Abstract
다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포 집단을 생성하기위한 프로토콜이 개발되었지만, 이들은 일반적으로 혼합 된 세포 표현형을 얻었다. 특정 심근 세포 아형을 포함하는 연구를 추구에 관심 연구진은보다 감독 차별화 접근법을 필요로한다. Grem2 생체 내 심방 실 형성에 필요한 분비 BMP 길항제와 마우스 배아 줄기 (ES) 세포를 처리하여, 심방 심장 세포 표현형 다수 생성 할 수있다. 설계 Myh6-을 DsRed-NUC 능성 줄기 세포주를 사용 식별, 선택 및 심근 정화용 수있다. 이 프로토콜에서 배아 체는 매달려 드롭 방법을 사용하여 Myh6-을 DsRed-NUC 세포에서 생성 및 분화 날 4 (D4)까지 정지 유지하고 있습니다. 셀 D4에 Grem2로 처리 젤라틴 코팅 된 플레이트 상에 도금. D8-D10 큰 계약 지역 문화에서 관찰 및 확장을 계속하고 m되는 사이D14을 통해 ature. 분자는 조직 학적 및 electrophysiogical 분석 Grem2 처리 한 세포에서 세포가 심방 심근의 생물학 및 다양한 약리 에이전트에 대한 반응을 연구하기 위해 체외 모델을 제공 심방과 같은 특성을 획득 나타냅니다.
Introduction
다 능성 줄기 세포를 생성하고, 특히 인간 1-5에서는 기초 연구 및 비 임상 연구에 대한 액세스 조직에 어려운 호스트로부터 세포를 연구하기위한 강력한 도구이다. 발달 신호 경로를 적절히 조절하여 원하는 표현형 운명 다 능성 줄기 세포의 분화를 유도 할 수있다. 대부분의 프로토콜은 다 능성 줄기 세포로부터 심근 6-14 (CMS)를 생성하기 위해 개발되었다. 이러한 프로토콜은 일반적으로 TFGβ 수퍼 패밀리 (티빈, BMP, 및 TGFβ)과의 Wnt 외생 적 성장 인자 및 / 또는 작은 분자 10,12-15의 시간 제한 추가를 통해 경로의 변조를 포함한다. 이러한 프로토콜은 CMS에가 세포의 비율을 증가 시키는데 일반적으로 효과적이지만, 심방, 심실 및 노드 / 전도 시스템의 계통을 나타내는 세포의 혼합 집단을 생성 특이성이 부족하다. 특정 심장을 연구하기 위해 더 많은 지시 차별화 아프로을 아류ACH가 필요합니다.
Gremlin2 (단 짧은에 대한 켈베로스 또는 PRDC 관련 Grem2라고도 단백질) 제브라 피쉬 (16)의 심장 개발하는 동안 적절한 심장 차별화와 심방 실 형성에 필요한 분비 BMP 길항제이다. 단지 중배엽 마커 T-Brachyury 1 등 켈베로스의 피크 식 후, 분화 4 일에 Grem2와 차별화 된 배아 줄기 세포 치료,의 CM의 수율을 증가시키고 주로 심방 혈통 (14)의 세포의 풀을 생성합니다.
재조합 Grem2는 분화 세포를 치료하는 데 사용되는 표준 단백질 생산 기술 (17)을 사용하여 제조 될 수 있거나 또는 시중에서 구입할 수있다. 이 수용액에 용해되는 고도로 원하는 시점에서 배양 물에 외생 첨가 될 수있다.
차별화 마커 담당자의 발현을 정량 RT-qPCR에를 사용하여 추적 할 수 있습니다심장 혈관 전구 세포, 심장 전구 세포, 그리고 헌신의 CM의. 면역은 식별 심장 세포 유형의 공간 분포를 가시화 할 수있다.
식별 CMS에 분리 리포터 시스템을 사용하는 경우에 순수 집단을 필요로하는 응용 프로그램은 더 용이하게 수행된다. 이를 위해, 우리는 αMHC-DsRedNuc 마우스 CGR8 ES 세포주 (14)로 구성 도입했다. CGR8 세포 확장 및 분화 검정 (18)을 용이하게 성장 피더 세포 능성없이 남아있다. ES 세포주는 유전자 프로모터 (MHC 또는 Myh6 α) 심장 관련 알파 마이 오신 무거운 체인에서 핵 지역화 신호을 DsRed 형광 단백질 코딩 서열이 포함되어 있습니다. 이들 세포를 사용하여, CMS는 쉽게 식별 및 정량화 셀 정렬 전기 생리학, 약물 스크린, 심방 분화 기전을 연구 단리 할 수있다.
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Protocol
세포 배양 미디어, 솔루션 및 시약 1. 준비.
- 마우스 배아 줄기 세포를 500 ㎖ (MESC) 혼합 및 살균 여과 (0.2 ㎛의 공극 크기) 445 ml의 글래스 최소 필수 중간 (GMEM), 50 ㎖의 열 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS)에 의해 용지를 준비 5 ㎖ 100X는 L- 집중 ml의 당 1 × 10 7 단위 및 1.43 μL의 ß-머 캅토 에탄올 (최종 농도가 50 μM입니다)에서 글루타민 교체, 5 ㎕를 재조합 마우스 백혈병 억제 인자 (LIF). 사용할 준비가 될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오.
- 혼합 및 무균 여과하여 391 ml의 배아 바디 (EB) 분화 배지 500 ml를 준비 Iscove 개변 둘 베코 중간 (IMDM), FBS를 비활성화 100㎖의 열, 5 ㎖ (100X)가 L 글루타민 교체 농축 5 ㎖ 100X 비 필수 아미노산을 농축하여 (NEAA), 및 2.86 μl를 ß-머 캅토 에탄올 (최종 농도 100 μM)입니다. 준비가 될 때까지 4˚ C에서 보관 사용하기.
- w 0.2 % 준비여과하고 500 mL를 1g 돼지 피부 젤라틴 분말을 혼합하여 젤라틴 / V 수용액, 증류수 H 2 O. 고압 증기 멸균에 의해 소독. 젤라틴은 실온에서 물에 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. 젤라틴을 고온 가압 멸균 한 후 완전히 용해되어야한다. 사용할 준비가 될 때까지 실온에서 보관하십시오.
- 0.5 μg의 / μL 원액을 0.1 % BSA로 보충 된 100 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS)에서 동결 건조 Grem2 50 μg의 펠렛을 용해 Grem2 재조합 단백질 분취 액을 준비한다. 준비가 될 때까지의 -80˚ C 나누어지는 다섯 멸균 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에이 원액 20 μL 및 저장소를 사용합니다.
- 10 배 재고 한 출판 프로토콜 또는 구매에 따른 PBS를 준비하고 희석 19 일 1X을 여과, 증류 H 2 O로 1:10 희석. 사용 전에 오토 클레이브에 의해 멸균 PBS. 사용할 준비가 될 때까지 실온에서 보관하십시오. 일부 단계에서 사용되는 2 + 칼슘과 마그네슘없이 DPBS. 이 폴리 우레탄입니다1X 솔루션으로 rchased. 주문 정보 시약의 테이블에 포함되어있다.
젤라틴 2. 준비 10cm 조직 문화 요리를 코팅
- 멸균 조직 문화 후드에 코팅 각 10cm 조직 배양 접시에 0.2 % 젤라틴 용액 5 ㎖를 추가합니다. 적어도 30 분 동안 4 일까지 37 ℃에서 인큐베이터에 넣어 요리.
젤라틴 3. 6- 웰 조직 배양 플레이트를 코팅
- 멸균 조직 배양 후드에서 6- 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 0.2 % 젤라틴 1 ㎖를 추가한다. 적어도 30 분 동안 4 일까지 37 ℃에서 인큐베이터에 넣어 판.
4. 배아 줄기 세포 배양
- 해동 mESCs
- 멸균 조직 문화 후드에서 실온으로 가온하여 MESC 미디어를 준비합니다. 젤라틴 코팅 10cm 접시에 10 ml의 RT 매체를 추가합니다.
- 약 1 × 10 6 세포를 포함하는 mESCs의 1 병을 제거cryostorage. 37 ℃의 수욕 집게, 장소 cryovial 들고. 세포 현탁액을 해동하고 단지 작은 아이스 결정은 병의 중심에 유지 될 때까지 조심스럽게 소용돌이 친다. 와 유리 병을 건조 일회용 보풀이없는 닦아 70 % EtOH로 소독.
- 무균 조직 배양 후드에서 cryovial에서 P1000 팁을 사용하여 해동 세포를 제거하고 4.1.1에서 제조 10cm 접시)에 전송할 수 있습니다.
- 부드럽게 백업 할 판 앞을 이동하여 세포를 배포 균등하게 5 % CO 2와 37 ℃ 가습 세포 배양 인큐베이터에 10cm 접시를 놓고, 다음 좌우로. 세포는 O / N을 도금 또는 적어도 6 시간에 첨부 할 수 있습니다.
- 우선 밝은 필드 현미경을 사용하여 부착 다음날 아침 체크 세포. 일부 세포 파편과 죽은 세포는 미디어에서 관찰됩니다. 이것은 정상입니다. 요리에서 대기음 미디어 및 10 ml의 신선한 MESC 미디어로 교체합니다.
- 차별을 방지하기 위해 매일 세포에서 미디어를 변경하는 것을 계속한다.
- 통로 셀 때 60-70% 합류. 미디어 흡입과의 MgCl 2, CaCl2를하지 않고 5 ml의 멸균 1X DPBS로 세척하여 계대에 대한 세포를 준비합니다. 2 ml의 0.05 % 트립신 EDTA 솔루션을 추가합니다. 5 분 동안 37 ℃에서 인큐베이터에 놓습니다.
- 세포가 배양되는 동안, 젤라틴 용액을 흡입하고 RT MESC 미디어 10 ㎖를 추가하여 새로운 10cm 요리를 준비합니다. 5 분 후 분리에 대한 세포를 확인합니다. 세포가 부착 된 상태를 유지하는 경우, 완전히 분리 될 때까지 한 번에 2 분 동안 37 ℃에서 배양하는 것을 계속한다.
- MESC 배지 3 ㎖을 첨가함으로써 트립신 EDTA 담금질. 펠렛하기 위해 5 분 동안 200 XG에 15 ml의 원심 분리기 튜브와 스핀에 세포 현탁액을 전송합니다. 펠렛에서 대기음 미디어 및 10 ml의 MESC 미디어에서 일시 중지 다시.
- 원하는 분할 비율에 따라, 단계 4.2.2에서 제조 된 각각의 접시)에 세포 현탁액의 0.5-1.0 ml에 추가 할 수 있습니다. 부드럽게 한 다음 앞으로 다시 좌우로 이동하여 세포를 배포 균일하게 인큐베이터에서 접시를 놓고. 모든유동 세포는 O / N 또는 적어도 12 시간 동안 부착합니다.
참고 : 1:10 분할 비율 - 1:20 대부분의 MESC 라인에 대한 일반적입니다. 이 비율은 새로운 접시 사용 라인 유로 수와 합류 소망에 따라 달라질 수있다. 갓 준비 젤라틴 코팅 10cm 접시에 1:10 분할 비 9 ml의 MESC 매체에 1 ml의 세포 현탁액의 전송 및 플레이트하십시오.
배아 기관의 5. 준비
참고 : 원심 분리를 제외한 모든 단계는 무균 조직 배양 후드에서 수행됩니다.
- EB 미디어의 세포 현탁액의 제조
- 70 % 컨 플루 (일반적으로 24 ~ 48 시간 후 - 유로)시, EB 형성 세포를 사용합니다. 4.2.3) - 분리 및 섹션 4.2.1)에 따라 펠렛으로 EB 형성 세포를 준비합니다.
참고 : (. 예를 들어, 아주 작은 세포 죽음, 아니 오염, 적절한 형태) 그것은 적어도 한 번 후 해동 통로 세포에 가장 적합하고 건강을 확인하고 강력한 성장 (전자.g., 이전의 모든 24 ~ 48 시간을 발생 인구의 분열은) 사채를 만들기 위해 사용합니다. - 5 ml의 EB 미디어에서 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계산합니다.
- / 25 μl의 세포 (2.5 × 103 세포 / ㎖)을 최종 농도를 만들기 위해 EB 매체의 필요한 부피의 세포 현탁액을 희석. 배양 접시의 각 뚜껑을 약 60 사채를 보유하고 세포 현탁액의 약 1.3 ml의가 필요합니다. 이 단계에서, 사채의 수를 생성하는 세포 현탁액의 충분한 양을 준비한다. 240 사채는 실험에 필요한 경우, 예를 들어, 2.5 × 103 세포 / ml에서 5.2 ml의 준비.
참고 : EB 형성에 사용되지 않는 mESCs이 MESC 미디어에서 다시 정지 및 4.2 절에 설명 된대로 도금, 회전 수를 줄여 미래의 실험에 사용 할 수 있습니다.
- 70 % 컨 플루 (일반적으로 24 ~ 48 시간 후 - 유로)시, EB 형성 세포를 사용합니다. 4.2.3) - 분리 및 섹션 4.2.1)에 따라 펠렛으로 EB 형성 세포를 준비합니다.
- 배아 기관의 창조
- 전자의 바닥에 1X PBS 2 ㎖를 첨가하여 살균 10cm에게 드롭 형성 매달려에 대한 세균 배양 - 요리를 준비ACH.
- 멸균 솔루션 유역에 단계 5.1에서 EB 서스펜션)를 전송합니다.
- 준비 페트리 접시에서 뚜껑을 제거하고 조심스럽게 내부 표면에 EB 서스펜션의 육십, 20 μl의 방울을 입금. 효율적 6 팁 장착 멀티 채널 피펫을 사용하여이를. 각 20 μL 강하는 지금 500 세포를 가지고있다.
- 부드럽게 방울 매달려 쫓아 않도록 조심하면서, 세균 배양 접시의 하단에 덮개를 교체합니다. 이일 후 37˚ ℃에서 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓고 세포) 5.3에 설명 된대로 아래로 씻어 준비가 된 것입니다.
- 배아 기관의 워시 다운
참고 : 모든 세척 다운 단계 멸균 조직 문화 후드에서 수행됩니다.- 이일 후 EB의 아래로 세척을위한 준비와 6cm 세균 배양 접시에 전송합니다. RT에 페트리 접시 당 EB 미디어의 사전 따뜻한 3 ㎖. 각 6cm 세균 배양 접시 효과적으로 방울 매달려의 가치가 2 뚜껑을 보유 할 수 있습니다.
주 : 비 코팅 된 배양 접시의 F를 사용하십시오또는이 단계 (재료 표 참조). 조직 배양 접시 또는 세포 부착을 장려 다른면을 사용하지 마십시오. 6 절에 설명 된대로 사채가 준비 될 때까지 미디어에 도금 할을 정지 상태로 유지해야합니다. - 인큐베이터에서 10cm 배양 접시를 제거하고 멸균 조직 문화 후드에 배치합니다. 조심스럽게 사채와 뚜껑을 제거하고 45도 각도로 기울이십시오.
- RT EB 배지 3 ㎖을 함유하는 5 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 조심스럽게 뚜껑의 하단 풀로 사채 씻는다. 조심스럽게 표면에 부착하고 필요한 경우-씻어 다시 EBS에 대한 뚜껑을 검사합니다.
- 6cm의 페트리 접시에 모든 사채 전송을 세척 한 후.
- 반복 모든 EBS에 대한) -5.3.4) 5.3.2 단계를 반복합니다. 각 6cm 페트리 접시 두 10cm 뚜껑에서 사채를 포함해야합니다. 두 개 더 일 동안 37 ℃에서 다시 인큐베이터로 모든 요리를 놓습니다.
참고 : 너무 정지에 가깝게된다 사채가 서로 달라 큰 응집체를 형성 할 수있다. 이는 부정적인 심장 분화 효율에 영향을 미칠 수뿐만 아니라 상당히 사용할 사채의 수를 감소시킨다. 응집을 방지하기 위해, 사채 매일 확인하고 부드럽게 앞뒤로 이동하여 구분해야합니다, 다음 좌우로. 초기 분화 단계에서 세균 접시를 사용 접시 EB 부착을 방지하고 사채 현탁액에서 성장하도록 허용 할 필요가있다.
- 이일 후 EB의 아래로 세척을위한 준비와 6cm 세균 배양 접시에 전송합니다. RT에 페트리 접시 당 EB 미디어의 사전 따뜻한 3 ㎖. 각 6cm 세균 배양 접시 효과적으로 방울 매달려의 가치가 2 뚜껑을 보유 할 수 있습니다.
Grem2와 사채 6. 도금 및 치료
- 1-5 μg의 / ㎖의 최종 희석 Grem2 RT EB 매체 재고 충분한 양 (0.5 μg의 / μL)을 첨가하여 Grem2 처리 매체를 준비한다.
주 : 사채의 치료 유효 농도는 세포주 및 Grem2 현재 많은 특정 활성에 따라 달라진다. 용량을 사용하기 전에이 최대 효과를 찾아 적정하는 것이 좋다. CGR8 MESC 라인을 위해 우리는 정기적으로 Grem2의 3-5 μg의 / ㎖를 사용합니다. 사이에 급속하게 수축 세포를 만들어 심방 심근 세포 생성을위한 Grem2의 유효 농도물론 각각의 전반에 걸쳐 널리 퍼져 일 7-8. 계약 표현형 치료 문화에서 관찰되지 않는 경우는 Grem2이 표시된 범위 내에서 적정 투여하는 것이 좋습니다. - 각 웰로부터 젤라틴 코팅 용액을 흡입하고 RT Grem2 처리 매체 2 ㎖를 첨가하여 6 웰 조직 배양 플레이트를 준비한다. 인큐베이터에서 사채를 제거하고 멸균 조직 문화 후드에 배치합니다.
- 각 웰에 6cm 배양 접시에서 100 μl를 전송 (30) 사채로 설정 P1000 사용. 장소 사채 인큐베이터에 균등는쪽으로 한 후 전면에 뒷면 플레이트를 이동 부드럽게하여 분산.
- 사채는 젤라틴 코팅 우물에 부착 한 후, 건강한 세포를 유지하기 위해 이틀 신선한 EB 미디어를 10 일 후 하루 10까지 Grem2 치료를 중단 이틀 Grem2 미디어를 교체하고 추가 할 수 있습니다.
참고 : 연결 한 후, 사채가 코팅 된 플레이트의 표면을 따라 평평합니다.
- 사채는 젤라틴 코팅 우물에 부착 한 후, 건강한 세포를 유지하기 위해 이틀 신선한 EB 미디어를 10 일 후 하루 10까지 Grem2 치료를 중단 이틀 Grem2 미디어를 교체하고 추가 할 수 있습니다.
RT-qPCR에 Analy 7. 세포 해리동생
- 트립신 - EDTA와 세포 해리
- 물론 각에서 대기음 매체와 무균 DPBS 마이너스 칼슘과 마그네슘 2+ 잘 당 1 ㎖로 두 번 씻어.
- 각 웰 세포가 수집됩니다있는 0.5 ml의 0.25 % 멸균 트립신 - EDTA 솔루션을 추가합니다.
- 5 분 동안 37 ℃에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 해리 5 분 체크 세포 후. 세포가 여전히 잘 탭의 하단에 부착 된 상태를 유지하면 부드럽게 풉니 다. 도청 세포를 풀고하지 않는 경우, 다시 인큐베이터에 배치하고 세포가 완전히 분리 될 때까지 매 2 분을 모니터링 할 수 있습니다.
- 각 웰에 0.5 ml의 EB 매체를 첨가함으로써 트립신 EDTA 용액을 중화.
- 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 1ml를 전체 전송.
- 300 X g에서 5 분 동안 탁상 원심 분리기의 회전에 의해 펠렛 세포.
- 대기음은 펠렛에서 미디어 및 용해에 대한 준비가 될 때까지 -70 ℃에서 즉시 용해 또는 저장 펠릿로 이동합니다. 장 터이 RNA의 저하로 이어질 수 펠릿 m 저장하지 않는 것이 좋습니다.
- 세포 용해 및 분자 분석
- 이때 세포는 (재료 표 참조) 상용 열 추출 키트를 사용하거나 제조사 공급 프로토콜에 따라 RNA 추출 시약을 이용하여 RNA를 분리를위한 준비가되어있다. 일단 격리, 전사 RNA를 반대하고, 21 표준 기술 (20)를 사용하여 RT-qPCR에 분석의 cDNA를 사용합니다.
참고 : RT-qPCR에 대해이 실험실에서 사용하는 프라이머는 표 1. 심방 정체성에 나와있는 레코드의 활동 전위 기간 (8 항 참조)에 심방과 심실 유전자의 발현 및 전기 생리학을보고 RT-qPCR에의 조합을 사용하여 확인할 수있다. 유전자의 선택은 안정적인 심방과 심실 마커의 예로서,이 프로토콜에 포함된다. 다 능성 줄기 세포의 분화의 맥락에서 심방과 심실의 유전자 발현에 대한 추가 정보는 기준 (14)에서 발견된다. </ 리>
- 이때 세포는 (재료 표 참조) 상용 열 추출 키트를 사용하거나 제조사 공급 프로토콜에 따라 RNA 추출 시약을 이용하여 RNA를 분리를위한 준비가되어있다. 일단 격리, 전사 RNA를 반대하고, 21 표준 기술 (20)를 사용하여 RT-qPCR에 분석의 cDNA를 사용합니다.
8. 전기 생리 분석
- 콜라게나 제와 세포 해리
- 각 웰 멸균 PBS의 웰 당 1 ㎖로 두 번 씻어에서 대기음 매체.
- 각 / ㎖ 콜라겐 용액 1 mg을 0.5 ml를 잘 추가합니다.
- 10 분 동안 37 ℃에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 해리 5 분 체크 세포 후. 세포는 여전히 서로 또는 잘 탭의 하단에 부착 된 상태를 유지하면 부드럽게 풉니 다. 또한 P1000와 부드러운 분쇄하여 세포를 떼어 놓다.
주 : 단일 세포 현탁액이 될 때까지 패치 클램프 기록 셀을 용이하게는 분쇄한다. - 각 웰에 0.5 ml의 EB 미디어를 추가하고 피펫으로 혼합한다.
- 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 현탁액 1ml를 전체 전송.
- 300 X g에서 5 분 동안 탁상 원심 분리기의 회전에 의해 펠렛 세포.
- 세포 펠렛에서 기음 미디어.
- 500 세포를 다시 일시단일 세포 현탁액에 씹다해야되고, 10 % FBS와 PBS를 μL.
- 전기 생리 특성.
참고 : 많은 우수한 프로토콜은 세포막 전위를 측정하기 위해 단일 셀 패치 클램프를 사용하여이 저널에 발표되었다. 단일 세포 패치가 초보 독자를 고정 수행하는 방법에 대한 자세한 내용은이 프로토콜 21-24이라고합니다. 다음은 경험이 풍부한 electrophysiologist 준비하고 MESC이 하위 유형 특성에 대한 CMS에 파생 처리 도움이 프로토콜에 대한 특정 정보가 포함되어 있습니다.- 10 mM의 HEPES 버퍼, 5 mM의 MgATP, 2 mM의 EGTA, 110 MM의 칼륨, 글루탐산, 10 밀리미터의 KCl, 10 mM의 NaCl을 다음 구성 세포 내 기록 솔루션을 준비합니다. 의 NaOH를 사용하여 7.2의 pH에 솔루션을 조정합니다.
- 세포 외 기록 (욕) 다음으로 이루어지는 용액을 조제 2 mM의 HEPES, 10 mM의 글루코스를 1 ㎜의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를 5.4 mM의 KCl을, 137mM의 NaCl을. 의 NaOH를 사용하여 7.4의 pH에 솔루션을 조정합니다.
- 필라멘트 표준 붕규산 유리를 사용하여 기록 솔루션으로 채워 때 2-5 MΩ 저항을 측정하는 유리 피펫을 준비합니다.
- 전송 P200 세포를 사용하는, 기록 액 함유 기록 챔버에 현탁 세포 100 ㎕.
주 : 셀은 처리를 용이하게 약물 치료 및 / 또는 재관류 분석을 위해 사용하도록 패치 또는 정지 될 수있다 8.2.5에 명시된 바와 같이, 젤라틴 코팅 된 커버 슬립)에 접종 할 수있다. - 6- 웰 플레이트의 각 웰에 10 mm 직경의 유리 커버 슬립을 배치하고이 프로토콜) 3.1 절에 기술 된 바와 같이, 젤라틴 용액으로 젤라틴 피복함으로써 피복 된 유리 커버 슬립을 준비한다.
- 적어도 30 분 대기음 젤라틴 용액 후 것은 coverslip에 적어도 2 시간 동안이나 세포가 부착 될 때까지 인큐베이터로 전체 6 웰 플레이트를 배치하는 직접 정지 세포 100 μl를 추가합니다. 세포가 부착 한 후, 연구세포 외 기록 용액 챔버 기록에 가져 가십시오 커버 슬립과 장소.
참고 : αMHC-을 DsRed 형광 심장 기자 MESC 라인을 사용하는 경우의 CM가 자신의 적색 형광 핵에 의해 식별 될 수있다. 심장 리포터 라인을 사용하지 않는 경우, 자연 수축 세포를 관찰 할 수 있고, 측정입니다. 다 능성 줄기 세포가 완전히 형성 성인 심장 근육 세포의 특성 직사각형 형태를 결여, CMS가 일반적으로 더 작고 둥근 있습니다 산출했다.
- 적어도 30 분 대기음 젤라틴 용액 후 것은 coverslip에 적어도 2 시간 동안이나 세포가 부착 될 때까지 인큐베이터로 전체 6 웰 플레이트를 배치하는 직접 정지 세포 100 μl를 추가합니다. 세포가 부착 한 후, 연구세포 외 기록 용액 챔버 기록에 가져 가십시오 커버 슬립과 장소.
- 37 ℃에서 모든 기록을 확인합니다. 2-5 MΩ의 저항을 붕규산 유리 피펫으로 전류 클램프 모드에서 전체 셀 클램프를 사용하여 단일 세포를 패치. 전체 셀 액세스하기 전에 기가 옴 밀봉을 달성하기 위해 부드러운 음의 압력을 사용합니다. 막 파열 및 막 전위를 기록하기 전에 전체 셀 액세스하려면 빠른 부압을 적용합니다.
- 현재 주사를 탈분극 4 밀리 초를 사용하여 활동 전위를 보여주고 있습니다.
노트:PSC 유래 CMS에 대한 전류량 재현성 활동 전위가 변할 수 트리거해야. 재생 가능한 활동 전위를 얻을 때까지 최적의 임계 전류를 찾기 위해, 단계적으로 비교적 낮은 전류 증가 트리거 전류 진폭 시작한다.
참고 Grem2 유도 심방 근육 세포에 대한 활동 전위 지속 시간은 20-40 밀리 초의 범위에서 일반적이며 고원 위상 (도 6b)에 부족하다.
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Representative Results
이전 차별화, 만능 줄기 세포는 컴팩트하고 자발적인 분화 없어야합니다. 도 1a에 도시 된 셀은 단일화 및 프로토콜의 섹션 5.1에 기술 된 바와 같이 드랍 매달려에 사용될 준비가되었다. 도 1b에 도시 된 세포는 자발적으로 분화되고 매달려 상품의 제조에 사용되어서는 안된다.
패널은 2는 성공적으로 형성 사채 차별화 하루 2. 품질 사채에 그림에 포함 된 일반적으로. 그림 2와 같이 가장 내에서 균등하게 잘 둥근 매달려 방울 형성 분화 2 일까지, 사채는 구형 배열로 육안으로 볼 수 있어야합니다 매달려 방울 (그림 2)의 끝에서 줄기 세포를 분화. 프로토콜 섹션 5.3에 설명 된대로이 사채는 세척 다운에 대한 준비가되어 있습니다.
일 2-4시, 현탁액 세척 다운 사채의 크기가 계속 증가합니다. 4 일에서 잘 형성 사채는 크기와 모양 (그림 3)에서 무료 부동 균일해야한다. 도 3에 도시 사채 프로토콜 부의 6.1-6.3에 기재된 플레이트를 미리 - 코팅하고 Grem2 처리로 이송 될 준비가되어있다.
도금 된 후에는 세포 조직 배양 플레이트의 표면 상에 EB로부터 이주로서, 사채은 평평해야한다. 분화 일 8 (왼쪽 패널) 및 10 (오른쪽 패널)에 제대로 연결 사채의 예는 그림 4에 표시. 세포가 부착 된 상태를 유지해야하고 아래에 설명 된대로 심장 차별화를 확인하기 위해 매일 모니터링 계속해야한다.
CM이의 존재를 나타내는 세포를 수축, 하루 일찍 관찰 할 수있다6 일 9 일반적으로 한 말은, 계약 세포 분화의 날 (8)에 존재합니다. 각 세포에 감염의 숫자도 (비 처리 Grem2 중에 작은 천천히 수축 패치 관찰 대조군 웰은 (비디오 S1)은 상대적으로 빠르게 수축 속도 웰에게 큰 패치 처리 공통 차별화 날 (14)을 통해 계속 증가한다 비디오 S2). 때때로, 심장 차별화가 발생할 수 없습니다. 이러한 경우 Grem2 치료 단백질의 활성 및 분화 이전 셀의 상태의 타이밍이 프로토콜 (논의를 참조)에 기재된 이러한 조건 각각 최적화 할 수 있는지를 다시 평가한다.
전형적인 Grem2 처리 문화와 처리되지 않은 컨트롤의 그림 5의 결과. 프로토콜 절에 설명 7.1-7.2 수집 용균 세포에서의 유전자 발현의 RT-qPCR의 분석 일반적 높은 레프 공개Grem2 처리 문화 (그림 5A)의 심장 구조 및 조절 유전자의 ELS. αMHC-을 DsRed-NUC 세포주가 사용되는 경우의 CM 증가 수율 Grem2 처리 웰 (도 5B, 하단 패널)에 핵을 DsRed 표지 높은 숫자로 육안 관찰 될 수있다.
CM의 수의 증가를 생성하는 이외에, Grem2 처리는 표현형 등 심방쪽으로 분화를 편향. 심방 표현형은 일반적으로 두 가지 방법으로 확인된다. 먼저, 심실 유전자 (도 6a)을 하향 조절하는 동안 심방의 CM 특성 유전자 상향 조절되는 공개한다 프로토콜 부의 7.1-7.2에 기재된 수집 셀 RT-qPCR의 분석. 둘째, (프로토콜 부의 8.1-8.2에서 설명) 세포 활동 전위 지속 기간의 패치 클램프 측정 짧은 심방 같은 활동 전위 Grem2 treate 중에서 우세한 것을 알 D 세포 (그림 6B).
그림 1. 대표 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs). 다 능성 마우스 배아 줄기 세포 이전의 특성 큰 핵, 소형 식민지 형성 형태 (A, 검은 색 화살표), 화이트 위상 경계 (A, 오렌지 화살표)와 EB 형성한다. 마우스 ES 세포의 자발적 분화 큰 단일 콜로니 (B, 검은 색 화살표)에서 분리 된 세포와 식민지 주위 위상 경계의 손실 (B, 오렌지 화살표)로 표시됩니다. 이미지는 반전 된 위상차 현미경을 사용하여 캡처. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 분화 하루 2 2. 배아 체 (사채). 페트리 접시 뚜껑에 매달려 방울 매달려 일정한 간격과 크기가 균일하고 있습니다 (왼쪽, 스케일 바는 2cm입니다). 매달려 방울의 사채 각 드롭의 중심에 컴팩트 한 분야로 관찰된다 (오른쪽, 스케일 바 1mm입니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
분화 4 일에 정지 그림 3. 사채는. 이상적인 사채의 크기는 균일하고 최소한의 서로 준수 또는 판의 하단에 형성한다. 이미지는 멸균 조건 하에서 절개 범위를 사용하여 촬영 하였다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.로드 / 53919 / 53919fig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
8 (왼쪽)과 10 (오른쪽) 분화의 일에. 도금 EBS을 (를) 도금 후 4 일반적인 EB 형태를 그림. 사채는 젤라틴 화 판에 부착, 그들은 평평하고 세포의 증가 합류 단층으로 둘러싸인 조밀 센터를 나타납니다. 세포의 수축은 일반적으로 작은 주머니 EB의 중심 부근 6-8 분화 일 주위 관찰된다. 이러한 포켓 주변 단층 세포에 감염의 큰 시트를 형성 분화 프로토콜에 걸쳐 확장하는 것을 계속한다. 이미지는 역 위상차 현미경을 이용하여 캡쳐 링. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.
Grem2 처리 및 비 처리 대조군 웰 그림 5. 심장 차별화. 심장 마커의 qPCR의 분석은 빠르면 하루 여섯과 분화 (A)의 하루 (10)를 통해 지속적으로 Grem2으로 처리 EBS의 심장 유전자 발현의 증가를 나타냅니다. 설계 αMHC-을 DsRed-NUC 세포주 대 Grem2 (B, 아래) 비 처리 제어 (B, 위)로 치료 문화을 DsRed 표지의 CM의 큰 풀을 보여줍니다. 그림 14의 허가 적응. 오차 막대는 최소 3 복제 실험에서 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
6 "SRC ="/ 파일 / ftp_upload / 53919 / 53919fig6.jpg "/>
심방과 같은 심장 표현형의 그림 6. 특성화. qPCR의 분석은 심방 유전자와 Grem2 처리 된 샘플 (A)에서 심실 CMS와 관련된 유전자의 하향 조절의 발현의 증가를 나타냅니다. Grem2 치료는 심방 근육 세포 (B)의 짧은 활동 전위 기간 특성과 세포 인구를 생성하는 동안 컨트롤 문화 심방과 심실 세포의 활동 전위 기간 특성과 CMS에 생산하고 있습니다. 샘플을 학생의 t 시험을 사용하여 비교 하였다. * P <0.05; ***, P <0.001 그림 14의 허가 적응. 오차 막대는 최소 3 복제 실험에서 SEM을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 S2. Grem2 처리 된 우물 (오른쪽 다운로드 클릭) . 일반적인 결과는 Grem2 처리 된 세포에서 관찰했다. 빠르게 수축 세포의 큰 패치 도금 EB 걸쳐 관찰된다. 비디오는 분화 10 일에서 촬영했다.
| 유전자 | | 프라이머 역 (5 '3') | |
| 굴지 | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| Gata4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| Gja1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| Gja5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| Myh6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| Tnnt2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
표 qPCR에 프라이머 서열 1. 목록. 프라이머 서열은 유전자의 이름을 알파벳 순으로 나열되어 있습니다. 시퀀스는도 5 및도 6에서 분석의 모든 유전자에 대해 '3'(5)를 제공한다.
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Discussion
이 프로토콜은 정기적으로 심방 혈통의 특징의 CM의 높은 비율과 문화를 생산하고 있습니다. 모든 분화 프로토콜로서, 분화 이전 mESCs의 품질에 특별한주의를 기울여야한다. mESCs 정기적으로 적절한 형태 (그림 1A)에 대해 모니터링해야한다. 이전에 사채의 형성 발생 된 자연 분화는 심각 cardiogenesis의 효율성을 제한합니다 (그림 1B)를 계대 전에 제거해야합니다. EB의 크기도 cardiogenesis에 영향을 미칩니다. (200) 및 EB 1,000 사이의 시작 세포 수는 테스트 한과 EB 500 세포는 정기적으로 CM이 가장 높은 번호를 생성합니다. 전날 EB 형성에 계대되는 세포는 또한보다 효율적으로 구분하는 경향이있다.
"매달려 드롭"방법은이 프로토콜 25 EBS을 (를) 생성하는 데 사용됩니다. 심장 차별화 헥타르에 사용 사채를 만들기위한 다른 방법적이는 26 ~ 29를보고되었다. "매달려 드롭"방법은 쉽게 일반적인 세포 배양 장비 및 재료에 어떤 실험실에서 채택, 간단하고 저렴한이며, 세포 배양 경험을 가진 사람에 의해 수행 될 수있다. 이 RNA는 연구자의 필요에 따라 분석을 위해 용이하게 조작 전사 도금 또는 수집 될 수 사채 제조도 다용도. 그것은 필요에 따라 사채의 작거나 큰 숫자를 생산, 또한 확장 가능합니다.
이 프로토콜은 분화 4 일에 젤라틴 코팅 된 플레이트 상 사채의 도금을 지시한다. 이 단계는 조직 문화에 공통되는 전형적인 단층 형식으로 사채를 구별 변환합니다. 어떤 경우에는 현탁액보다는 도금 사채를 떠나 더욱 편리하거나 필요하다. 서스펜션 사채는 다운 스트림 응용 프로그램을 선호하는 경우 셀 대신 재치를 처리 할 때 하루 4에서 도금되는의 분화 과정을 통해 정지 남아있을 수 있습니다시간 Grem2는 사채 1.5 ml의 원심 분리기 튜브에 넣고 중력에 의해 정착이 허용됩니다. 매체는 조심스럽게 사채의 흡입을 방지 뒤에 소량 남기고 P1000으로 제거하고, 150 mL의 Grem2 매체 튜브에 첨가한다. 이 현탁액을 6cm의 페트리 접시에 옮기고, 37 ℃에서 다시 배치된다. 미디어 이틀 위에 표시된 마이크로 원심 분리 튜브를 사용하는 방법이 변경된다.
분화 하루 4는 일반적으로 주요 이벤트 발달과 관련된 유전자의 발현 분석을 기초로 세포 Grem2 치료를 위해 선택되었다. 낭 배기 마커 유전자 T Brachyury 1 등 켈베로스의 피크 식 후 및 Nkx2-5과 같은 심장 전구 세포 마커의 발현의 발병에 Grem2 첨가 cardiogenesis 및 심방 사양 모두 중요하다. 이러한 유전자의 피크 발현이 세포 라인 사이에 다소 차이가있을 수 있기 때문에이 D 동안 이러한 유전자의 발현을 모니터링하는 것이 좋습니다ifferentiation는 Grem2 추가를위한 최적의 타이밍을 결정합니다. 이 프로토콜 시험 선의 대부분 일 4 및 분화 (5) 사이 Grem2 치료에 반응.
어떤 재조합 단백질과 마찬가지로, Grem2의 활동은 많은에 많이 다릅니다. 같은 많은 일관성을 유지하기 위해 실험의 각 세트에 사용되는로부터 따라서 Grem2하는 것이 좋습니다. 많은 새로운 구입하면 효과는 5 μg의 / ㎖의 범위의 투여 량을 적정에 의해 평가 될 수있다. 이 프로토콜은 분석과 문화에 대한 충분한 수의 심방 혈통에서 CMS에 산출한다. 이 프로토콜을 사용하여 제조 된 세포 계측법, 전기 생리학, RT-qPCR의 흐름을 통해 분석하거나 살아있는 세포 분석법에 사용하기 위해 다시 배양 될 수있다. αMHC-을 DsRed-NUC 기자 라인을 개발하고 정기적으로 실험실에서 사용하는 문화 이후의 CM의 식별 및 분리를 용이하게합니다.
이 프로토콜은 건강 가전을 유지하기 위해 혈청을 사용하여분화 과정 전반에 걸쳐 LL 문화. 이 프로토콜은 일상적으로 강력한 생산하지만, 심방 같은 심장 차별화, 혈청의 사용은 분화 과정에 정의되지 않은 요소를 소개합니다. 이것은 더 정의 미디어가 필요한 경우에 프로토콜의 유용성을 제한 할 수 있습니다. 더 정의 미디어 준비가 필요한 경우, 혈청 마네 세럼 교체 (30)에 의해 대체 될 수있다. 정의 문화 미디어로 전환 할 때 이미이 절에 설명 된대로 Grem2 치료의시기와 농도가 다시 최적화하는 것이 좋습니다.
RT-qPCR의 심방 및 심실 근세포 특정 유전자의 발현을 정량화하는 데 사용된다. 다운 조절 여부가 심실 유전자의 발현에 영향을 미치는 반면 Grem2 처리 심방 특정 유전자의 유도로 이끈다. 이 결과는 Grem2 유도 CMS에 대한 일반적입니다. 심방의 정체성을 평가하기위한 유전자의 제안 세트는이 프로토콜에 포함되어 있습니다. 유전자의 확장 된 세트(S)과의 관련성에 대한 논의는이 프로토콜에 의해 참조 14,16 작품에서 찾을 수있다. 필드가 진화를 계속하고 심장 차별화에 대한 우리의 이해가 향상으로는 심방과 심실의 정체성 마커 목록을 평가하고 필요에 따라 수정하는 것이 좋습니다.
의 CM 생성 균질 배양 특정 아형, 심장에 영향을 미치는 기본적인 연구 척추 하트 챔버 사양 메커니즘을 이해하는데에 중점을위한 모델 시스템을 제공하는 것으로 알려진 질병에 집중 임상 연구 활동을 촉진한다.
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Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 HL083958 및 HL100398 (AKH)와 2T32HL007411-33에 의해 지원되었다 "심장 혈관 메커니즘의 프로그램 : 조사에서 훈련을"(JB)를.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
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