, bør vaskes ned EBS i suspensjonen fortsetter å vokse i størrelse. På dag 4, bør velformet EBS være frittflytende og homogent i størrelse og form (figur 3). EBS er vist i figur 3 er klar til å overføres til pre-belagte plater og behandlet med Grem2 som beskrevet i 6.1 til 6.3 i protokollen delen.
Når belagt, bør EBS flate som celler migrerer ut fra EB på overflaten av vevskulturplaten. Vist i figur 4 er eksempler på ordentlig festet EBS på differensiering dager 8 (venstre panel) og 10 (panel høyre). Celler bør fortsette å bli overvåket daglig for å være sikker på at de fortsatt festet og for å se etter hjertestans differensiering som beskrevet nedenfor.
Kontrahering celler, noe som indikerer tilstedeværelse av CMs, kan observeres så tidlig som dag6 og så sent som i dag 9. Typisk vil kontrahering cellene være tilstede på dag 8 av differensiering. Tallene for å pådra celler i hver brønn bør fortsette å øke gjennom differensiering dag 14. I ubehandlet kontrollbrønner små, sakte kontrahering patcher er observert (Video S1) mens i Grem2 behandlet brønner store flekker med en relativt rask entreprenør hastighet er vanlige ( video S2). Av og til svikter hjerte differensiering å oppstå. I slike tilfeller vil tidspunktet for Grem2 behandling, aktivitet av protein, og tilstanden til cellene før differensiering bør revurderes for å være sikker på at hver av disse forholdene er optimalisert som beskrevet i denne protokollen (se diskusjon).
Figur 5 viser resultatene typisk av Grem2-behandlede kulturer og ubehandlede kontroller. RT-qPCR-analyse av genekspresjon i celler oppsamlet og lysert som beskrevet i 7.1 til 7.2 i protokollen seksjon typisk avsløre høy levels av hjerte strukturelle og regulatoriske gener i Grem2-behandlede kulturer (figur 5A). Dersom αMHC-DsRed-Nuc cellelinjen er i bruk, kan den økte utbyttet av CMs observeres visuelt som et høyere antall DsRed-merkede kjerner i Grem2-behandlede brønner (figur 5B, nedre panel).
I tillegg til å generere et økt antall CMS, Grem2 behandling presser også differensiering mot en atrial som fenotype. Atrial fenotypen blir vanligvis bekreftet i to måter. Først RT-qPCR analyse av celler samles som beskrevet i 7.1 til 7.2 i protokollen delen skal avsløre at gener som er karakteristiske for atrial CMS oppregulert mens ventrikulære genene er nedregulert (Figur 6A). For det andre, patch clamp målinger av cellevirkningspotensialvarigheten (som beskrevet i 8.1 til 8.2 i protokollen seksjon) viser at en kort, atrial-lignende virkningspotensialet fremherskende blant Grem2 treate d celler (Figur 6B).
Figur 1. Representative mus embryonale stamceller (mESCs). Pluripotent mus embryonale stamceller før dannelse med karakteristisk stor kjerne, kompakt kolonidannende morfologi (A, svarte piler), og hvite fase grenser (A, oransje piler) EB. Spontan differensiering av mus ES-celler er angitt med større, enkeltceller separert fra kolonier (B, svarte piler) og tap av fase ramme rundt kolonier (svart, oransje pil). Bilder tatt med en omvendt fase kontrast mikroskop. Skala barer representerer 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. embryoid organer (EBS) på dag 2 av differensiering. Hengende dråper suspendert fra en petriskål lokk (til venstre, er målestokken 2 cm) er jevnt fordelt og homogen i størrelse. EBS i hengende dråper er observert så kompakte kuler i midten av hver dråpe (høyre, er målestokken 1 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. EBS i suspensjon på dag 4 av differensiering. Ideelt EBS bør være homogene i størrelse og form med minimal tilslutning til hverandre eller i bunnen av platen. Bilder ble tatt med en dissekere omfang under sterile forhold. Scale bar representerer 100 mikrometer.belastning / 53919 / 53919fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Typisk EB morfologi etter plating. Plated EBS på dager 8 (til venstre) og 10 (til høyre) av differensiering. Som EBS feste til gelatinerte plater, de flate ut og vises som tette sentre omgitt av en stadig mer sammenflytende monolag av celler. Små lommer for å pådra celler er generelt observert rundt differensierings dager 6-8 nær sentrum av den EB. Disse lommene fortsette å ekspandere gjennom differensiering protokollen for å danne større ark for å pådra celler i de omkringliggende monolagene. Bilder tatt med en omvendt fase kontrast mikroskop og. Skala barer representerer 200 mikrometer. Klikk her for å se et større versjon av denne figuren.
Figur 5. Hjerte differensiering i Grem2-behandlede og ikke-behandlede kontrollbrønnene. QPCR-analyse av hjertemarkører indikerer en økning i kardial genekspresjon i EBS behandlet med Grem2 så tidlig som dag seks, og fortsatte til og med dag 10 av differensiering (A). Den konstruerte αMHC-DsRed-Nuc cellelinje viser store forekomster av DsRed-merket CMS kulturer behandlet med Grem2 (B, nederst) vs. ikke-behandlede kontroller (B, øverst). Tall tilpasset med tillatelse fra 14. Feilfelt representerer SEM fra minst 3 gjentatte eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6 "src =" / files / ftp_upload / 53919 / 53919fig6.jpg "/>
Figur 6. Karakterisering av atrial-lignende hjerte fenotype. QPCR-analyse indikerer en økning i ekspresjon av gener atriale og nedregulering av gener assosiert med ventrikulære CMs i Grem2-behandlede prøver (A). Kontrollkulturer produsere CMs med varigheten av aksjonspotensialet er karakteristisk for atriale og ventrikulære celler, mens behandling med Grem2 genererer cellepopulasjoner med den korte virkningspotensialvarigheten egenskap ved atrielle myocytter (B). Prøvene ble sammenlignet ved bruk av Student t-test. * P <0,05; *** P <0,001 Tall tilpasset med tillatelse fra 14. Feilfelt representerer SEM fra minst 3 gjentatte eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video S1. Ubehandlet kontrollbrønner (Høyreklikk for å laste ned). Liten, sakte-entreprenør lommer eller lapper av hjertemuskelceller rundt periferien av EB (hvite piler). Videoen ble tatt på differensiering dag 10.
Video S2. Grem2-behandlede brønner (Høyreklikk for å laste ned) . Typiske resultater observert i Grem2-behandlede celler. Store flekker av raskt entreprenør cellene er observert i hele belagt EB. Videoen ble tatt på differensiering dag 10.
| Gene | | Revers Primer (5 'til 3') | |
| Actin | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| Gata4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| Gja1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| Gja5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| Myh6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| Tnnt2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
Tabell 1. Liste over qPCR primer sekvenser. Primer sekvenser er listet alfabetisk etter genet navn. Sekvenser er gitt 5 'til 3' for alle genene er analysert i figurene 5 og 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir rutinemessig kulturer med en høy andel av CMS som er karakteristisk for atrial avstamning. Som med alle differensiering protokollen, må kvaliteten på mESCs før differensiering bli gitt spesiell oppmerksomhet. mESCs bør rutinemessig kontrolleres for riktig morfologi (figur 1A). Enhver spontan differensiering som inntreffer før dannelsen av EBS vil sterkt begrense effektiviteten av cardiogenesis og bør fjernes før aging (figur 1B). EB størrelse påvirker også cardiogenesis. Starter celle tall mellom 200 og 1000 per EB har blitt testet og 500 celler per EB rutinemessig gir høyest antall CMS. Celler som passeres av dagen før EB formasjonen også har en tendens til å skille mer effektivt.
Den "henger drop" metoden brukes til å generere EBS i denne protokollen 25. Andre fremgangsmåter for fremstilling av EBS anvendes for hjerte differensiering hektarhar blitt rapportert 26-29. Den "henger drop" metoden er enkel og billig, lett vedtatt i noen laboratorium med felles cellekultur utstyr og materialer, og kan gjennomføres av alle med cellekultur erfaring. Det er også allsidig, produsere EBS som lett kan manipuleres, overføres, belagt, eller innhentet for RNA-analyser i henhold til behovene til etterforskerne. Det er også skalerbar, produsere små eller store antall EBS etter behov.
Protokollen dikterer plating av EBS på gelatin belagte plater på dag 4 av differensiering. Dette trinnet omdanner differensiere EBS til de mer typiske monoformat som er felles for vev kultur. I noen tilfeller kan det være mer praktisk og eller nødvendig å la de EBS i suspensjon i stedet for platekledning. Hvis henge EBS er foretrukket for nedstrøms applikasjoner cellene kan bli stående i suspensjon gjennom differensiering prosessen i stedet for å være belagt på dag 4. Ved behandling av viddh Grem2 blir EBS plasseres i 1,5 ml sentrifugerør og får sedimentere av tyngdekraften. Mediet blir deretter forsiktig fjernet med en P1000, og etterlater en liten mengde bak for å forebygge aspirasjon av EBS, og 1,5 ml Grem2 media blir tilsatt til røret. Denne suspensjonen blir deretter overført til en 6 cm petriskål og plassert tilbake ved 37 ° C. Mediene endres med mikrosentrifugerøret metode angitt ovenfor annenhver dag.
Differensiering dag 4 ble valgt for behandling av celler med Grem2 basert på ekspresjon analyse av gener som vanligvis er forbundet med store utviklingshendelser. Tilsetning av Grem2 etter topp ekspresjon av markørgener gastrulation T Brachyury og Cerberus som 1 og ved angrep av ekspresjon av hjertestamcellemarkører slik som Nkx2-5 er kritisk for både cardiogenesis og atrial spesifikasjon. På grunn peak ekspresjon av disse genene, kan variere noe mellom cellelinjer er det anbefalt å overvåke ekspresjon av disse genene i løpet av differentiation å bestemme optimal timing for Grem2 tillegg. Av de linjene som ble testet for denne protokollen, mest responderte på behandling med Grem2 mellom dag 4 og 5 av differensiering.
Som med en hvilken som helst rekombinant protein, aktiviteten av Grem2 varierer fra parti til parti. Det anbefales derfor at Grem2 fra samme parti brukes for hvert sett av eksperimenter for å opprettholde konsistens. Når et nytt parti er kjøpt, kan effekten bli vurdert ved å titrere dosen i området på 1-5 ug / ml. Denne protokollen gir CMS fra atrial avstamning av tilstrekkelig antall for analyse og kultur. Celler fremstilt ved bruk av denne protokollen kan analyseres via flowcytometri, elektrofysiologi, RT-qPCR, eller re-dyrket for anvendelse i levende celleanalyser. For å lette identifisering og isolering av CMs etter kultur αMHC-DsRed-Nuc reporter linjen er utviklet og blir rutinemessig brukt av vårt laboratorium.
Denne protokollen bruker serum for å opprettholde en sunn cell kulturer gjennom differensiering prosessen. Selv om denne protokollen rutinemessig frembringer robuste, atrial-lignende hjerte differensiering, bruk av serum innfører en udefinert element til differensieringsprosessen. Dette kan begrense nytten av protokollen i tilfeller hvor en mer definert media er nødvendig. Hvis en mer definert media forberedelse er nødvendig, kan serum erstattes av KnockOut Serum Replacement 30. Når du bytter til en definert kultur media anbefales det at timing og konsentrasjon av Grem2 behandling bli re-optimalisert som allerede er beskrevet i denne delen.
RT-qPCR brukes til å kvantifisere ekspresjon av gener som er spesifikke for atriale og ventrikulære myocytter. Grem2 behandling fører til en induksjon av atrial spesifikke gener mens ned regulering eller ikke påvirker uttrykket av ventrikulære gener. Dette resultatet er typisk for Grem2-induserte CMs. En foreslått sett av gener for å vurdere atrial identitet er inkludert i denne protokollen. En utvidet sett av genets og en diskusjon av deres relevans kan bli funnet i verk refereres av denne protokollen 14,16. Som feltet fortsetter å utvikle seg, og vår forståelse av hjertestans differensiering forbedrer anbefales det at denne listen over atrial og ventrikulære identitetsmarkører er vurdert og revidert etter behov.
Genererer homogene kulturer av CMS vil lette kliniske forskningsinnsats rettet mot sykdommer kjent for å påvirke spesifikke hjerte subtyper og gi et modellsystem for grunnleggende forskning fokusert på å forstå mekanismene for kammer spesifikasjon i virveldyr hjerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd HL083958 og HL100398 (AKH) og 2T32HL007411-33 "Program i Hjerte- Mekanismer: Trening i Investigation" (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
