Abstract
Protokoll för att generera populationer av cardiomyocytes från pluripotenta stamceller har utvecklats, men dessa ger i allmänhet celler av blandade fenotyper. Forskare som är intresserade av att fullfölja studier med specifika myocyt subtyper kräver en mer riktad differentiering strategi. Genom att behandla mus embryonala stamceller (ES) -celler med Grem2, en utsöndrad BMP-antagonist som är nödvändig för förmakskammarbildning in vivo, kan genereras ett stort antal hjärtceller med en atriell fenotyp. Användning av konstruerade Myh6-dsRed-Nuc pluripotenta stamceller linje möjliggör identifiering, urval, och rening av hjärtmuskelceller. I detta protokoll embryoidkroppar genereras från Myh6-dsRed-Nuc celler med hängande släpp-metoden och hölls i suspension tills differentiering dag 4 (D4). Vid d4 cellerna behandlas med Grem2 och ströks ut på gelatinbelagda plattor. Mellan d8-D10 stora avtalsområden observeras i odlingarna och fortsätter att expandera och mratur genom d14. Molekyl, histologiska och electrophysiogical analyser visar celler i Grem2-behandlade celler förvärvar atriella liknande egenskaper som tillhandahåller en in vitro-modell för att studera biologi atriella kardiomyocyter och deras svar på olika farmakologiska medel.
Introduction
Pluripotenta stamceller är ett kraftfullt verktyg för att skapa och studera celler från en mängd svåråtkomliga vävnader för grundforskning och prekliniska studier, speciellt hos människor 1-5. Korrekt modulering av utvecklingssignalvägar kan styra differentieringen av pluripotenta stamceller till den önskade fenotypiska öde. Många protokoll har utvecklats för att generera cardiomyocytes (CMS) från pluripotenta stamceller 6-14. Dessa protokoll omfattar i allmänhet modulering av TFGβ super (Aktivin, BMP, och TGF) och Wnt vägar genom tidsinställd tillsats av exogena tillväxtfaktorer och / eller små molekyler 10,12-15. Dessa protokoll är i allmänhet effektiva på att öka andelen celler som blir CMS men saknar specificitet, genererar en blandad population av celler som representerar atrial, ventrikulära och nodal / ledningssystemets linjer. För att studera specifika hjärt subtyper en mer riktad differentiering lämpach krävs.
Gremlin2 (Grem2, även kallad protein besläktade med Dan och Cerberus eller PRDC för kort) är ett utsöndrat BMP-antagonist som är nödvändig för korrekt hjärtdifferentiering och förmakskammarbildning under hjärt utveckling i zebrafisk 16. Behandla differentierande embryonala stamceller med Grem2 vid differentiering dag 4, strax efter topp uttryck för mesodermala markörer T-Brachyury och Cerberus som en, ökar utbytet av CMS och genererar en pool av celler främst av förmaks härstamning 14.
Rekombinant Grem2 används för att behandla de differentierande cellerna och kan göras med användning av standardprotein produktionstekniker 17 eller kan köpas kommersiellt. Det är mycket lösliga i vattenlösningar och kan tillsättas exogent till kulturer vid önskad tidpunkt.
Differentieringen kan spåras med hjälp av RT-qPCR att kvantifiera uttryck av markörer representativaav hjärt progenitorceller, hjärt stamceller och engagerade CMS. Immunofluorescens kan också användas för att identifiera och visualisera rumsliga fördelningen av hjärtcelltyper.
Tillämpningar som kräver rena populationer är mer lätt genomföras vid användning av ett reportersystem för att identifiera och isolera CMS. För detta ändamål har vi infört αMHC-DsRedNuc konstruktionen i musen CGR8 ES cellinje 14. CGR8 celler växer och förblir pluripotenta utan matarceller, vilket underlättar expansion och differentiering analyser 18. ES-cellinjen innehåller en DsRed fluorescerande proteinkodande sekvens med en nukleär lokaliseringssignal under hjärtspecifika alfa myosin tung kedja (a Mhc eller Myh6) genpromotorn. Med hjälp av dessa celler, kan CM lätt identifieras och isoleras för kvantifiering, cellsortering, elektro, drogskärmar, och studera mekanismer för förmaks differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Cell Culture Media, Solutions, och reagens.
- Bereda 500 ml av mus embryonala stamceller (Mesc) media, genom att blanda och steril filtrering (0,2 ^ m porstorlek) 445 ml Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM), 50 ml värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 5 ml 100X koncentrerad L- glutamin ersättning, 5 pl rekombinant mus-Leukemia Inhibitory Factor (LIF) vid 1 x 10 7 enheter per ml och 1,43 | il ß-merkaptoetanol (slutlig koncentration är 50 | iM). Förvara vid 4 ° C tills den ska användas.
- Bereda 500 ml av embryoidkroppar Body (EB) differentieringsmedia genom att blanda och sterilfiltrering 391 ml Iscoves modifierade Dulbecco-medium (IMDM), 100 ml värmeinaktiverat FBS, 5 ml 100X koncentrerad L-glutamin ersättning, 5 ml 100X koncentrerad Icke-essentiella aminosyror (NEAA), och 2,86 l ß-merkaptoetanol (slutlig koncentration är 100 M). Förvaras vid 4˚ C tills den ska användas.
- Förbereda 0,2% vikt/ volym lösning av gelatin genom blandning av en g grishud gelatinpulver med 500 ml filtrerat, destillerat H2O Sterilisera genom autoklavering. Notera att gelatin inte kan vara fullständigt lösliga i vatten vid RT. Efter autoklavering gelatinet ska vara helt löst. Förvara vid RT tills den ska användas.
- Förbereda Grem2 rekombinant protein alikvoter genom att lösa upp 50 jig pellet av lyofiliserad Grem2 i 100 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 0,1% BSA för att göra en 0,5 ug / ul stamlösning. Alikvotera 20 pl av denna stamlösning i fem sterila 1,5 ml centrifugrör och förvaras vid -80˚ C tills den ska användas.
- Förbered PBS enligt publicerade protokoll eller köp som en 10X lager och späd 1:10 med filtrerat, destillerat H2O till en 1X arbetsutspädning 19. Sterilisera PBS genom autoklavering före användning. Förvara vid RT tills den ska användas. I vissa steg, DPBS utan Ca 2 + och Mg 2 + används. Detta är purchased som en 1X-lösning. Beställningsinformation ingår i tabellen av reagens.
2. Framställning av gelatinbelagda 10 cm vävnadsodlingsskålar
- I en steriliserad vävnadsodling huva tillsätt 5 ml 0,2% gelatinlösning till varje 10 cm vävnadsodlingsplatta för beläggning. Placera rätter i inkubator vid 37 ° C i åtminstone 30 minuter eller upp till 4 dagar.
3. Framställning av gelatinbelagda 6-brunnars vävnadskulturplattor
- I en steriliserad vävnadsodling huva tillsätt 1 ml 0,2% gelatin till varje brunn i en 6-brunnars vävnadsodlingsplatta. Placera plattorna i inkubatorn vid 37 ° C under minst 30 minuter eller upp till 4 dagar.
4. embryonal stamcells Culture
- upptinings mESCs
- Förbered Mesc media genom uppvärmning till RT i en steriliserad vävnadsodling huva. Tillsätt 10 ml RT media till en gelatinbelagd 10 cm skål.
- Ta en flaska med mESCs innehållande ungefär 1 x 10 6 celler frånkryoförvaring. Håller cryovial med tång, plats i en 37 ° C vattenbad. Snurra försiktigt tills cellsuspensionen har tinat och endast en liten iskristall kvar i mitten av flaskan. Torka flaskan med en engångs luddfri torka och sterilisera med 70% EtOH.
- I en steril vävnadsodling huva bort upptinade celler med hjälp av en P1000 tips från cryovial och överför till 10 cm skålen upprättats i 4.1.1).
- Placera 10 cm skålen i 37 ° C fuktad cellodling inkubator med 5% CO2 och fördela celler genom att försiktigt förflytta plattan fram och tillbaka, för att sedan sida till sida. Låt cellerna att fästa till plattan O / N, eller åtminstone 6 timmar.
- Första som nästa morgon kontrollceller för fastsättning med hjälp av ett ljust fält mikroskop. Vissa cellrester och döda celler kommer att observeras i media. Det här är normalt. Aspirera media från disk och ersätta med 10 ml färskt Mesc media.
- Fortsätt att ändra media på celler varje dag för att förhindra differentiering.
- Passage celler när 60-70% konfluenta. Förbered celler för passage genom att aspirera media och sköljning med 5 ml steril 1X DPBS utan MgCl2 och CaCl2. Tillsätt 2 ml 0,05% trypsin-EDTA-lösning. Placera i inkubator vid 37 C under 5 min.
- Medan celler inkubation, förbereda nya 10 cm skålen genom att aspirera gelatinlösning och tillsätta 10 ml av RT Mesc media. Efter fem minuter kontrollera cellerna för avskildhet. Om celler förblir fästa, fortsätta att inkubera vid 37 C under 2 min i taget tills helt lossnar.
- Släck trypsin-EDTA genom tillsats av 3 ml av Mesc medier. Överför cellsuspension till ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter för att pelletera. Aspirera media från pellets och återsuspendera i 10 ml Mesc media.
- Beroende på önskad delningsförhållande, tillsätt 0,5-1,0 ml cellsuspension till varje skål som framställts i steg 4.2.2). Placera skålen i inkubatorn och jämnt fördela celler genom att försiktigt flytta tillbaka till fronten sedan från sida till sida. Allaow cellerna att fästa O / N eller i minst 12 timmar.
OBS: En delad förhållande på 1:10 till 1:20 är vanligt för de flesta Mesc linjer. Detta förhållande kan variera beroende på den linje som används, antal passager, och önskade sammanflödet på ny maträtt. För en 1:10 delningsfaktorn överföra 1 ml av cellsuspensionen i 9 ml Mesc medier och plattan i en nygjord gelatinbelagda 10 cm skål.
5. Beredning av Embryoid organ
NOTERA: Alla steg utom centrifugering utförs i en steril vävnadsodling huva.
- Framställning av cellsuspensionen i EB Media
- Vid 70% konfluens (vanligen 24-48 timmar efter passage) använder celler för EB-uppställning. Förbered celler för EB bildning genom att lossa och pellete enligt avsnitt 4.2.1) - 4.2.3).
Anmärkning: (. T.ex., mycket lite celldöd, ingen förorening, korrekt morfologi) Det är bäst att passageceller åtminstone en gång efter upptining och kontrollera hälsan och robust tillväxt (e.g. att populationsfördubblingar inträffar varje 24-48 h) tidigare använda för att EBS. - Återsuspendera pelleten i 5 ml EB media. Räkna celler med användning av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare.
- Späd cellsuspensionen i erforderlig volym EB media för att göra en slutlig koncentration av 25 celler / | il (eller 2,5 x 10 3 celler / ml). Observera att varje locket på en petriskål rymmer ca 60 EB och kräver ca 1,3 ml cellsuspension. I detta steg, förbereda tillräcklig volym av cellsuspensionen för att generera önskat antal EBS. Till exempel, om 240 EB krävs för experimentet, förbereda 5,2 ml vid 2,5 x 10 3 celler / ml.
OBS: mESCs som inte används för EB bildning kan användas för framtida experiment genom att snurra ner, återsuspendering i Mesc media och plätering som beskrivs i avsnitt 4.2.
- Vid 70% konfluens (vanligen 24-48 timmar efter passage) använder celler för EB-uppställning. Förbered celler för EB bildning genom att lossa och pellete enligt avsnitt 4.2.1) - 4.2.3).
- Skapande av Embryoid organ
- Förbereda sterila 10 cm bakteriella petriskålar för hängande droppbildning genom tillsats av 2 ml 1 x PBS till botten av each.
- Överför EB avstängning från steg 5,1) till en steril lösning bassäng.
- Ta bort locket från förberedd petriskål och noggrant sätta sextio, 20 l droppar av EB fjädring på den inre ytan. Åstadkomma detta på ett effektivt sätt med hjälp av en flerkanalig pipett utrustad med 6 tips. Varje 20 l droppe har nu 500 celler.
- Försiktigt ersätta locket på nedre halvan av den bakteriella petriskål, som är noga med att inte rubba hängande droppar. Placera diskgodset i cellodling inkubator vid 37˚ C. Efter 2 dagar, cellerna är redo att skölja ner såsom beskrivits i 5,3).
- Wash-ner av Embryoid organ
Obs: Alla spolpumps- stegen utförs i en steril vävnadsodling huva.- Efter 2 dagar EB: s är redo för tvätt ner och överföra till 6 cm bakteriella petriskålar. Pre-varma 3 ml EB media per petriskål till RT. Varje 6 cm bakteriell petriskål kan effektivt hålla 2 lock värde av hängande droppar.
Obs: Var noga med att använda en icke-belagd petriskål feller detta steg (se material tabell). Använd inte en vävnadsodlingsskål eller någon annan yta som uppmuntrar celladhesion. EB bör hålla sig svävande i media tills den ska vara klädd som beskrivs i avsnitt 6. - Ta bort 10 cm petriskålar från inkubatorn och placera i steril vävnadsodling huva. Försiktigt bort locket med EB och luta i 45 graders vinkel.
- Med hjälp av en 5 ml serologisk pipett innehållande 3 ml RT EB media, försiktigt tvätta EB i en pool på botten av locket. Noggrant inspektera lock för EB som fastnat på ytan och åter skölj vid behov.
- Efter tvättning alla EB överföring till en 6 cm petriskål.
- Upprepa steg 5.3.2) -5.3.4) för alla EBS. Varje 6 cm petriskål bör innehålla EB från två 10 cm lock. Placera alla rätter tillbaka till inkubator vid 37 ° C i två dagar.
OBS: EB som också ligger nära varandra i suspension kan hålla ihop och bildar stora aggregat. Detta kan negativt påverka hjärt differentiering effektivitetsamt avsevärt minska antalet tillgängliga EBS. För att förhindra aggregation, bör EBS kontrolleras varje dag och separeras genom att försiktigt flytta fram och tillbaka, för att sedan sida till sida. Användningen av bakterie rätter i de tidiga differentieringsstegen är nödvändig för att förhindra EB fastsättning skålen och låta EB växa i suspension.
- Efter 2 dagar EB: s är redo för tvätt ner och överföra till 6 cm bakteriella petriskålar. Pre-varma 3 ml EB media per petriskål till RT. Varje 6 cm bakteriell petriskål kan effektivt hålla 2 lock värde av hängande droppar.
6. Plating och behandling av EBS med Grem2
- Förbered Grem2 behandlingsmediet genom att tillsätta tillräckligt stort lager (0,5 mikrogram / l) Grem2 till RT EB medium för en slutlig utspädning av 1-5 ng / ml.
OBS: Den effektiva koncentrationen för behandling av EBS varierar beroende på cellinjen och specifika aktiviteten för det nuvarande massa Grem2. Det rekommenderas att före användning dosen titreras för att hitta maximal effektivitet. För CGR8 Mesc linje vi rutinmässigt använder 3-5 pg / ml Grem2. Effektiva koncentrationer av Grem2 för förmaks myocyte generation kommer att producera snabbt upphandlande celler mellandagar 7-8 som är vanligt förekommande inom varje brunn. Om upphandlande fenotyp inte observeras i behandlade kulturer rekommenderas att Grem2 dosen titreras inom det angivna intervallet. - Förbered sex-brunnars vävnadsodlingsplattor genom att aspirera gelatinbeläggningslösningen från varje brunn och tillsätta 2 ml av RT Grem2 behandlingsmedia. Ta EB från inkubatorn och placera i steril vävnadsodling huva.
- Med hjälp av en P1000 satt till 100 il överföra 30 EB från 6 cm petriskålar till varje brunn. Placera EB i inkubatorn och jämnt sprida genom att försiktigt flytta plattan tillbaka till fronten sedan från sida till sida.
- Efter EBS har fäst till gelatinbelagda brunnar, byt Grem2 media varannan dag till dag 10. Efter dag 10, avbryta Grem2 behandling och lägga till nya EB media varannan dag för att upprätthålla friska celler.
OBS: Efter att fästa, kommer EBS plattas ut längs ytan på den belagda plattan.
- Efter EBS har fäst till gelatinbelagda brunnar, byt Grem2 media varannan dag till dag 10. Efter dag 10, avbryta Grem2 behandling och lägga till nya EB media varannan dag för att upprätthålla friska celler.
7. Cell Dissociation för RT-qPCR Analysis
- Cell Dissociation med trypsin-EDTA
- Aspirera medium från varje brunn och skölj två gånger med 1 ml per brunn av steril DPBS minus Ca2 + och Mg2 +.
- Tillsätt 0,5 ml 0,25% steril Trypsin-EDTA-lösning till varje brunn från vilka celler kommer att samlas in.
- Placera plattan i inkubator vid 37 C under 5 min.
- Efter 5 min kontrollceller för dissociation. Om celler fortfarande sitter kvar till botten av brunnen kranen försiktigt för att lossa. Om knacka inte lossnar celler, placera tillbaka i inkubatorn och övervaka varje 2 minuter tills cellerna är helt fristående.
- Neutralisera Trypsin-EDTA-lösning genom att tillsätta 0,5 ml EB media till varje brunn.
- Överföra hela 1 ml cellsuspension till ett 1,5 ml mikro-centrifugrör.
- Pelletera celler genom spinning i en bordsskiva centrifug under 5 min vid 300 x g.
- Aspirera media från pellet och gå vidare till lys omedelbart eller lagra pellets vid -70 C tills redo för lys. Lång-term lagring av pellets rekommenderas inte eftersom detta kan leda till nedbrytning av RNA.
- Cell Lysis and Molecular Analysis
- Vid denna punkt cellerna är redo för RNA-isolering med hjälp av en kommersiell kolumn utvinning kit eller med hjälp av RNA-extraktion reagens enligt protokollen som tillhandahålls av tillverkarna (se tabell av material). När isolerade, omvänt transkriberat RNA och använda cDNA för RT-qPCR analys med användning av standardtekniker 20, 21.
OBS: Primers som används av denna arbetskraft för RT-qPCR listas i Tabell 1. Atrial identitet bekräftas med hjälp av en kombination av RT-qPCR att titta på uttryck av atriella och ventrikulära gener och elektrofysiologi till rekord aktionspotentialens duration (se avsnitt 8). Ett urval av gener ingår i detta protokoll som ett exempel på tillförlitliga förmaks- och kammar markörer. Mer information om förmaks- och ventrikulära genexpression i samband med pluripotenta stamceller differentiering återfinns i 14 referens. </ Li>
- Vid denna punkt cellerna är redo för RNA-isolering med hjälp av en kommersiell kolumn utvinning kit eller med hjälp av RNA-extraktion reagens enligt protokollen som tillhandahålls av tillverkarna (se tabell av material). När isolerade, omvänt transkriberat RNA och använda cDNA för RT-qPCR analys med användning av standardtekniker 20, 21.
8. Elektrofysiologiska Analys
- Cell Dissociation med kollagenas
- Aspirera medium från varje brunn och skölj två gånger med 1 ml per brunn av steril PBS.
- Tillsätt 0,5 ml av 1 mg / ml kollagenas-lösning till varje brunn.
- Placera plattan i inkubator vid 37 C under 10 min.
- Efter 5 min kontrollceller för dissociation. Om celler fortfarande förblir fästa till varandra eller botten av brunnen kranen försiktigt för att lossa. Ytterligare dissociera cellerna genom försiktig triturering med en P1000.
OBS: För att underlätta patch clamp inspelningar celler bör revs tills en encelliga suspension uppnås. - Tillsätt 0,5 ml EB media till varje brunn och blanda genom pipettering.
- Överföra hela 1 ml cellsuspension till ett 1,5 ml mikro-centrifugrör.
- Pelletera celler genom spinning i en bordsskiva centrifug under 5 min vid 300 x g.
- Aspirera media från cellpellets.
- Återsuspendera celler i 500il PBS med 10% FBS, att se till att finfördela till en enda cell suspension.
- Elektrofysiologiska Karakterisering.
OBS: Många utmärkta protokoll har publicerats i denna tidskrift om att använda en enda cell patch clamp att mäta cellmembranpotentialer. För detaljerad information om hur man utför en enda cell patch klämma nybörjare läsaren hänvisas till dessa protokoll 21-24. Följande innehåller specifik information för detta protokoll som kommer att hjälpa erfarna electrophysiologist förbereda och hantera Mesc härledda CMS för subtyp karakterisering.- Förbereda intracellulära inspelning lösning som består av följande: 10 mM HEPES-buffert, 5 mM MgATP, 2 mM EGTA, 110 mM kalium glutamat, 10 mM KCl, och 10 mM NaCl. Justera lösningen till ett pH av 7,2 med användning av NaOH.
- Förbered extracellulärt inspelning (bad) lösning bestående av följande: 2 mM HEPES, 10 mM glukos, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 5,4 mM KCl, och 137mM NaCl. Justera lösningen till ett pH av 7,4 med användning av NaOH.
- Förbered en glas pipett som mäter 2-5 Mohm motstånd när återfylls med inspelning lösning med hjälp av standard borsilikatglas med glödlampa.
- Överföring 100 pl suspenderade celler i inspelningen kammaren innehåller extracellulära inspelning lösning med hjälp av en P200.
OBS: Celler kan lagas i suspension eller, för att underlätta hantering och användning för behandling och / eller perfusion analyser kan ympas på en gelatinbelagd täck som beskrivs i 8.2.5). - Förbered gelatinbelagda täckglas genom att placera en 10 mm diameter täckglas i varje brunn i en 6-brunnar och täcker med gelatinlösning som beskrivs i avsnitt 3.1) av detta protokoll.
- Efter minst 30 minuter aspirera gelatinlösning och tillsätt 100 pl av suspenderade celler direkt till täckglas och placera hela 6-brunnar i kuvös under minst två timmar eller tills cellerna har fäst. Efter det att cellerna har fäst, rEFlytta täckglas och plats i inspelningen kammare med extracellulära inspelning lösning.
OBS: Om du använder αMHC-DsRed fluorescerande hjärt reporter Mesc linje, kan CM identifieras genom sina röda fluorescerande kärnor. Om du inte använder en hjärt reporter linje, kan observeras spontant upphandlande celler och isolerade för mätningar. Pluripotenta stamceller som härrör CMS är oftast mindre och mer rundad, saknar den karakteristiska rektangulära morfologi fullt utvecklade vuxna hjärtmyocyter.
- Efter minst 30 minuter aspirera gelatinlösning och tillsätt 100 pl av suspenderade celler direkt till täckglas och placera hela 6-brunnar i kuvös under minst två timmar eller tills cellerna har fäst. Efter det att cellerna har fäst, rEFlytta täckglas och plats i inspelningen kammare med extracellulära inspelning lösning.
- Gör alla inspelningar vid 37 ° C. Patch enskilda celler med hjälp av hela cell klämman i strömklämläge med en borosilikatglas pipett 2-5 Mohm motstånd. Använd mild undertryck att uppnå gigaohm tätning innan få hela cell tillgång. Applicera snabbt undertryck att spräcka membranet och få hela cell tillgång inför inspelningen membranpotentialer.
- Framkalla aktionspotentialer med 4 ms depolariserande aktuella injektioner.
NOTERA:För PSC-härledda CMs den mängd ström som krävs för att på ett reproducerbart sätt utlösa aktionspotentialer kan variera. I syfte att finna optimala tröskelström, börjar vid en relativt låg ström och ökning trigg strömamplituden på ett stegvis sätt till dess att reproducerbara aktionspotentialer erhålles.
NOT: Åtgärd potentiella varaktighet för Grem2-inducerade atriella myocyter är vanligtvis inom intervallet 20-40 ms och saknar en platåfasen (Figur 6B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Före differentiering bör pluripotenta stamceller vara kompakt och fri från spontan differentiering. Cellerna som visas i figur 1A är redo att singularized och användas för att hänga droppar som beskrivs i 5.1 i protokollet sektionen. Cellerna som visas i figur 1B är spontant differentiera och bör inte användas för beredning av hängande droppar.
Panelerna som ingår i Figur 2 visar framgångsrikt bildade EB vid differentiering dag 2. Kvalitets EB allmänhet bilda bäst inom jämnt fördelade, väl rundad hängande droppar såsom visas i figur 2. Genom differentiering dag 2, bör EBS vara synlig för blotta ögat som sfäriska arrangemang att differentiera stamceller vid spetsarna på de hängande droppar (figur 2). Dessa EB är redo för tvätt ner som beskrivs i 5.3 i protokollet sektionen.
Under dagarna 2-4, bör tvättas-down EB i suspension fortsätter att växa i storlek. Vid dag 4, bör välformade EBS vara fritt flytande och homogen i storlek och form (Figur 3). EBS som visas i figur 3 är redo att överföras till pre-belagda plattor och behandlades med Grem2 såsom beskrivits i 6,1-6,3 av protokollsektionen.
Gång pläterade, bör EBS platta till som celler migrerar ut från EB på ytan av vävnadsodlingsplattan. Visas i figur 4 är exempel på korrekt kopplade EBS på differentiering dagar 8 (till vänster) och 10 (högra panelen). Celler bör fortsätta att övervakas dagligen för att vara säker på att de sitter kvar och för att kontrollera hjärtdifferentiering som beskrivs nedan.
Upphandlande celler, vilket indikerar närvaron av CMS kan observeras så tidigt som dag6 och så sent som dag 9. Vanligtvis kommer upphandlande celler att närvara vid dag 8 av differentiering. Antalet upphandlande celler i varje brunn bör fortsätta att öka genom differentiering dag 14. I icke-behandlade kontrollbrunnar små, långsamt upphandlande fläckar observeras (Video S1) medan i Grem2 behandlade brunnar stora fläckar med en relativt snabb upphandlande hastighet är vanliga ( video S2). Ibland, hjärtdifferentiering misslyckas att inträffa. I sådana fall tidpunkten för Grem2 behandling aktiviteten hos proteinet, och tillståndet för de celler före differentiering bör omvärderas för att vara säker på att var och en av dessa villkor är optimerad som beskrivs i detta protokoll (se diskussion).
Figur 5 visar resultaten typiskt av Grem2-behandlade kulturer och obehandlade kontroller. RT-qPCR analys av genuttryck i celler som samlats in och lyserades såsom beskrivits i 7,1-7,2 i protokollenheten avslöjar vanligtvis hög levels av hjärt strukturella och regulatoriska gener i Grem2-behandlade kulturerna (figur 5A). Om αMHC-DsRed-Nuc cellinje används, kan observeras ökat utbyte av CM visuellt högre antal DsRed-märkta kärnor i Grem2-behandlade brunnar (figur 5B, nedre panelen).
Förutom att generera ett ökat antal CMS, Grem2 behandling förspänner också differentieringen mot en förmaks fenotyp. Förmaks fenotyp vanligtvis bekräftas på två sätt. Först RT-qPCR analys av celler som samlats som beskrivs i 7,1-7,2 i protokollet avsnitt bör avslöja att gener som är karakteristiska för förmaks CMS uppregleras medan ventrikulära gener nedregleras (Figur 6A). För det andra, patch clamp mätningar av cellulära aktionspotentialens duration (som beskrivs i 8,1-8,2 i protokollenheten) avslöjar att en kort, atrial liknande aktionspotentialen dominerar bland Grem2 behandlad d celler (Figur 6B).
Figur 1. Representativa mus embryonala stamceller (mESCs). Pluripotent mus embryonala stamceller före EB formation med karakteristisk stor kärna, kompakt kolonibildande morfologi (A, svarta pilar), och vita fas gränserna (A, orange pilar). Spontan differentiering av mus ES-celler indikeras av större, enskilda celler separerade från kolonier (B, svarta pilar) och förlust av fas kant runt kolonier (B, orange pil). Bilder tagna med användning av ett inverterat faskontrastmikroskop. Skalstrecken representerar 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Embryoid organ (EBS) på dag två av differentiering. Hängande droppar suspenderade från en petriskål lock (vänster, är skala bar 2 cm) är jämnt fördelade och homogen i storlek. EB i hängande droppar observeras som kompakta sfärer i mitten av varje droppe (höger, är skala bar 1 mm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. EB i suspension vid dag 4 av differentiering. Ideal EB bör vara homogena i storlek och form med minimal vidhäftning till varandra eller i botten av plattan. Bilderna har tagits med en dissekera omfattning under sterila förhållanden. Skala stapel representerar 100 nm.belastning / 53.919 / 53919fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Typisk EB morfologi efter plätering. Pläterad EB vid dag 8 (vänster) och 10 (höger) av differentiering. Som EBS fäster gelatine plattor, de plana ut och visas som täta centra omgivna av en allt mer sammanflytande monoskikt av celler. Små fickor av upphandlande celler i allmänhet observeras runt differentierings dagar 6-8 nära centrum av EB. Dessa fickor fortsätter att expandera genom differentiering protokollet för att bilda större ark upphandlande celler i de omgivande mono. Bilder som tagits med ett inverterat faskontrastmikroskop och. Skalstrecken representerar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Hjärt differentiering i Grem2-behandlade och obehandlade kontrollbrunnar. QPCR analys av hjärtmarkörer indikerar en ökning av hjärt genuttryck i EBS behandlas med Grem2 så tidigt som dag sex och fortsätter genom dag 10 av differentiering (A). Den manipulerade αMHC-DsRed-Nuc cellinje visar stora pooler av DsRed-märkt CMS kulturer behandlade med Grem2 (B, botten) kontra icke-behandlade kontroller (B, överst). Siffror anpassat med tillstånd från 14. Felstaplar representerar SEM från åtminstone 3 upprepade experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
6 "src =" / filer / ftp_upload / 53.919 / 53919fig6.jpg "/>
Figur 6. Karakterisering av förmaksliknande hjärt fenotyp. QPCR analys indikerar en ökning i expression av förmaks gener och nedreglering av gener associerade med ventrikulära CMs i Grem2-behandlade prov (A). Kontrollodlingar producerar CM med aktionspotentialens duration egenskap av atriella och ventrikulära celler medan behandling med Grem2 genererar cellpopulationer med den korta durationen av aktionspotentialen karakteristisk för förmaks myocyter (B). Prover jämfördes med användning av Students t-test. *, P <0,05; ***, P <0,001 Siffror anpassat med tillstånd från 14. Felstaplar representerar SEM från åtminstone 3 upprepade experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video S1. Icke-behandlade kontrollbrunnar (högerklicka för att ladda ner). Små, långsamt-avtals fickor eller fläckar av hjärtmyocyter runt periferin av EB (vita pilar). Video togs vid differentiering dag 10.
Video S2. Grem2-behandlade brunnar (Högerklicka för att ladda ner) . Typiska resultat observerades i Grem2-behandlade celler. Stora fläckar av snabbt upphandlande celler observeras under hela den pläterade EB. Video togs vid differentiering dag 10.
| Gen | | Omvänd primer (5 'till 3') | |
| aktin | CTACGAGGGCTATGCTCTCCC | CCGGACTCATCGTACTCCTGC |
| GAPDH | CTCACTCAAGATTGTCAGCAATG | GAGGGAGATGCTCAGTGTTGG |
| GATA4 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CTGCGATGTCTGAGTGACAGG |
| Gja1 | ACAAGGTCCAAGCCTACTCCA | CCGGGTTGTTGAGTGTTACAG |
| Gja5 | ATAACAGTGGGCAGTTGAACAGCAG | TACCCAATAACGAATGTGGGAGATG |
| Myh6 | TACACTCTTCTCTACCTATGCTTCT | CACTATCTTCTTGAACTCAATGC |
| Myl2 | AGAGATCGATGAAATGATCAAAGAG | CAGAGCCAAGACTTCCTGTTTATT |
| Myl7 | AAATCAGACCTGAAGGAGACCTATT | CAGAGAGACTTGTAGTCAATGTTGC |
| Nkx2.5 | GTCTCAATGCCTATGGCTAC | CTACGTCAATAAAGTGGGATG |
| Tnnt2 | CAGAGGAGGCCAACGTAGAAG | CTCCATCGGGGATCTTGGGT |
Tabell 1. Förteckning över qPCR primersekvenser. Primer sekvenser listas alfabetiskt efter genen namn. Sekvenser tillhandahålls 5 'till 3' för alla gener som analyserats i figurerna 5 och 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll rutinmässigt producerar kulturer med en hög andel av CMS som är kännetecknande för förmaks härstamning. Som med alla differentieringsprotokoll, bör kvaliteten på mESCs före differentiering ägnas särskild uppmärksamhet. mESCs bör rutinmässigt övervakas för korrekt morfologi (Figur 1A). Alla spontan differentiering som inträffar före bildandet av EBS kommer att allvarligt begränsa effektiviteten i kardiogenes och bör tas bort innan passage (Figur 1B). EB storlek påverkar också kardiogenes. Start cell nummer mellan 200 och 1000 per EB har testats och 500 celler per EB producerar rutinmässigt flest CMS. Celler som passe dagen före EB bildning tenderar också att skilja mer effektivt.
Den "hängande droppe" metod används för att generera EB i detta protokoll 25. Andra metoder för framställning av EBS används för hjärtdifferentiering have rapporterats 26-29. Den "hängande droppe" metod är enkel och billig, lätt antas i alla laboratorier med gemensam cellodlings utrustning och material, och kan utföras av vem som helst med cellodlings erfarenhet. Det är också mångsidiga, som producerar EBS som lätt kan manipuleras, överföras, pläterade, eller samlas in för RNA-analyser i enlighet med behoven hos utredarna. Det är också skalbar, producerar små eller stora antal av EB efter behov.
Protokollet dikterar plätering av EBS på gelatinbelagda plattor på dag fyra av differentiering. Detta steg omvandlar differentiera EB i mer typiska mono format gemensamt för vävnadsodling. I vissa fall kan det vara mer praktiskt och eller nödvändigt att lämna EBS i suspension i stället för plätering. Om upphängnings EB är föredragna för tillämpningar efter att cellerna kan lämnas kvar i suspension under hela differentieringsprocessen i stället för att pläterades vid dag 4. Vid behandling av with Grem2, är EBS placerades i 1,5 ml centrifugrör och fick sätta sig genom tyngdkraften. Medierna avlägsnas därefter försiktigt med en P1000, vilket lämnar en liten mängd kvar för att förhindra aspiration av EBS, och 1,5 ml Grem2 medium tillsätts till röret. Denna suspension överföres därefter till en 6 cm petriskål och placerades tillbaka på 37C. Medierna ändras med mikrocentrifugröret ovanstående metod varannan dag.
Differentiering dag 4 valdes för behandling av celler med Grem2 baserat på expressionsanalys av gener i allmänhet förknippas med stora utvecklings händelser. Tillsats av Grem2 efter topp uttryck av gastrulation markörgener T Brachyury och Cerberus som en och vid uppkomsten av uttrycket av kardiella progenitor cellmarkörer såsom Nkx2-5 är kritisk för både kardiogenes och atriell specifikation. Eftersom topp uttryck av dessa gener kan variera något mellan cellinjer rekommenderas att följa uttryck av dessa gener under differentiation att bestämma optimala tidpunkten för Grem2 tillsats. Av de testade för detta protokoll linjer, mest svarade på behandling med Grem2 mellan dag 4 och 5 av differentiering.
Som med alla rekombinanta proteinet, aktiviteten av Grem2 varierar från sats till sats. Det rekommenderas därför att Grem2 från samma parti används för varje uppsättning av experiment för att upprätthålla konsekvens. När ett nytt parti köps, kan effektiviteten bedömas genom att titrera dosen i intervallet 1-5 | j, g / ml. Detta protokoll ger CM från förmaks härstamningen av tillräckligt antal för analys och kultur. Celler som producerats med hjälp av detta protokoll kan analyseras via flödescytometri, elektrofysiologi, RT-qPCR eller åter odlas för användning i levande cellanalyser. För att underlätta identifiering och isolering av CM efter kulturen αMHC-DsRed-Nuc reporter linje har utvecklats och används rutinmässigt av vårt laboratorium.
Detta protokoll använder serum att bevara friska cell kulturer genom differentieringsprocessen. Även om detta protokoll rutinmässigt ger robust, förmaksliknande hjärt differentiering, användning av serum introducerar en odefinierad inslag i differentieringsprocessen. Detta kan begränsa användbarheten av protokollet i de fall där det krävs en mer definierade medier. Om en mer definierade medier förberedelse krävs, kan serum ersättas med Knockout Serum Byte 30. När man byter till ett definierat odlingsmedium är det rekommenderat att timing och koncentration av Grem2 behandlingen åter optimeras såsom redan beskrivits i detta avsnitt.
RT-qPCR används för att kvantifiera uttrycket av gener som är specifika för atriella och ventrikulära myocyter. Grem2 behandling leder till en induktion av förmaks specifika gener medan nedreglera eller inte påverkar uttrycket av ventrikulära gener. Detta resultat är typiskt för Grem2-inducerade CMS. En föreslagen uppsättning av gener för att bedöma förmaks identitet ingår i detta protokoll. En utökad uppsättning av genens och en diskussion av deras relevans kan hittas i verk som refereras av detta protokoll 14,16. Eftersom området fortsätter att utvecklas och vår förståelse av hjärt differentiering förbättrar rekommenderas att denna lista av atriella och ventrikulära identitetsmarkörer bedöms och revideras vid behov.
Genererar homogena kulturer CMS kommer att underlätta kliniska forskningsinsatser inriktade på sjukdomar som är kända för att påverka specifika hjärt subtyper och ger ett modellsystem för grundläggande forskning inriktad på att förstå mekanismerna för kammar specifikation ryggradsdjur hjärtan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag HL083958 och HL100398 (AKH) och 2T32HL007411-33 "Program i Cardiovascular mekanismer: Träning i Investigation" (JB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ESG1107 | |
| ß-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Non-Essential Amino Acids | Sigma | M7145 | |
| 10 cm Tissue Culture Plates | Sarstedt | 83.3902 | |
| 10 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-342 | |
| 6 cm Bacterial Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| 6-well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 recombinant protein | R&D Systems | 2069-PR-050 | |
| Sterile filter units | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatin (from porcine skin) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Sterile | Sigma | P5493 | |
| BSA | Sigma | 5470 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, no Calcium, no Magnesium | Life Technologies | 14200 |
References
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells. Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).
- Zhang, Y., Pak, C., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations. Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).
- Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes. Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).
- Burridge, P. W., Anderson, D., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
- Cai, C. L., Liang, X., et al. Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart. Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).
- Fujiwara, M., Yan, P., et al. Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A. PLoS ONE. 6 (2), e16734 (2011).
- Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).
- Burridge, P. W., Matsa, E., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., Zhang, J., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway. Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).
- Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
- Müller, I. I., Melville, D. B., et al. Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).
- Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC). Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).
- Schulz, H., Kolde, R., et al. The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation. PLoS ONE. 4 (9), e6804 (2009).
- Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke. American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).
- Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).
- Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. Methods in Molecular Biology. , 254-279 (2004).
- Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
- Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. Basic Cell Culture Protocols. 946, 523-533 (2013).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
