قدم هو بروتوكول شارك مستوقف البيولوجية الحفازة خلية كاملة لتجديد العامل المساعد وتحسين إعادة استخدام، وذلك باستخدام إنتاج L-زايلولوز كمثال على ذلك. ويتحقق تجديد العامل المساعد من قبل اقتران سلالتين القولونية التعبير عن الانزيمات التكميلية وظيفيا. حقق المتحفز الحيوي تجميد كامل الخلية التي كتبها تغليف الخلايا في حبات الجينات الكالسيوم.
لقد وضعت مؤخرا نظام biocatalytic خلية كاملة بسيطة، قابلة لإعادة الاستخدام وإلى جانب القدرة على تجديد العامل المساعد والشلل المتحفز الحيوي لتحسين العائد إنتاج وتركيب المستدام. طيه وصفها هو الإجراء التجريبي لتطوير مثل هذا النظام تتكون من اثنين من E. سلالات كولاي التي تعبر عن الإنزيمات التكميلية وظيفيا. معا، ويمكن لهذه الانزيمات اثنين تعمل بصورة تعاونية للتوسط في تجديد العوامل المساعدة مكلفة لتحسين المحصول المنتج من bioreaction. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن طريقة تجميع شكل يجمد النظام biocatalytic مقرونة تغليف الخلايا بأكملها في حبات الجينات الكالسيوم. وكمثال على ذلك، نقدم الحيوي محسنة من L-زايلولوز من L-arabinitol بواسطة اقتران E. خلايا القولونية التعبير عن الانزيمات L-arabinitol نازعة أو أوكسيديز NADH. تحت الظروف المثلى وباستخدام تركيز الأولي من 150ملي L-arabinitol، بلغ الأقصى-L زايلولوز العائد 96٪، وهي نسبة أعلى من تلك التي ذكرت في الأدبيات. أظهر شكل يجمد لالبيولوجية الحفازة خلية كاملة إلى جانب الاستقرار التشغيلي الجيد، والحفاظ على 65٪ من المحصول تم الحصول عليها في الدورة الأولى بعد 7 دورات إعادة استخدامها على التوالي، في حين أن النظام الخليوي حرة فقدت تماما تقريبا النشاط التحفيزي. ولذلك، فإن وسائل ذكرت هنا توفر اثنين من الاستراتيجيات التي يمكن أن تساعد على تحسين الإنتاج الصناعي من L-زايلولوز، فضلا عن غيرها من المركبات ذات القيمة المضافة التي تتطلب استخدام العوامل المساعدة بشكل عام.
أصبح التخفيض خلية كاملة أحيائي باستخدام الكائنات الدقيقة طريقة على نطاق واسع لتركيب الكيماوي الأنزيمية من الجزيئات الحيوية الهامة تجاريا وعلاجيا 1-3. وهو يقدم العديد من المزايا على استخدام الإنزيمات المعزولة، وخاصة القضاء على عمليات تنقية المصب مكثفة من حيث التكلفة ومظاهرة من العمر الممتد 4-7. لمسارات biocatalytic حيث يطلب من العوامل المساعدة لتشكيل المنتجات والنظم خلية كاملة لديها القدرة على توفير في الموقع العامل المساعد تجديد عن طريق إضافة غير مكلفة-التبرع الإلكترون المشارك ركائز 5،8،9. ومع ذلك، تتقلص هذه القدرة على ردود الفعل التي تتطلب تركيز متكافئة النادرة أو باهظة الثمن المشارك ركائز 10-13. جنبا إلى جنب مع إعادة استخدام الفقيرة من الخلايا الكاملة، وهذا يعوق إنشاء الم Ù تحجيم ومستمرنظام ction. مطلوبة التعديلات الاستراتيجية لنظم خلية كاملة لهذه التحولات الحيوية التي تعتمد على العامل المساعد للتغلب على القيود المذكورة أعلاه. على وجه التحديد، وقد ثبت أن الجمع بين البيولوجية الحفازة خلية كاملة تعمل بشكل تعاوني ليعزز إلى حد كبير الإنتاجية وثبات إنزيمات آوى 14. هذه العوامل، التي غالبا ما تكون حاسمة لتمكين الإنتاج على نطاق واسع من المنتجات مجدية تجاريا، يمكن زيادة الأمثل كل شل حركة المشارك الميكروبات biocatalytic 15. لقد وضعت مؤخرا خلية كاملة نظام biocatalytic بسيطة وقابلة لإعادة الاستخدام التي تسمح لكل تجديد العامل المساعد والشلل المتحفز الحيوي لل-L زايلولوز إنتاج 16. في هذه الدراسة، تم استخدام هذا النظام كمثال لتوضيح الإجراءات التجريبية من تطبيق هذه الاستراتيجيات اثنين لتحسين العائد إنتاج أحيائي وإعادة استخدام المتحفز الحيوي.
L-زايلولوز ينتمي إلى القانون المدنيSS من الجزيئات المفيدة بيولوجيا يدعى السكريات نادرة. السكريات الأحادية هي نادرة فريدة من نوعها أو مشتقات السكر الذي يحدث نادرا جدا في الطبيعة، ولكن تلعب أدوارا حاسمة كعناصر الاعتراف في الجزيئات النشطة بيولوجيا 17،18. لديهم مجموعة متنوعة من التطبيقات بدءا من المحليات، والأغذية الوظيفية إلى العلاجات المحتملة 19. L-زايلولوز يمكن استخدامها كمانع المحتمل لعدة α-غلوكوسيديزات، ويمكن أيضا أن تستخدم كمؤشر على التهاب الكبد أو الكبد تليف الكبد 17،20. تم الإبلاغ عن تحويل كفاءة عالية من إكسيليتول إلى L-زايلولوز في أنظمة خلية كاملة سابقا في Pantoea ananatis 21،22، المقلونة ليرة سورية. 701B 23، عصيات الشاحبة Y25 24،25 والقولونية 26. في E. القولونية، ومع ذلك، لم يتحقق إلا باستخدام منخفضة (<67 مم) تركيزات إكسيليتول 26 بسبب الآثار المثبطة المحتملة لتركيز إكسيليتول الأولي أعلى من 100 ملم على النشاط إكسيليتول-4-نازعة 21،26. وقد تبين التوازن الحرارية بين زايلولوز وإكسيليتول لصالح بشدة تشكيل إكسيليتول 25،27. بالإضافة إلى ذلك، العائد زايلولوز محدودة بمقدار العوامل المساعدة باهظة الثمن التي لا بد من توفيرها في ظل عدم وجود نظام في الموقع العامل المساعد تجديد. معا، هذه العوامل تحد من إمكانية التوسع في نظم مستدامة لالحيوي-L زايلولوز.
للتغلب على هذه القيود وتحسين العائد أحيائي-L زايلولوز، كان يعمل استراتيجية تجديد العامل المساعد أول من وضع نظام biocatalytic خلية كاملة إلى جانب. على وجه التحديد، L-Arabinitol 4 نازعة (EC 1.1.1.12) من فطر المستلحمة jecorina (HjLAD)، وهو الانزيم في مسار-L الارابينوز تقويضي من الفطريات تم اختيار، لتحفيز تحويل L-arabinitol إلى L-زايلولوز 28،29 . مثل العديد من الإنزيمات السكروز، وهو limitatio كبيرن من HjLAD هو أنه يتطلب كمية متكافئة من تكلفة نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد العامل المساعد (NAD +، وشكل المؤكسد من NADH) لتنفيذ هذا التحويل. وقد تبين NADH أوكسيديز وجدت في العقدية المقيحة (SpNox) لعرض النشاط المرتفع العامل المساعد-تجديد 30،31. الاستفادة من هذه السمة من SpNox، E. اقترنت خلايا القولونية التعبير عن HjLAD لإنتاج L-زايلولوز مع E. خلايا القولونية التعبير عن SpNox للتجديد من NAD + إلى زيادة إنتاج-L زايلولوز يصور رد فعل يقترن هو مبين في الشكل 1A. تحت الظروف المثلى وباستخدام تركيز الأولي من 150 ملي L-arabinitol، بلغ الأقصى-L زايلولوز العائد 96٪، مما يجعل هذا النظام أكثر كفاءة بكثير من تلك التي ذكرت في الأدب.
كان يعمل استراتيجية تجميد خلية كاملة بجانب زيادة تعزيز إعادة استخدام من جانب biocatalytنظام جيم. وتشمل الأساليب المستخدمة عادة لتجميد كامل الخلية الامتزاز / التساهمية ربط المصفوفات الصلبة، عبر ربط / انحباس والتغليف في شبكات البوليمرية (32). ومن بين هذه الأساليب، الأسلوب الأكثر مناسبة لتجميد الخلية التغليف في حبات الجينات الكالسيوم. خصائصها دبق خفيفة، مصفوفة المائية الخاملة والمسامية العالية تساعد في الحفاظ على الخصائص الفسيولوجية وظائف البيولوجية مغلفة 33. ولذلك، فإن نظام المتحفز الحيوي إلى جانب تحتوي على كل من E. وقد ثبتوا الخلايا القولونية إيواء HjLAD أو SpNox في حبات الجينات الكالسيوم لتمكين دورات متعددة من الإنتاج L زايلولوز (الشكل 2). وأظهر نظام المتحفز الحيوي يجمد الاستقرار التشغيلي الجيد، والحفاظ على 65٪ من العائد تحويل الدورة الأولى بعد 7 دورات إعادة استخدامها على التوالي، في حين أن النظام الخليوي حرة فقدت تماما تقريبا النشاط التحفيزي.
وقد مكنت التطورات التكنولوجية الأخيرة طفرة في تسويق biotherapeutics المؤتلف، مما أدى إلى ارتفاع تدريجي في قيمتها السوقية في صناعة التكنولوجيا الحيوية. واحدة هذا التطور هو ظهور الهندسة الأيضية في الكائنات الحية الدقيقة المؤتلف، التي أظهرت وعدا كبيرا في تأسيس النظم الصناعي…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا البحث من قبل برنامج أبحاث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني) بتمويل من وزارة التربية والتعليم والعلوم والتكنولوجيا (جبهة الخلاص الوطني، 2013R1A1A2012159 وجبهة الخلاص الوطني، 2013R1A1A2007561)، جامعة كونكوك، وقسم الهندسة الكيميائية وMCubed برنامج في جامعة ميشيغان.
LB broth | Sigma Aldrich | L3022-6X1KG | |
Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758-10G | |
Tris base | Fisher | BP1521 | |
B-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma Aldrich | N7004-1G | |
L-Arabinitol | Sigma Aldrich | A3506-10G | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich | 168149 | |
Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 320501-500ML | |
Carbazole | Sigma Aldrich | C5132 | |
Ethanol | Fisher | BP2818-4 | |
Sodium alginate | Sigma Aldrich | W201502 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
Excella E24 shaker incubator | New Brunswick Scientific | ||
Cary 60 UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | ||
Centrifuge 5810R | Eppendrof | ||
Beakers | Fisher | ||
Syringe | Fisher | ||
Needle | Fisher | ||
Pioneer Analytical and Precision Weighing Balance | Ohaus |