이 문서 섹션에 면역 형광 염색법을 사용하여 Xenopus의 배아의 중추 신경계에서 다른 신경 세포 집단을 시각화 편리하고 빠른 방법을 제시한다.
Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.
척추 동물에있어서, 중추 신경계의 발달은 여러 독특한 아직 연속 단계를 포함한다. 첫 번째 단계는 나이브 외배엽 세포는 신경 운명보다는 표피 운명 향해 지정되는 신경 유도된다. 여러 상호 규제 메커니즘 Xenopus의 다른 모델 시스템 1, 2에서이 단계에서 참여하고 있습니다. 이 과정은 주로 chordin, 소량 및 follistatin의 3-7로서 기본이되는 중배엽에 의해 생성 분비 요인에 의해 조정된다. 신경 유도 후, 신경 전구 세포의 서브 세트는 세포주기를 종료하고 주 신경 지칭되는 과정에서 구분하기 시작한다. 모든 신경 전구체이 시점에서 구별되지 않습니다. 나머지 신경 전구 세포를 개발함으로써 전역 성인기에 중추 신경계의 지속적인 성장에 필요한 줄기 세포의 풀을 유지하고 증식하는 것을 계속한다.
이러한 홍보신경 전구 세포를 oliferating하는 SRY (섹스 결정 지역 Y) -box 3 (sox3) 유전자 8-11의 발현을 특징으로한다. 차별화 된 운명에 투입 출구 세포주기 및 세포의 다른 인구는, 분화 유전자 마커, 튜 불린의 표현, 베타에 의해 식별됩니다 2B 클래스 IIB (tubb2b, N-욕조) 및 수초 전사 인자 1 (myt1) 12-14. 그러한 분화 된 신경 세포는 결국 포함 뉴런의 다양한 카테고리를 야기하지만, 모터에 한정되지 않고, 인터페이스와 신경관 15-17 내에 뚜렷한 영역에 위치하는 감각 뉴런.
상당한 노력이 앞쪽에 neuroectoderm 이벤트를 결정하는 패터닝과 운명을 지배하는 규제 메커니즘을 폭로에 전념되었지만, 적은주의는 다음 발생하는 신경 인성 사건을 조사에 이루어진 것으로,초기 패터닝 단계. 실제로, 신호 전달, 전사 규정뿐만 아니라, 번역 후 변형은 모든 신경 18-20 중 둘 타이밍 리니지 사양 제어,이 이후 단계에 포함된다. 이러한 메커니즘에 추가 조사를 쉽게 시각화하고 신경 세포의 다른 집단과 구별하기 위해 신뢰할 수있는 방법이 필요합니다. Sox3, Myt1 포함한 신경 마커를, 상술의, 그리고 N-욕조, 따라서 신경 분화 21-23의 기본 메커니즘을 드러내는에 필요한 기반을 제공하고, 서로 다른 세포 집단을 식별하기위한 수단을 제공 할 수있다.
신경 세포 집단의 차동 라벨링 다른 유기체 모델에서 입증되었지만, 비교적 소수의 연구가 이러한 관점에서 최대한으로 Xenopus의 시스템을 이용했다. 이 확실 다양한 neur 식별 호환 항체 소수 주로 기인신경 튜브도 그러 세포 집단. 여기, 우리는 제노 푸스에서 차 신경을 조사하기위한 강력하고 편리한 방법을 제공 면역 염색을 통해 초기 Xenopus의 배아에서 신경 세포의 분화를 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 단계 26 단계 (45) 사이에 Xenopus의 중추 신경 시스템의 초기 개발에 관심이있는 연구자에 대한 충분한 지침을 제공한다.
여기에서 우리는 Xenopus의 배아에서 차 신경을 시각화하는 편리하고 효율적인 방법을 보여줍니다. 이 방법은 세포 형 특이 적 마커를 사용하여 신경 줄기 세포 및 분화 된 신경 세포를 포함한 차 신경 세포의 종류의 평가를 허용한다.
프로토콜은 재현성이 매우 높은 수준으로 일반적으로 강하다. 사전 부화 단계에있는 배아의 경우 (즉, 최대 28 단계로), 이것은 태아가 완전히 고정하기 전에 펴다 할 수 있도록 우리가 수동으로 이전의 고정에 난황 막을 제거하는 것이 좋습니다. 절곡 배아 실장 챔버 내부의 원하는 방향으로 배열하는 것이 매우 곤란하기 때문에, (부화 전에) 비교적 초기 단계 배아를 수집 할 때 특히 중요하다. 우리는 MEMFA 또는 PFA 고정 따라서 추가 항원 검색 단계 후 면역 원성의 손실을 경험하지이 프로토콜에 대한 필요가 없습니다했다. 또한, 본면역 염색 과정은 계내 혼성화에 발색 / 형광 샘플에서 수행 될 수있다. 이러한 시나리오에서, 원위치 혼성화 프로토콜 동안 프로테아제 K 처리 단계를 생략 할 것을 권장한다. 형광 / 발색 기질의 반응 후, 샘플을 TBS로 세척 할 수 있고, MEMFA / PFA 고정 샘플을 유사한 방식으로 어류 젤라틴 수용액에 매립. 샘플 튜브는 원위치 혼성화 형광 나중에 면역 염색과 함께 이미징 될 경우 알루미늄 호일에 튜브를 배치하여 빛으로부터 보호 할 수있다.
일부의 경우, 배아 젤라틴 침투 후 지나치게 수축된다. 이것은 가능성이 어느 부족 고정 또는 불충분 한 TBS-트리톤 추출로 인해 발생합니다. 배아는 적어도 2 ~ 3 시간 동안 PFA / MEMFA에 고정 바람직 밤새 4 ° C에서되었는지 확인합니다. 문제가 지속되면, 1 시간 동안 3 TBS-트리톤의 세탁 시간을 증가시킨다.
극저온 SECTIO 중닝는 샘플 블록의 강성은 생선 젤라틴 등 다양한 배치가 서로 다른 특성이 다를 수 있습니다. 이 문제는 부분적으로 마이크로톰의 온도를 조정함으로써 보상 될 수있다. 낮은 온도는 샘플 블록 섹션에 선명하고 어려워진다 그러나 과도한 저온 아래에 "열심히"샘플 블록에서 발생합니다. 각각의 단면 전 (배아없이 모의 샘플 블록을 사용하여) 일부 미세 조정 또는 관행은 특히 유용 샘플에 사용하기 전에 도움이 될 수 있습니다.
절편시 일반적으로 발생하는 문제는 얇은 섹션 때때로 두꺼운 유리 접시에 스틱이 아닌 스틸 무대에 평평하게 유지하는 경향이있다. 이것은 연속 절편 프로세스를 중단 때문에 특히 방해가 될 수있다. 섹션 챔버 (특히) 두꺼운 유리판 기계와 오에 충분한 감기, 또는 과도한 정전기없는 : 이러한 경우는 일반적으로 두 가지 이유 중 하나에 의해 발생특히 건조한 날씨에 perator. 전자는 부 챔버의 온도를 낮추는 여분 시간 (아마도 밤새) 미국 내 유리판을 남김으로써 해결 될 수있다; 제대로 저온 유지 장치를 접지하여 후자. 금속 탭 또는 금속제의 유사 물 튜브 시스템으로 저온 유지 장치의 금속 표면을 연결하면 정전기를 방출하는 다른 방법 일 수있다. 사용 후, 두꺼운 유리판을, 초순수에 의해 세정 (예 주방용 액체와 같은) 비 부식성 세제로 잘 세척한다 순수 에탄올을 분무하고, 손상 표면과 에지를 보호하기 위해 수건 종이에 싸서.
프로토콜에 열거 된 항체는 일반적으로 특정하고 우리는 거의 비특이적 흡착 또는 높은 배경 신호가 발생하지 않습니다. 그것은 주목해야한다해야 차단제 (혈청 무성한 침전물의 형성에 의해 가시화로) 과도한 열 불 활성화로 열 불 활성화 염소 / 양고기 혈청을 사용하는 경우, 그이 침전제로 피할 수 이차 항체에 매우 매력과 높은 배경의 소스에 기여할 수있다.
이 가능하고, 때때로 동시에 신경 세포의 개체군을 시각화 이중 염색을 수행하기 원하는. 이러한 이중 염색이 가능하며 일반적으로 다음과 같은 조합으로 만족스러운 결과를 제공합니다 Sox3 / N-욕조 또는 Myt1 / N-욕조. 그러나 Sox3 및 Myt1의 이중 염색은이 항체가 토끼 원점에서 둘 다 사실에 의해 복잡하다. 우리는 가능성으로 인해 이차 항체에서 신호 증폭의 부족으로 여러 항체 직접 라벨 키트, 그러나 더 만족스러운 결과를 (낮은 신호 대 잡음 레벨) 관찰되지 않았다을 테스트했습니다. 이 문제를 회피하기위한 하나의 가능한 방법은 후술하는 바와 같이, Xenopus의 형질 전환 라인을 마련하는 것이다.
이 프로토콜의 주요 제한 사항 중 하나는, 그 동안이 프로토콜 할 수 충분히 디입니다신경 세포의 두 가지 풀 stinguish, 즉 Sox3 발현하는 신경 줄기 세포의 풀과 Myt1 발현 분화 신경 세포는 분화 신경 세포는 다른 하위 집단을 표시하는 능력이 부족하다. 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다 하위 집단, 일차 운동 뉴런의 interneurons 및 감각 뉴런은 보통 차등 발현 마커 유전자 (28-30)을 특징으로한다. 위에서 언급 한 바와 같이, Xenopus의 배아에서 항체 기반의 면역 검출 방법과 함께 현장 하이브리드에 여러 가지 빛깔의 개발에 최근의 발전 가능성 조사 (31)에 대한 차별화 된 신경 세포의 이러한 하위 집단을 나타 내기 위해 격차를 입력 할 수 있습니다. 다르게는, 생쥐 모델에서 입증 된 바와 같이, 또한 Xenopus의 그러한 다른 세포 집단을 구별하는 세포 유형 특이 적 항체의 더 포괄적 인 세트를 발생하는 것이 바람직 할 것이다.
그것은이다또한 가치가이 방법에 추가로, 그 언급, 이러한 광자 현미경, 3 차원 재구성 및 분할 등의 광학 이미징 및 이미지 분석 최근 발전은 또한 초기 평가는보다 포괄적 인 Xenopus의 난 모세포의 관찰뿐만 아니라 달성 한 후 적용 할 수 있습니다 특히 32, 33을 설정하는 라이브에서 초기 배아. 따라서, 증식, 분화, 살아있는 동물에서 신경 세포의 움직임을 추적하기 위해서는 초기 Xenopus의 이러한 세포 집단의 실시간 관찰을 허용하는 세포 유형 특이 적 프로모터에 의해 구동되는 형광 단백질 항구 하나 이상의 형질 전환 라인을 확립하는 것이 바람직 할 것이다 배아. X의 설립 tauGFP 및 응용 프로그램을 구동 신경 특정 β-tubulin의 프로모터와 laevis의 라인은 좋은 예 23,34를 제공하고 있습니다. sox3 및 척추 동물 35-37 특징 myt1 모두의 전체 프로모터 서열, 그것은 쉬입니다Xenopus의 커뮤니티와 주요 신경 연구의 일반적인 필드 모두에 광범위하게 기여해야 Xenopus의 추가적인 유전자 변형 라인을 설정하기가 비교적 쉬운 울드.
The authors have nothing to disclose.
우리는 친절 각각 반 Sox3 및 안티 Myt1 항체를 제공하기 위해 맨체스터 대학에서 볼더의 콜로라도 대학에서 교수 마이클 Klymkowsky 교수 낸시 Papalopulu 감사합니다. 우리는이 프로토콜을 개발하는 그들의 통찰력 제안에 대한 Papalopulu 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 SZ 및 JL 두 가지 치유 재단 Studentships에 의해 지원되었으며, SZ / EA 각각 JL / EA, EA의 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) (WT082450MA)에서 하나의 프로그램 보조금을 치유 재단, 한 기관의 전략적 지원 보조금에서이 프로젝트 보조금 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) [097820 / Z / 11 / Z]에서.
gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Base Mould Disposable 15Mm X 15Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
Base Mould Disposable 7Mm X 7Mm X 5Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Gloves | |||
Dry Ice | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
85-90°C Heat block | |||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Acetone, analytical grade | |||
Staining jar with slide racks | |||
Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |