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Neuroscience

आकलन करने में प्राथमिक Neurogenesis Published: April 12, 2016 doi: 10.3791/53949
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1
1The Healing Foundation Centre, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 2Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Craniofacial Development and Stem Cell Biology, Dental Institute, King's College London
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख वर्गों पर immunofluorescent धुंधला का उपयोग Xenopus भ्रूण के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विभिन्न न्यूरोनल सेल आबादी visualizing के लिए एक सुविधाजनक और तेजी से विधि प्रस्तुत करता है।

Introduction

रीढ़ में, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास के कई विशिष्ट अभी तक लगातार चरणों शामिल हैं। पहले कदम के तंत्रिका प्रेरण, जब भोली बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं को एक एपिडर्मल भाग्य के बजाय एक तंत्रिका भाग्य की ओर निर्दिष्ट कर रहे है। कई परस्पर विनियामक तंत्र Xenopus और अन्य मॉडल प्रणाली 1,2 में इस चरण के दौरान शामिल कर रहे हैं। इस प्रक्रिया में मुख्य रूप से इस तरह के chordin, नोगिन, और follistatin 3-7 के रूप में अंतर्निहित mesoderm द्वारा उत्पादित secreted कारकों द्वारा समन्वित है। तंत्रिका प्रेरण के बाद, तंत्रिका progenitors के एक सबसेट सेल चक्र से बाहर निकलें और एक प्रक्रिया के रूप में प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस करने के लिए भेजा में अंतर करने के लिए शुरू करते हैं। सभी न्यूरोनल व्यापारियों के इस समय में अंतर नहीं। शेष तंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत जिससे स्टेम सेल पूल विकास भर में और वयस्कता में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के निरंतर विकास के लिए आवश्यक बनाए रखने में बढ़ना जारी है।

ये जनसंपर्कतंत्रिका कोशिकाओं अग्रदूत oliferating sry (लिंग का पता लगाने क्षेत्र वाई) -box 3 (sox3) जीन 8-11 की उनकी अभिव्यक्ति की विशेषता है। कोशिकाओं के अन्य आबादी है, जो बाहर निकलने के सेल चक्र और एक विभेदित भाग्य के लिए प्रतिबद्ध है, भेदभाव जीन मार्कर, tubulin की अभिव्यक्ति, बीटा द्वारा पहचाने जाते हैं 2 बी वर्ग IIB (tubb2b, एन टब) और माइलिन प्रतिलेखन कारक 1 (myt1) 12-14। इस तरह के अलग-अलग neuronal कोशिकाओं अंततः सहित न्यूरॉन्स की विभिन्न श्रेणियों को जन्म देते हैं, लेकिन करने के लिए, मोटर सीमित नहीं है, अंतर है, और न्यूरल ट्यूब 15-17 के भीतर अलग-अलग क्षेत्रों में तैनात संवेदी न्यूरॉन्स।

जबकि महत्वपूर्ण प्रयास नियामक तंत्र है कि patterning और भाग्य पूर्वकाल neuroectoderm में घटनाओं का निर्धारण शासन को उजागर करने के लिए समर्पित कर दिया है, कम ध्यान तंत्रिकाजन्य कि घटनाओं के बाद हो जांच पर किया गया हैप्रारंभिक चरण patterning। दरअसल, संकेत पारगमन, ट्रांसक्रिप्शनल नियमों, साथ ही बाद translational संशोधनों यह सब बाद में मंच में शामिल कर रहे हैं, न्यूरोजेनेसिस 18-20 के दौरान दोनों समय और वंश विनिर्देश को नियंत्रित। इन तंत्रों में आगे की जांच के लिए एक विश्वसनीय विधि की आवश्यकता को आसानी से कल्पना और neuronal कोशिकाओं के विभिन्न आबादी भेद करने के लिए। उपर्युक्त सहित Sox3, Myt1 तंत्रिका मार्कर, और एन टब, इन अलग सेल आबादी की पहचान करने, इस प्रकार neuronal भेदभाव 21-23 की अंतर्निहित तंत्र खुलासा करने के लिए आवश्यक नींव प्रदान करने के लिए एक साधन प्रदान कर सकते हैं।

हालांकि न्यूरोनल सेल आबादी के अंतर लेबलिंग अन्य मॉडल जीवों में प्रदर्शन किया गया है, अपेक्षाकृत कुछ अध्ययनों से इस संबंध में अपनी पूरी करने के लिए Xenopus प्रणाली का शोषण किया है। इस संगत एंटीबॉडी के एक कमी है कि मज़बूती से विभिन्न Neur की पहचान करने के लिए मुख्य रूप से की वजह से हैन्यूरल ट्यूब में onal सेल आबादी। यहाँ, हम immunostaining, जो Xenopus में प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस की जांच के लिए एक मजबूत और सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है के माध्यम से जल्दी Xenopus भ्रूण में neuronal भेदभाव visualizing के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल चरण 26 और 45 के बीच मंच Xenopus केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के प्रारंभिक विकास में रुचि शोधकर्ताओं के लिए पर्याप्त मार्गदर्शन देना चाहिए।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों मैनचेस्टर पशु कल्याण केंद्र के विश्वविद्यालय से अनुमोदित किया गया है और एक ब्रिटेन के गृह मंत्रालय परियोजना लाइसेंस द्वारा कवर किया गया।

1. संग्रह और Xenopus भ्रूण का निर्धारण

  1. प्रयोगों के लिए अभिकर्मकों और सामग्री तैयार करें।
    1. 10x मार्क संशोधित Ringers (एमएमआर) लगभग 800 मिलीलीटर ultrapure पानी में सोडियम क्लोराइड का 56.5 ग्राम भंग और 1 एम KCl के शेयर समाधान जोड़ने, 1 एम MgSO 4, 1 एम 2 CaCl, और 1 एम HEPES पीएच 7.4 से तैयार एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए 20 मिमी KCl, 10 मिमी MgSO 4, 20 मिमी 2 CaCl, 50 मिमी HEPES की। 10 एम NaOH से 7.4 पीएच को समायोजित और फिर 1 एल अंतिम मात्रा को समायोजित
    2. 10x एमएमआर एक तरल चक्र पर 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा समाधान जीवाणुरहित। का उपयोग करने पर, 0.1x अंतिम एकाग्रता DDH 2 हे के साथ पतला और माइक्रोबियल विकास को बाधित करने के लिए 20 मिलीग्राम / एल gentamycin जोड़ें।
    3. मिश्रण 24 ग्राम Tris एचसीएल, 5.6 जी Tris-बी से 10x टीबीएस समाधान करेंएएसई, 88 ग्राम सोडियम क्लोराइड और लगभग 900 मिलीलीटर ultrapure पानी में भंग। अंतिम समाधान 7.6 चारों ओर एक पीएच मूल्य होगा। या तो 10 एम NaOH या केंद्रित एचसीएल के साथ समायोजित 1 एल को 7.6 की एक अंतिम पीएच और अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए
    4. अपॉन का उपयोग कर, ultrapure पानी के 9 भागों के साथ 10x टीबीएस समाधान के भाग 1 गिराए द्वारा 1x टीबीएस बनाते हैं।
    5. लगभग 800 मिलीलीटर ultrapure पानी में 209.2 छ MOPS भंग और 0.5 एम EGTA और 1M MgSO 4 के शेयर समाधान जोड़ने 20 मिमी EGTA, 10 मिमी MgSO 4 के अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने से 10x सदस्य नमक बनाने। 10 एम NaOH से 7.4 पीएच को समायोजित और फिर 1 एल अंतिम मात्रा को समायोजित
    6. एक तरल चक्र पर सदस्य नमक 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर autoclaving द्वारा समाधान जीवाणुरहित (समाधान कमरे के तापमान पर भंडारण के कुछ महीनों से पीले रंग की बारी कर सकते हैं या बाद यह autoclaved कर दिया गया है, लेकिन रंग में इस परिवर्तन के लिए इसके उपयोग को प्रभावित नहीं करता )। हालांकि, लंबे समय तक भंडारण (अधिक से अधिक 6 महीने) के बाद समाधान का उपयोग नहीं करते।
    7. 1x सदस्य बनाओसदस्य साल्ट के भाग 1, ultrapure पानी की 8 भागों (वी / वी, कम से कम 1-2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर) के साथ 37% formaldehyde के भाग 1 गिराए द्वारा एफए समाधान।
    8. 60 डिग्री सेल्सियस का हल 1x टीबीएस समाधान गर्मी की 100 मिलीलीटर में paraformaldehyde पाउडर के 4 ग्राम भंग करके (बाद phalloidin शामिल धुंधला के लिए) टीबीएस में 4% paraformaldehyde को तैयार है और भंग की सहायता के लिए 10 एम NaOH की कुछ बूँदें जोड़ें। 5-10 मिलीलीटर की मात्रा और -20 डिग्री सेल्सियस में फ्रीज में विभाज्य। फिर से स्थिर नहीं है एक बार thawed।
      चेतावनी: Paraformaldehyde पाउडर एक अड़चन है और, अगर साँस इस प्रकार वजन के कदम के लिए एक धूआं हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए विषैला होता है।
    9. संग्रहण नमूना करने से पहले पेंच टोपी के साथ के रूप में कई 4 मिलीलीटर कांच की शीशियों लेबल।
    10. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में (एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व गर्मी) 40% मछली जिलेटिन की 20 मिलीलीटर गिरने से 15% जिलेटिन / 15% सूक्रोज तैयार करें। सुक्रोज के 8 ग्राम जोड़ें और 1x टीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर लाइन के लिए ट्यूब भरें।
    11. एक रोटरी मिक्सर या रोलिंग बिस्तर पर जिलेटिन ट्यूब रखेंकमरे के तापमान पर रात भर मिश्रण करने के लिए। इस जिलेटिन समाधान 1 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है। समय सीमा समाप्त समाधान का उपयोग न करें और फ्रीज पिघलना नहीं है।
  2. तैयार है और एक्स फिक्स laevis या एक्स tropicalis भ्रूण संवर्धित वांछित चरणों।
    1. संस्कृति निषेचित एक्स laevis या एक्स tropicalis वांछित चरणों तक gentamycin साथ 0.1x एमएमआर में भ्रूण।
      नोट: आम तौर पर, चरण 40 के बाद के चरणों में 23 और 40 के भ्रूण के बाद संग्रह के बीच भ्रूण इकट्ठा संभव है, खासकर जब रीढ़ की हड्डी से axonal विकास देख, लेकिन लगता है कि अतिरिक्त जिलेटिन प्रवेश समय की आवश्यकता हो सकती है को ध्यान में रखना है। भ्रूण जंगली प्रकार, ट्रांसजेनिक, उत्परिवर्ती हो सकता है, अवरोध का इलाज, morpholino (एमओ) -injected, या 23,24 electroporated।
    2. प्रत्येक 4 मिलीलीटर कांच की शीशी में 20-50 भ्रूण लीजिए, जितना संभव हो उतना मध्यम हटाने और MEMFA के साथ बदलें।
      नोट: बाद में धुंधला phalloidin शामिल है, 4% paraformaldehyde का उपयोगMEMFA के बजाय बाद से वाणिज्यिक आपूर्ति की formaldehyde समाधान आमतौर पर एक स्थिरता कि phalloidin धुंधला के साथ हस्तक्षेप करेगा के रूप में करने के लिए 10% मेथनॉल होते हैं।
    3. कमरे के तापमान पर एक तात्कालिकता में अगर एक रोटरी मिक्सर पर 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठीक या। भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 सप्ताह के लिए निर्धारण समाधान में स्थिर हो जाएगा।
    4. निर्धारण के बाद, भ्रूण 0.05% ट्राइटन X-100 के साथ 1x टीबीएस का उपयोग कर 20 मिनट के लिए 3 बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, जितना संभव हो उतना टीबीएस ट्राइटन को हटा दें और प्रत्येक शीशी में 15% जिलेटिन / 15% sucrose के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. एक रोलर कमरे के तापमान पर रात भर बिस्तर पर शीशियों रखें। चरण 40 से अधिक पुराने भ्रूण के लिए, प्रवेश के समय का कम से कम 24 घंटा का उपयोग करें। प्रवेश के बाद, अगले दिन पर धारा 2.2 के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

2. बढ़ते और Xenopus भ्रूण की Cryosectioning

  1. प्रयोगों के लिए अभिकर्मकों और सामग्री तैयार करें।
    1. सकारात्मक Charg में से एक बॉक्स लेएड, स्लाइड आदर्श बंद।
      नोट: यदि खोला, (जैसे कि एक सूखी बॉक्स के रूप में) एक सूखी हालत में स्लाइड्स रखने के लिए और 1 महीने के भीतर का उपयोग स्लाइड्स पर स्थिर प्रभारी बनाए रखा है सुनिश्चित करने के लिए। अवधि समाप्त हो स्लाइड उपयोग करें, क्योंकि नमूने immunostaining के दौरान गिर जाएगा मत करो।
    2. पूर्व ठंड -30 डिग्री सेल्सियस cryostat चैंबर। microtome के लिए -35 डिग्री सेल्सियस और 12 माइक्रोन मोटाई के रूप में खंड साधन मानकों को निर्धारित करें। मंच पर मोटी कांच कवर प्लेट स्थापित करें और cryostat कम से कम 30 मिनट के लिए संतुलित पहले खंड शुरू होता है चलो।
    3. चलती खंड स्ट्रिप्स के लिए पेंटिंग ब्रश तैयार करें, cryostat कक्ष के अंदर रखने के लिए।
    4. , स्लाइड्स पर लिखने के लिए पेंसिल तैयार उन्हें कमरे के तापमान पर डाल दिया।
    5. cryosection दौरान दस्ताने पहनें। नंगे हाथों का प्रयोग न करें।
  2. Xenopus भ्रूण बढ़ते
    1. ध्यान से हवा के बुलबुले शुरू करने के बिना एक प्लास्टिक या कांच पिपेट का उपयोग कर कांच की शीशी से बाहर 5-10 भ्रूण aspirate। में भ्रूण स्थानांतरणबढ़ते चैम्बर के लिए और एक स्टिरियोस्कोप के तहत निरीक्षण करते हैं। खंड ब्लॉक की कठोरता सुनिश्चित करने के लिए जिलेटिन समाधान के साथ बढ़ते चैम्बर भरें।
    2. ठीक टिप संदंश की एक जोड़ी का उपयोग प्रति चित्रा 1 के रूप में भ्रूण की व्यवस्था। एक क्रायोजेनिक-संगत मार्कर का उपयोग चैम्बर के रिम पर एक तीर ड्राइंग द्वारा सिर के उन्मुखीकरण के निशान। भ्रूण के कई समूहों के लिए, साथ ही इसी चैम्बर के रिम पर प्रत्येक समूह का विवरण नीचे लिखें।
    3. ध्यान से एक फोम बॉक्स सूखी बर्फ के साथ आधा भरा में क्षैतिज चैम्बर जगह और ढक्कन बंद कर दें। 5-10 मिनट में बढ़ते चैम्बर फ्रीज का निरीक्षण करें। प्रत्येक कक्ष क्रमानुसार प्रक्रिया (यानी अगले एक को आगे बढ़ने से पहले पिछले चैम्बर सूखी बर्फ पर जगह) के रूप में यह प्रत्येक कक्ष के लिए पर्याप्त समय फ्रीज और भीड़ बनने के लिए सूखी बर्फ बॉक्स को रोकने के लिए छोड़ देंगे।
      नोट: जमे हुए बढ़ते कक्षों क्षैतिज खड़े करने की जरूरत नहीं है और बॉक्स के अंदर खड़ी की जा सकती है।
    4. cryosectioning के साथ आगे बढ़ें या, यदि आवश्यक हो, जमे हुए नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1-2 सप्ताह के लिए प्रतिरक्षाजनकता खोने के बिना रहते हैं।
  3. घुड़सवार Xenopus भ्रूण की cryosection
    1. (जैसे एक पेंसिल के रूप में) चैम्बर एक कुंद स्टिक के इस्तेमाल के नीचे दबाकर कक्ष से एक जमे हुए नमूना ब्लॉक निकालें।
    2. (एक पॉलीथीन ग्लाइकोल और polyvinyl शराब मध्यम युक्त) ऊतक ठंड माध्यम की कई बूँदें, नमूना पकड़े डिस्क पर जोड़ें और भ्रूण के पूर्वकाल अंत के साथ नमूना ब्लॉक माउंट (चित्रा 2) अंक ऊपर। mounted- ब्लॉक लगभग 1 मिनट के लिए या जब तक ऊतक ठंड मध्यम अपारदर्शी हो जाता है cryostat कक्ष के अंदर खड़े अनुमति दें।
    3. तुरंत सामना करना पड़ रहा नमूना ब्लॉक के नीचे की ओर से microtome पर नमूना पकड़े डिस्क स्थापित करें। एक ब्लेड का उपयोग करते समय नमूना ब्लॉक अभी भी अपेक्षाकृत "सॉफ्ट" है प्रत्येक अनुभाग की लंबाई कम करने के लिए नमूना ब्लॉक के एक हिस्से को बंद ट्रिम(अगर चाहा)। कम से कम 5 मिनट के लिए microtome पर नमूना पकड़े डिस्क छोड़ दो अपने तापमान संतुलन तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं।
    4. धीरे-धीरे नीचे नमूना ब्लॉक ट्रिम जब तक टैडपोल के प्रमुखों को पारदर्शी जिलेटिन के माध्यम से दिखाई दे रहे हैं। गति trimming बढ़ाने के लिए, (जैसे कि "ट्रिम" विकल्प को सक्षम करने के रूप में) इस स्तर पर खंड मोटाई (जैसे 20-25 माइक्रोन) के के एक उच्च (मोटा) सेटिंग लागू लेकिन बहुत मोटी नहीं है क्योंकि नमूना ब्लॉक नमूना पकड़े डिस्क से गिर सकता है । cryostat के प्रदर्शन का निरीक्षण, इस तरह के इस स्तर पर कुशाग्रता और ब्लेड के कोण के रूप में आने वाले खंड की एक लंबी पट्टी की पीढ़ी के लिए सुनिश्चित करें।
    5. एक बार जब मेढक सिर दिखाई देने लगते हैं, एक पेंट ब्रश का उपयोग कर वापस सामान्य (जैसे 10-12 माइक्रोन) के दोनों और microtome स्वच्छ और चरण के लिए cryostat की सेटिंग समायोजित करें। धीरे यकीन है कि तैयार स्लाइस एसटीआर फार्म कर सकते हैं बनाने के लिए हाथ पहिया सेटिंग का उपयोग (मोटर चालित सेटिंग का उपयोग नहीं करते हैं) एक परीक्षण के रूप में 2-3 वर्गों बनानेआईपीएस, ओवरलैपिंग या ब्लेड से चिपके नहीं।
    6. trimming तक टैडपोल के प्रमुखों के लगभग सामने आ रहे हैं (यह कुछ अनुभव है लेकिन प्राप्त आवश्यकता हो सकती है) जारी रखें। बंद ब्रश मंच पर किसी भी शेष वर्गों और नमूना वर्गों का संग्रह शुरू हो जाएगा।
    7. लगभग 10-15 वर्गों बनाने और उन्हें एक लंबी पट्टी के रूप में करते हैं।
    8. ओर करने के लिए मोटी कांच कवर प्लेट पर पलटें और धीरे से एक ठीक-टिप पेंट ब्रश का उपयोग ब्लेड से पट्टी हटाने और ब्लेड के लिए लंबे अक्ष समानांतर के साथ मंच पर यह व्यवस्था।
    9. कमरे के तापमान पर एक सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड, इसे जल्दी लेकिन दृढ़ता से नीचे का सामना करना पड़ लेबल पक्ष के साथ पट्टी पर उठाओ, एक पेंसिल (जो बाद में उपचार के दौरान धुंधला धुल नहीं होगा) के साथ लेबल, प्रेस और cryostat कक्ष से स्लाइड को हटा दें। यदि सही ढंग से किया है, पट्टी तुरंत सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड (चित्रा 3) के लिए रहना चाहिए।
    10. प्रत्येक गिरावट पर 20-30 स्लाइस है करने के लिए इस चरण को दोहराएँई और समानांतर (चित्रा 3 बी) में व्यवस्था की। यह एक्स के पूरे मस्तिष्क क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त है tropicalis भ्रूण और एक्स की अग्रमस्तिष्क के अधिकांश और मध्यमस्तिष्क क्षेत्रों भ्रूण laevis।
    11. 10 मिनट के लिए स्लाइड हवा शुष्क तुरंत आगे बढ़ना या एक स्लाइड बॉक्स में स्लाइड्स प्रतिरक्षाजनकता खोने के बिना कम से कम 3-6 महीने के लिए डिग्री सेल्सियस -80 पर स्टोर।

3. sectioned Xenopus भ्रूण की Immunostaining

  1. प्रयोगों के लिए अभिकर्मकों और सामग्री तैयार करें।
    1. 0.05% की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए 1x टीबीएस में ट्राइटन X-100 जोड़कर 0.05% टीबीएस ट्राइटन X-100 तैयार करें। यह समाधान 3-4 दिनों के लिए कमरे में अस्थायी पर स्थिर है। समय सीमा समाप्त समाधान का प्रयोग न करें।
    2. बफर अवरुद्ध के रूप में TBST में 5% गर्मी निष्क्रिय बकरी सीरम या 5% बीएसए तैयार करें। सबसे पहले, 30-60 मिनट के लिए एक 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में लगभग 20-30 मिलीलीटर सीरम की रखकर बकरी / भेड़ के बच्चे के सीरम गर्मी निष्क्रिय। 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र में अशेषट्यूब और -20 डिग्री सेल्सियस में फ्रीज। कोई फिर से निष्क्रियता का उपयोग करने पर आवश्यक है।
    3. TBST में गर्मी निष्क्रिय सीरम या बीएसए पतला उपयोग करने से पहले 5% की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए।
    4. (: 500 विरोधी Sox3 10,25 / 1: 250 विरोधी Myt1 26 / विरोधी acetylated ट्यूबिलिन जैसे 1) बफर अवरुद्ध में dilutions के अनुसार उचित प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें। प्रत्येक स्लाइड पर एंटीबॉडी समाधान के लगभग 100 μl का प्रयोग करें।
    5. बफर (: 500 आम तौर पर 1) को रोकने में उपयुक्त फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी (जैसे विरोधी माउस / खरगोश लाल फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित एंटीबॉडी) तैयार करें।
    6. actin नेटवर्क प्रकट करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण में: (वैकल्पिक) लाल फ्लोरोसेंट डाई संयुग्मित Phalloidin (500 1) जोड़ें।
    7. (वैकल्पिक) परमाणु स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण में DAPI (0.5 माइक्रोग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
    8. फ्रीजर से बाहर विरोधी फीका बढ़ते मध्यम लो और कमरे के तापमान नहाने के पानी में गल।
  2. immunostaining
    1. डिग्री सेल्सियस -80 से जमे हुए स्लाइड्स निकालें और कम से कम 1 घंटा किसी भी गाढ़ा पानी की बूंदों को खत्म करने के लिए है, तो एक साथ 85-90 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर सूखे स्लाइड सेंकना उन्हें एक वेंटिलेशन हुड के अंदर तौलिया कागज के एक टुकड़े पर जगह 15 मिनट के लिए सामना करना पड़ रहा स्लाइस आसंजन तंत्र को सक्रिय करने के लिए। अंत में, स्लाइड कमरे के तापमान को शांत (कम से कम 10 मिनट) की अनुमति है।
    2. शुद्ध एसीटोन के साथ धुंधला जार भरें और मछली जिलेटिन दूर करने के लिए 10 मिनट के लिए एसीटोन में स्लाइड्स सेते हैं। एकाधिक स्लाइड इलाज किया जा रहे हैं, उन्हें एक धुंधला रैक पर व्यवस्था। एक वेंटिलेशन हुड में 15 मिनट के लिए इलाज के रूप में स्लाइड हवा शुष्क। एसीटोन नहीं है फिर से उपयोग करें।
    3. ध्यान से नमूने को छूने के बिना एक पीएपी पेन का उपयोग कर स्लाइड पर नमूने के चारों ओर एक अंगूठी आकर्षित। सुनिश्चित करें कि अंगूठी आत्म संलग्न है, अन्यथा एंटीबॉडी समाधान धुंधला दौरान बाहर प्रवाह होगा। पूरी तरह से पीएपी कलम अंगूठी सूखी।
    4. ट्राइटन X-100 के बिना 1x टीबीएस के साथ एक और धुंधला जार भरें। inserधुंधला जार में सूखे के रूप में स्लाइड टी और कम से कम 1 घंटे के लिए पुनर्जलीकरण अनुमति देते हैं। इस बीच में, 5% अंतिम एकाग्रता 0.05% ट्राइटन X-100 के साथ 1x टीबीएस का उपयोग करने के लिए या तो गर्मी निष्क्रिय बकरी सीरम या बीएसए गिराए द्वारा अवरुद्ध बफर तैयार करते हैं।
    5. एक क्लिक ताला खाद्य बॉक्स के अंदर 1-2 6 अच्छी तरह प्लेटें रखकर एक गीला बॉक्स बनाओ और ultrapure पानी के साथ आधे रास्ते कुओं भरें। धुंधला जार से rehydrated स्लाइड निकालें और उन्हें (प्लेट ढक्कन के बिना) 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर क्षैतिज जगह है।
    6. ध्यान से पीएपी रिंग के अंदर बफर अवरुद्ध के 300-600 μl जोड़ें। स्थिति में ढक्कन बंद करके गीला बॉक्स को सील करने और कम से कम 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    7. अवरुद्ध बफर में उचित प्राथमिक एंटीबॉडी पतला। आम तौर पर, स्लाइड प्रति 100-150 μl पतला एंटीबॉडी समाधान का उपयोग करें। एकाधिक स्लाइड कार्रवाई कर रहे हैं, तो आनुपातिक मात्रा पैमाने पर।
    8. अवरुद्ध करने के बाद, ध्यान से आकांक्षा से स्लाइड से अवरुद्ध बफर हटाने और जल्दी से पी जोड़नेसूखी बाहर रोकने के लिए rimary एंटीबॉडी समाधान, तो गीला बॉक्स सील और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    9. अगले दिन, आकांक्षा से स्लाइड से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें। 0.05% ट्राइटन X-100, 3 बार, 15 मिनट प्रत्येक के साथ 1x टीबीएस के साथ भरा धुंधला जार में डालने से स्लाइड्स धो लें। इस बीच, बफर अवरुद्ध साथ (या DAPI या phalloidin के बिना) के साथ उचित फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी पतला।
    10. ध्यान से स्लाइड पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 100-150 μl जोड़ें। गीला बॉक्स के अंदर स्लाइड रखें और ढक्कन सील। कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए स्लाइड सेते हैं।
    11. 0.05% ट्राइटन X-100, 3 बार, 15 मिनट प्रत्येक के साथ 1x टीबीएस के साथ भरा धुंधला जार में स्लाइड्स धो लें। अंतिम धोने में 10 मिनट के लिए एक 50 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में विरोधी फीका बढ़ते मध्यम गल यदि -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को बढ़ते मध्यम शांत हो जाओ।
    12. पर बढ़ते मध्यम के लगभग 20 μl (एक बूंद) जोड़ेंस्लाइड और एक बड़े कवर पर्ची (कम से कम 22 मिमी x 64 मिमी) के नमूने पर लागू होते हैं। 6 घंटा के बाद बढ़ते भीतर फ्लोरोसेंट या confocal खुर्दबीन का उपयोग का निरीक्षण करें।
      1. इमेजिंग एक ही दिन में नहीं किया जा सकता है, तो नेल पॉलिश का उपयोग कर स्लाइड सील और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर गीला बॉक्स के अंदर उन्हें जगह है।
        नोट: विरोधी फीका बढ़ते मध्यम धीरे-धीरे कुछ दिनों के बाद ऑक्सीकरण जाएगा मिल (और भूरे बारी) तो यह जितनी जल्दी हो सके चित्र लेने के लिए सिफारिश की है।

Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम विभिन्न स्तरों, अर्थात् अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क, hindbrain, और रीढ़ की हड्डी, अलग एंटीबॉडी (चित्रा 4) के साथ दाग में मंच 30 Xenopus भ्रूण के पार वर्गों दिखा। के रूप में उल्लेख किया है, Sox3 लेबल जबकि MyT1 लेबल विभेदित प्राथमिक न्यूरॉन्स जावक विस्थापित और न्यूरल ट्यूब के सीमांत परत (बेसल पटल) के पास का पता लगाने न्यूरोनल पूर्वज सेल की आबादी, न्यूरल ट्यूब के लुमेन की निकटता में रेखांकित किया गया। एंटी-एसिटाइल ट्यूबिलिन विभेदित न्यूरॉन्स, जो पूरे न्यूरल ट्यूब के भीतर देखा जा सकता है में एक्सोन लेबल।

साइड विशिष्ट जीन पछाड़ना या overexpression तंत्रिका जीव विज्ञान में एक मोटे तौर पर इस्तेमाल किया विधि है कि क्या विशेष जीन (एस) की अभिव्यक्ति नियमन विकास और neuronal कोशिकाओं के भेदभाव को बाधित मूल्यांकन करने के लिए है। ऐसे मामलों में, या तो Morpholinos (राज्यमंत्री) या डीएनए का निर्माण (s) प्रो ले जाने Moter संचालित जीन (एस) के दो सेल चरण 23 से कम दो blastomeres में से एक में इंजेक्ट कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, वे मस्तिष्क वेंट्रिकल electroporation द्वारा पीछा किया, जो पछाड़ना में या अधिक अभिव्यक्ति वांछित जीन (एस) 27 के परिणाम देगा में इंजेक्ट किया जा सकता है। दोनों ही मामलों में, प्रभाव भ्रूण के एक तरफ करने के लिए प्रतिबंधित किया जाएगा, इलाज आंतरिक नियंत्रण के रूप में भ्रूण के विपरीत दिशा में कर रही है।

निर्धारण, सेक्शनिंग, और immunostaining के बाद, जीन पछाड़ना / अधिक अभिव्यक्ति के प्रभावों की गिनती और भ्रूण के दोनों किनारों पर विभिन्न आबादी के सेल नंबर की तुलना द्वारा मात्रा निर्धारित कर रहे हैं। कई भ्रूण से इन आंकड़ों जमते करके, सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है। हमारे प्रतिनिधि परिणामों में, कोई गड़बड़ी भ्रूण में बनाया गया था। जीन गड़बड़ी और विभिन्न न्यूरोनल सेल आबादी पर उनके प्रभाव के उदाहरण संदर्भों 20,23 में पाया जा सकता है।

टी "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> आकृति 1
चित्रा 1:। भ्रूण व्यवस्था और अभिविन्यास खंड सांचे में (ए) एक कार्टून बढ़ते विधानसभा दिखा चित्रण, ध्यान दें ट्रे तारीख, मंच, और भ्रूण के उन्मुखीकरण के साथ चिह्नित किया गया है। (बी) के बढ़ते विधानसभा का प्राकृतिक स्वरूप दिखा एक छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। अभिविन्यास और नमूना पकड़े डिस्क पर जिलेटिन ब्लॉक की स्थिति (ए) धारा ब्लॉक विधानसभा दिखा एक कार्टून चित्रण, ध्यान दें कि भ्रूण एक "ऊपर सिर" की स्थिति में हैं और जिलेटिन ब्लॉक मजबूती ओ तय हो गई हैइस आधार पर ऊतक ठंड माध्यम से नमूना पकड़े डिस्क Nto (देखें चित्र 2 बी)। (बी) धारा ब्लॉक विधानसभा का प्राकृतिक स्वरूप दिखा एक छवि, जिलेटिन ब्लॉक और नमूना पकड़े डिस्क के बीच ऊतक ठंड माध्यम का संचय ध्यान दें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। सतत सेक्शनिंग (ए) एक खंड कक्ष के मॉडल। नमूना पकड़े डिस्क घुमाया जाना चाहिए और निश्चित स्थिति है कि भ्रूण की ओर का सामना करना पड़ रहा है। कुछ (6-10) वर्गों के बाद, निरंतर अनुभाग टाइल्स की लंबी पट्टी धीरे ब्लेड (नीला) से अलग हो रहे हैं एक ठीक ब्रश का उपयोग कर, और उसके बाद होल्डिंग प्लेट पर 90 डिग्री बदल गया। तो एक कमरा अस्थायी सकारात्मक आरोप लगाया स्लाइड हैमजबूती से नीचे का सामना करना पड़ खंड पट्टी पर दबाया और तुरंत एकत्र समाप्त स्ट्रिप्स को ऊपर उठा लिया। (बी) आम तौर पर, प्रत्येक स्लाइड स्ट्रिप्स के 2 समानांतर लाइनों के रूप में दिखाया जा सकता है। पेंसिल का उपयोग कर स्लाइड लेबल पर विस्तृत रिकॉर्ड बनाने के लिए याद रखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: चरण 30 एक्स के पार अनुभाग तंत्रिका ऊतक में टैडपोल और धुंधला, 20X। (ए) Schematics Xenopus tadpoles पर की धारा विमानों के सापेक्ष पदों (अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क, hindbrain, और रीढ़ की हड्डी) का संकेत laevis। (बी) इसी पार वर्गों विरोधी Sox3 (लाल), विरोधी acetylated ट्यूबिलिन (Gree के साथ दागn), और DAPI (नीला), न्यूरल ट्यूब के भीतर तंत्रिका स्टेम सेल पूल के रूप में अच्छी तरह से neurofilaments के रिश्तेदार स्थानों दिखा। (सी) इसी पार वर्गों विरोधी MyT1 (लाल) और DAPI (नीला) के साथ दाग, न्यूरल ट्यूब के भीतर अलग-अलग प्राथमिक न्यूरॉन्स के रिश्तेदार स्थानों दिखा। स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहाँ हम Xenopus भ्रूण में प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस visualizing के लिए एक सुविधाजनक और कुशल विधि का प्रदर्शन। इस विधि तंत्रिका कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, न्यूरोनल स्टेम कोशिकाओं और विभेदित प्राथमिक न्यूरॉन्स सेल प्रकार विशिष्ट मार्कर का उपयोग कर के आकलन सहित परमिट।

प्रोटोकॉल आम तौर पर reproducibility के बहुत ही उच्च स्तर के साथ मजबूत है। भ्रूण कि पूर्व अंडे सेने के चरणों में हैं (यानी अप चरण के लिए 28), हम स्वयं निर्धारण करने से पहले पीतक झिल्ली को हटाने की सिफारिश के रूप में इस भ्रूण को पूरी तरह से निर्धारण से पहले फहरना करने के लिए अनुमति देता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब अपेक्षाकृत प्रारंभिक अवस्था में भ्रूण का संग्रह (सेने से पहले), के बाद से मुड़े भ्रूण बढ़ते कक्ष के अंदर वांछित अभिविन्यास में व्यवस्था करने के लिए बेहद मुश्किल हो जाता है। हम MEMFA या पीएफए ​​निर्धारण इसलिए अतिरिक्त प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम के बाद प्रतिरक्षाजनकता की हानि का अनुभव नहीं है इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक नहीं है। इसके अलावा, इसimmunostaining प्रक्रिया सीटू संकरण में chromogenic / फ्लोरोसेंट से नमूने में बाहर किया जा सकता है। ऐसे परिदृश्य में, यह बगल में संकरण प्रोटोकॉल के दौरान प्रोटीज कश्मीर उपचार कदम को छोड़ सिफारिश की है। chromogenic / फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के बाद, नमूने टीबीएस से धोया और MEMFA / पीएफए ​​तय नमूने के लिए एक समान तरीके से मछली जिलेटिन समाधान में एम्बेड किया जा सकता है। नमूना शीशियों एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर शीशियों यदि सीटू संकरण में फ्लोरोसेंट बाद में immunofluorescent धुंधला के साथ एक साथ imaged किया जाएगा द्वारा प्रकाश से सुरक्षित किया जा सकता है।

कुछ मामलों में, भ्रूण जिलेटिन प्रवेश के बाद जरूरत से ज्यादा हटना सकता है। यह सबसे अधिक संभावना या तो अपर्याप्त निर्धारण या अपर्याप्त टीबीएस ट्राइटन निकासी के कारण होता है। सुनिश्चित करें कि भ्रूण या कम से कम 2-3 घंटे के लिए पीएफए ​​/ MEMFA में तय किया गया है अधिमानतः 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर। समस्या बनी रहती है, 1 घंटे के लिए 3 को बढ़ाने टीबीएस ट्राइटन के समय धुलाई।

क्रायो धारा के दौराननिंग, नमूना ब्लॉक की कठोरता भिन्न हो सकते हैं मछली जिलेटिन के रूप में विभिन्न बैचों अलग गुण होते हैं। इस समस्या को आंशिक रूप से microtome का तापमान समायोजन करके मुआवजा दिया जा सकता है। एक कम तापमान एक "कठिन" नमूना ब्लॉक हालांकि अत्यधिक कम तापमान के तहत नमूना ब्लॉक कुरकुरा और इस खंड के लिए मुश्किल हो जाता है में परिणाम होगा। कुछ ठीक ट्यूनिंग या अभ्यास प्रत्येक सेक्शनिंग से पहले (भ्रूण के बिना नकली नमूना ब्लॉकों का उपयोग) लाभकारी विशेष रूप से महत्वपूर्ण नमूनों पर उपयोग करने से पहले हो सकता है।

सेक्शनिंग के दौरान एक अधिक सामना करना पड़ा समस्या पतली वर्गों कभी कभी मोटी कांच की प्लेट पर छड़ी करने के बजाय स्टील मंच पर फ्लैट रहने के लिए करते हैं। यह विशेष रूप से बाधा पहुँचा के बाद से यह लगातार निरंतर सेक्शनिंग प्रक्रिया बीच में आता है हो सकता है। खंड कक्ष और (विशेष रूप से) मोटी कांच की प्लेट मशीन और ओ पर काफी ठंडा, या अत्यधिक स्थिर प्रभार नहीं किया जा रहा है: इस तरह के मामलों में आमतौर पर दो कारणों से एक के कारण होता हैperator, विशेष रूप से शुष्क मौसम में। पूर्व नीचे अनुभाग चैम्बर के तापमान मोड़ और अतिरिक्त समय (संभवतः रातोंरात) के लिए भीतर कांच की प्लेट छोड़ने करके हल किया जा सकता है; और ठीक से cryostat ग्राउंडिंग द्वारा उत्तरार्द्ध। एक धातु नल या इसी तरह पानी ट्यूबिंग प्रणाली धातु से बना करने के लिए cryostat की धातु की सतह कनेक्ट स्थिर प्रभार जारी करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका हो सकता है। प्रत्येक उपयोग के बाद, मोटी कांच की थाली, गैर संक्षारक डिटर्जेंट (जैसे तरल dishwashing के रूप में), ultrapure पानी से rinsed के साथ अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए शुद्ध इथेनॉल के साथ छिड़काव किया, और हानिकारक से सतह और किनारों की रक्षा के लिए तौलिया कागज में लिपटे।

प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध एंटीबॉडी आम तौर पर विशिष्ट हैं और हम शायद ही कभी अविशिष्ट सोखना या उच्च पृष्ठभूमि संकेत मुठभेड़। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, अवरुद्ध एजेंट, अत्यधिक गर्मी निष्क्रियता (के रूप में सीरम में शराबी तेज़ के गठन के द्वारा कल्पना) के रूप में गर्मी निष्क्रिय बकरी / भेड़ के बच्चे के सीरम का उपयोग करता है, तो चाहिएइस तेज़ रूप में बचा जाना अत्यधिक माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए आकर्षक है और उच्च पृष्ठभूमि का एक स्रोत के लिए योगदान कर सकते हैं।

यह संभव है, और कभी कभी, वांछित एक साथ neuronal कोशिकाओं के विभिन्न आबादी कल्पना करने के लिए डबल-धुंधला करने के लिए। ऐसे डबल धुंधला संभव है और आम तौर पर निम्नलिखित संयोजन के साथ संतोषजनक परिणाम देता है: Sox3 / एन-टब या Myt1 / एन-टब। हालांकि, Sox3 और Myt1 की डबल धुंधला तथ्य यह है कि दो एंटीबॉडी खरगोश मूल से दोनों कर रहे हैं से जटिल है। हम संभवतः माध्यमिक एंटीबॉडी से संकेत प्रवर्धन की कमी के कारण, कई एंटीबॉडी प्रत्यक्ष लेबलिंग किट, लेकिन कोई संतोषजनक परिणाम मनाया गया (कम संकेत करने वाली शोर स्तर) का परीक्षण किया है। इस समस्या को नाकाम करने के लिए एक संभव दृष्टिकोण के रूप में नीचे चर्चा की, Xenopus में ट्रांसजेनिक लाइनों को बढ़ाने के लिए किया जाएगा।

इस प्रोटोकॉल के मुख्य प्रतिबंध की है कि है, जबकि इस प्रोटोकॉल सकता है पर्याप्त di हैneuronal कोशिकाओं के दो मुख्य पूल stinguish, अर्थात्, Sox3 व्यक्त तंत्रिका स्टेम सेल पूल और Myt1 व्यक्त विभेदित न्यूरॉन्स, यह भेदभाव न्यूरॉन्स के विभिन्न उप आबादी को प्रकट करने की क्षमता का अभाव है। इस तरह के उप आबादी है, जो भी शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं हैं, प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स, इन्तेर्नयूरोंस, और संवेदी न्यूरॉन्स, आम तौर पर उनके विभिन्न व्यक्त मार्कर जीन 28-30 की विशेषता है। जैसा कि ऊपर कहा, सीटू Xenopus भ्रूण में एंटीबॉडी आधारित immunofluorescence पहचान पद्धति के साथ संयुक्त संकरण में बहुरंगा के विकास में हाल के अग्रिमों के संभावित जांच के लिए 31 विभेदित न्यूरॉन्स की इन उप आबादी प्रकट करने के अंतराल में भर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, के रूप में चूहों मॉडल में प्रदर्शन किया गया है, यह भी Xenopus में इस तरह के अलग सेल आबादी भेद करने के लिए सेल प्रकार विशिष्ट एंटीबॉडी के एक अधिक व्यापक सेट को बढ़ाने के लिए वांछित किया जाएगा।

यह हैयह भी उल्लेख के लायक है कि इस विधि के लिए एक अतिरिक्त के रूप में, इस तरह के multiphoton माइक्रोस्कोपी, 3 डी पुनर्निर्माण, और विभाजन के रूप में ऑप्टिकल इमेजिंग और छवि विश्लेषण में हाल के अग्रिमों, भी के बाद प्रारंभिक आकलन Xenopus oocytes की अधिक व्यापक टिप्पणियों के साथ ही लक्ष्य को हासिल करने के लिए लागू किया जा सकता जल्दी भ्रूण, विशेष रूप से एक जीवित 32,33 स्थापना के अंतर्गत। इसलिए, प्रसार, भेदभाव, और जीवित पशुओं में neuronal कोशिकाओं के आंदोलन को ट्रैक करने के लिए, यह एक या अधिक ट्रांसजेनिक लाइनों है कि सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटर द्वारा संचालित फ्लोरोसेंट प्रोटीन बंदरगाह जल्दी Xenopus में इस तरह के सेल आबादी का जीना अवलोकन अनुमति देने के लिए स्थापित करने के लिए वांछित किया जाएगा भ्रूण। एक एक्स की स्थापना न्यूरो विशिष्ट β ट्यूबिलिन प्रमोटर tauGFP और उसके आवेदन ड्राइविंग के साथ laevis लाइन एक अच्छा उदाहरण 23,34 प्रदान की है। दोनों sox3 और myt1 रीढ़ 35-37 में विशेषता से भरा प्रमोटर दृश्यों के साथ, यह श हैअपेक्षाकृत Xenopus में अतिरिक्त ट्रांसजेनिक लाइनों जो दोनों Xenopus सामुदायिक और प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस अनुसंधान के एक अधिक सामान्य क्षेत्र के लिए बड़े पैमाने पर योगदान देना चाहिए स्थापित करने के लिए आसान हो सकता है ould।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हमारा अनुरोध विरोधी Sox3 और विरोधी Myt1 एंटीबॉडी उपलब्ध कराने के लिए क्रमश: बोल्डर में कोलोराडो विश्वविद्यालय में प्रोफेसर माइकल Klymkowsky और मैनचेस्टर विश्वविद्यालय में प्रो नैन्सी Papalopulu धन्यवाद। हम इस प्रोटोकॉल के विकास में उनके व्यावहारिक सुझाव के लिए Papalopulu प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद। इस काम के SZ और जीएल के लिए दो हीलिंग फाउंडेशन Studentships द्वारा समर्थित किया गया था, हीलिंग फाउंडेशन SZ / ईए और जीएल / ईए क्रमश: ईए के लिए वेलकम ट्रस्ट (WT082450MA) से एक कार्यक्रम अनुदान के लिए, और एक संस्थागत सामरिक सहायता अनुदान से दो परियोजना अनुदान वेलकम ट्रस्ट [097820 / Z / 11 / Z] से।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentamicin  Sigma-Aldrich G1397
Tris-HCl  Sigma-Aldrich T3253
Tris-base Sigma-Aldrich T1503
NaCl  Sigma-Aldrich S7653
KCl Sigma-Aldrich 746436
MgSO4 Sigma-Aldrich 746452
CaCl2 Sigma-Aldrich 793639
HEPES Sigma-Aldrich H3375
MOPS Sigma-Aldrich RDD003
EGTA Sigma-Aldrich E3889
37% formaldehyde  Sigma-Aldrich F8775
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich G7765
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport VWR EMB-200-015A
Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport VWR EMB-200-010K
Superfrost Plus slides ThermoFisher 12-550-15
Tissue Freezing Medium (OCT) Leica  14020108926
Cryostat Leica  CM3050
Gloves
Dry Ice
Triton X-100  Sigma-Aldrich X100
 85-90 °C Heat block
PAP pen Sigma-Aldrich Z377821
Acetone, analytical grade
Staining jar with slide racks
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)
anti-acetylated tubulin Sigma-Aldrich T7451
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) Cell Signaling 4408
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) Cell Signaling 4413
Alexa Fluor® 647 Phalloidin Cell Signaling 8940
DAPI Cell Signaling 4083
ProLong Gold Antifade Mountant Life Technologies P36930

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तंत्रिका विज्ञान अंक 110, सीएनएस विकास immunostaining neuronal भेदभाव प्राथमिक न्यूरोजेनेसिस
आकलन करने में प्राथमिक Neurogenesis<em&gt; Xenopus</em&gt; भ्रूण का उपयोग Immunostaining
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Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E. Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining. J. Vis. Exp. (110), e53949, doi:10.3791/53949 (2016).

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