Summary
I denna artikel presenteras en bekväm och snabb metod för att visualisera olika neuronala cellpopulationer i det centrala nervsystemet hos Xenopus embryon med hjälp av immunofluorescerande färgning på sektioner.
Introduction
I ryggradsdjur, utvecklingen av det centrala nervsystemet består av flera distinkta men på varandra följande steg. Det första steget är neural induktion, när naiva ektodermala celler specificeras mot en neural öde i stället för en epidermal öde. Flera sammankopplade regleringsmekanismer är involverade under denna fas i Xenopus och andra modellsystem 1,2. Denna process är i första hand samordnas av utsöndrade faktorer som produceras av den underliggande mesoderm, såsom chordin, noggin, och follistatin 3-7. Efter neural induktion, en delmängd av neurala stamceller ur cellcykeln och börjar differentiera i en process som kallas primär neurogenes. Inte alla neuronala prekursorer skilja vid denna tidpunkt. De återstående neurala prekursorceller fortsätter att föröka sig och därmed bibehålla stamcells poolen behövs för fortsatt tillväxt av det centrala nervsystemet under utveckling och i vuxen ålder.
dessa proliferating neurala prekursorceller kännetecknas av sin expression av SRY (kön bestämmande region Y) -box 3 (sox3) -genen 8-11. Den andra populationen av celler, som lämnar cellcykeln och engagera sig i en differentierad öde, identifieras genom uttrycket av differentiering genmarkörer, tubulin, beta 2B klass IIb (tubb2b, N-tub) och myelin transkriptionsfaktor 1 (myt1) 12-14. Sådana differentierade neuronala celler så småningom ge upphov till olika typer av nervceller, inklusive, men inte begränsat till, motor, internationell och sensoriska neuroner placerade i olika områden inom neuralröret 15-17.
Även om stora ansträngningar har gjorts för att upptäcka de regleringsmekanismer som styr mönstring och ödet bestämma händelser i den främre neuroectoderm har mindre uppmärksamhet gjorts på att undersöka de neurogena händelser som inträffar efterinitial mönstring skede. I själva verket, signaltransduktion, transkriptions regler, liksom posttranslationella modifieringar är alla involverade i detta senare skede styra både timing och härstamning specifikation under neurogenesis 18-20. Fortsatta undersökningar om dessa mekanismer kräver en tillförlitlig metod för att enkelt visualisera och särskilja olika populationer av neuronala celler. Ovannämnda neurala markörer, inklusive Sox3, Myt1, och N-tub, kan vara ett sätt för att identifiera dessa olika cellpopulationer, vilket ger den nödvändiga grunden för att avslöja de bakomliggande mekanismerna för neuronal differentiering 21-23.
Även differentiell märkning av neuronala cellpopulationer har visats i andra modellorganismer, har relativt få studier utnyttjas Xenopus-systemet till fullo i detta avseende. Detta beror främst på en brist på kompatibla antikroppar som på ett tillförlitligt sätt identifiera de olika neuronal cellpopulationer i neuralröret. Här beskriver vi en metod för att visualisera neuronal differentiering i tidiga Xenopus embryon via immunofärgning, vilket ger en robust och praktisk metod för att undersöka primär neurogenes i Xenopus. Detta protokoll bör ge tillräcklig vägledning för forskare som är intresserade av den tidiga utvecklingen av Xenopus centrala nervsystemet mellan steget 26 och steget 45.
Protocol
Alla djurförsök godkändes från University of Manchester Animal Welfare Centre och täcktes av ett brittiskt Home Office Project License.
1. Insamling och Fixering av Xenopus embryon
- Förbered Reagens och material för experiment.
- Förbereda 10x Marc Modified Ringers (MMR) genom upplösning av 56,5 g NaCl i ca 800 ml ultrarent vatten och tillsats av förrådslösningar av 1 M KCl, 1 M MgSO 4, 1 M CaCl2 och 1 M HEPES pH 7,4 för att uppnå en slutlig koncentration av 20 mM KCl, 10 mM MgSO 4, 20 mM CaCl2, 50 mM HEPES. Justera pH till 7,4 med 10 M NaOH och därefter justera den slutliga volymen till 1 L.
- Sterilisera 10x MMR lösningen genom autoklavering vid 121 ° C under 20 min på en vätskecykel. Vid användning av, späd med DDH 2 O till 0,1 x slutlig koncentration och tillsätt 20 mg / L gentamycin för att inhibera mikrobiell tillväxt.
- Göra 10x TBS-lösning genom att blanda 24 g Tris-HCl, 5,6 g Tris-base, 88 g NaCl och upplösning i ca 900 ml ultrarent vatten. Den slutliga lösningen kommer att ha ett pH-värde runt 7,6. Justera med antingen 10 M NaOH eller koncentrerad HCl för att uppnå ett slutligt pH av 7,6 och den slutliga volymen till 1 L.
- Vid användning gör 1x TBS genom att späda en del av 10x TBS-lösning med 9 delar av ultrarent vatten.
- Göra 10x MEM Salt genom att lösa 209.2 g MOPS i cirka 800 ml ultrarent vatten och tillsats av förrådslösningar av 0,5 M EGTA och 1 M MgSO 4 för att uppnå en slutlig koncentration av 20 mM EGTA, 10 mM MgSO 4. Justera pH till 7,4 med 10 M NaOH och därefter justera den slutliga volymen till 1 L.
- Sterilisera MEM saltlösningen genom autoklavering vid 121 ° C under 20 min på en vätskecykel (lösningen kan bli gul med några månaders lagring vid rumstemperatur eller efter att den har autoklaveras, men denna förändring i färg påverkar inte dess användning ). Men använd inte lösningen efter långvarig lagring (mer än sex månader).
- Göra 1x MEMFA-lösning genom att späda en del av MEM Salter, en del av 37% formaldehyd med 8 delar Ultrarent vatten (volym / volym, stabila vid 4 ° C under åtminstone 1-2 veckor).
- Förbered 4% paraformaldehyd i TBS (för efterföljande färgning innebär falloidin) genom att lösa 4 g paraformaldehyd pulver i 100 ml 1x TBS lösning Värm lösningen till 60 ° C och tillsätt några droppar 10 M NaOH för att underlätta upplösning. Delprov i 5-10 ml volym och frysa i -20 ° C. Återanvänd inte frysa en gång tinats.
VARNING: Paraformaldehyd pulver är en irriterande och är giftig vid inandning, vilket vägnings steg ska utföras i ett dragskåp. - Märk så många 4 ml glasflaskor med skruvlock före provtagningen.
- Förbered 15% gelatin / 15% sackaros genom att hälla 20 ml av 40% fiskgelatin (pre-värme i en 50 ° C vattenbad) i en 50 ml centrifugrör. Tillsätt 8 g sackaros och fylla röret till 50 ml linje med 1x TBS.
- Placera gelatin röret på en roterande bländare eller rullande sängatt blanda över natt vid rumstemperatur. Denna gelatinlösning är stabil vid 4 ° C under en vecka. Använd inte utgångna lösning och inte frysning och upptining.
- Förbered och Fix X. laevis eller X. tropic Embryon odlade till önskad steg.
- Kultur det befruktade X. laevis eller X. tropic embryon i 0,1 x MMR med gentamycin tills önskat steg.
OBS: I allmänhet, samla embryon mellan stegen 23 och 40. Senare insamling av embryon efter steg 40 är möjligt, särskilt när man observerar axonal tillväxt från ryggmärgen, men tänk på att ytterligare gelatin genombrottstid kan behövas. Embryona kan vara av vildtyp, transgena, mutant, inhibitor-behandlade, morfolino (MO) -inmatade, eller elektroporer 23,24. - Samla 20-50 embryon i varje 4 ml glasflaska, ta bort så mycket medel som möjligt och ersätta med MEMFA.
OBS: Om efterföljande färgning innebär falloidin, använd 4% paraformaldehydistället för MEMFA eftersom kommersiella medföljande formaldehydlösningar innehåller vanligtvis upp till 10% metanol som stabilisator som kommer att störa phalloidin färgning. - Fixa över natten vid 4 ° C eller, om i ett brådskande fall, vid rumstemperatur under 2 h på en roterande bländare. Embryona kommer att vara stabil i fixeringslösning under minst 1 vecka vid 4 ° C.
- Efter fixering, tvätta embryona 3 gånger under 20 min med användning av 1x TBS med 0,05% Triton X-100. Efter den slutliga tvätten, ta bort så mycket TBS-Triton som möjligt och tillsätt 3 ml 15% gelatin / 15% sackaros i varje flaska.
- Placera rören på en rullbädd över natten vid rumstemperatur. För embryon äldre än etapp 40, använda minst 24 timmar av penetrationstiden. Efter penetration, omedelbart gå till avsnitt 2.2 på nästa dag.
- Kultur det befruktade X. laevis eller X. tropic embryon i 0,1 x MMR med gentamycin tills önskat steg.
2. Montering och cryosectioning av Xenopus embryon
- Förbered Reagens och material för experiment.
- Ta en låda med positivt LaddnEd glider, idealiskt oöppnad.
OBS: Om öppnas, hålla objektglasen i ett torrt tillstånd (såsom en torr låda) och använd inom en månad för att se till den statiska laddningen på sliderna bibehålles. Använd inte utgångna diabilder eftersom prover kommer att falla bort under immunfärgning. - Pre-chill kryostaten kammaren till -30 ° C. Ställ in instrumentparametrarna som -35 ° C för mikrotom och 12 um snittjocklek. Installera den tjocka täckglasplatta på scenen och låt kryostaten jämvikt under åtminstone 30 min innan sektionen startar.
- Förbered målning penslar för att flytta sektionsremsor, hålla inne kryostaten kammaren.
- Förbered pennor för att skriva på diabilder, lägg dem i rumstemperatur.
- Använd handskar under kryosektion. Använd inte bara händer.
- Ta en låda med positivt LaddnEd glider, idealiskt oöppnad.
- Monterings Xenopus Embryon
- Försiktigt aspirera 5-10 embryon ut ur glasflaska med hjälp av en plast eller glas pipett utan att införa luftbubblor. Överför embryontill monteringskammaren och observera under ett stereoskop. Fyll upp monteringskammaren med gelatin lösning för att säkerställa styvheten hos sektionen blocket.
- Ordna embryona enligt figur 1 med hjälp av ett par av fin-spets pincett. Märk orientering huvuden genom att rita en pil på kanten av kammaren med hjälp av en kryogen-kompatibel markör. För flera grupper av embryon, skriva ner en beskrivning av varje grupp på kanten av motsvarande kammaren också.
- Placera försiktigt kammaren horisontellt i en skum låda halv-fylld med torris och stäng locket. Observera monteringskammaren frysa i 5-10 min. Behandla varje kammare i serie (dvs. placera tidigare kammaren på torris innan du fortsätter till nästa), eftersom detta kommer att lämna tillräckligt med tid för varje kammare för att frysa och förhindra torris rutan för att bli överfulla.
OBS: Frysta monterings kammare behöver inte stå horisontellt och kan staplas upp i rutan. - Fortsätt med cryosectioning eller, om så erfordras, hålla frysta prover vid -80 ° C under minst 1-2 veckor utan att förlora immunogenicitet.
- Kryosektion av Monterade Xenopus embryon
- Avlägsna en fryst provblocket från kammaren genom att trycka på botten av kammaren med hjälp av en trubbig pinne (såsom en penna).
- Tillsätt flera droppar av vävnadsfrysmedium, (en polyetylenglykol och polyvinylalkohol-innehållande medium) på provet hållskivan och montera provblocket med den främre änden av embryona pekar uppåt (figur 2). Låt mounted- blocket stå inuti kryostat kammare för ca 1 min eller tills vävnadsfrysmedium blir ogenomskinlig.
- Omedelbart installera exempelhåll skiva i mikrotom med bottensidan av provblocket uppåt. Trimma bort en del av provblocket med användning av ett blad när provblocket är fortfarande relativt "mjuk" för att reducera längden av varje sektion(om så önskas). Låt provhållskivan på mikrotomen minst fem minuter för att låta dess temperatur för att nå jämvikt.
- Gradvis trimma provblocket tills huvudet på grodyngel är synliga genom den genomskinliga gelatin. För att öka trimning hastighet, tillämpa en högre (tjockare) inställning av snittjocklek (t.ex. 20-25 M) i detta skede (till exempel aktivera alternativet "trimma") men inte för tjock, eftersom provblocket kan falla bort från provhållskivan . Observera resultatet för kryostat, såsom skärpa och vinkeln på bladet i detta skede för att säkerställa alstrandet av en lång remsa av efterföljande sektioner.
- När grodyngel huvuden blir synliga, justera inställningarna för kryostaten tillbaka till det normala (t ex 10-12 M) och ren både mikrotom och scenen med hjälp av en pensel. göra försiktigt 2-3 sektioner som en studie med inställningen handhjulet (använd inte den motoriserade inställningen) för att säkerställa att färdiga skivor kan bilda strips, inte överlappande eller fastnar på bladet.
- Fortsätt putsning tills huvudet på grodyngel nästan exponerade (detta kan behöva lite erfarenhet men uppnåeliga). Borsta bort eventuella rest sektioner på scenen och insamling av provsektioner börjar.
- Gör cirka 10-15 sektioner och låta dem bilda en lång remsa.
- Vänd över den tjocka täckglasplattan åt sidan och försiktigt bort remsan från bladet med hjälp av en fin spets pensel och ordna det på scenen med lång axel parallell med bladet.
- Välj en positivt laddad glida vid rumstemperatur, märka den med en blyertspenna (som inte kommer att tvättas bort under efterföljande färgningsbehandlingar), tryck på den snabbt men bestämt på remsan med etikettsidan nedåt och ta bort bilden från kryostaten kammaren. Om det görs på rätt sätt, bör remsan omedelbart hålla sig till den positivt laddade sliden (figur 3A).
- Upprepa detta steg för att ha 20-30 skivor på varje glede och anordnade parallellt (figur 3B). Detta är tillräckligt för att täcka hela hjärnan regionen X. tropic embryon och de flesta av framhjärnan och mitthjärnan regionerna X. laevis embryon.
- Lufttorka glasen i 10 minuter, fortsätt omedelbart eller lagra bilder i ett bildspel box vid -80 ° C under minst 3-6 månader utan att förlora immunogenicitet.
3. Immunfärgning av sektionerade Xenopus embryon
- Förbered Reagens och material för experiment.
- Förbered 0,05% TBS-Triton X-100 genom att tillsätta Triton X-100 in i 1x TBS för att uppnå en slutlig koncentration av 0,05%. Denna lösning är stabil vid rumstemperatur under 3-4 dagar. Använd inte utgångna lösning.
- Förbereda 5% värmeinaktiverat getserum eller 5% BSA i TBST som blockerande buffert. För det första, värmeinaktivering av get / lammserum genom att placera ca 20-30 ml av serum i ett 65 ° C vattenbad i 30 till 60 min. Alikvot i 1,5 ml centrifugrör och frysa i -20 ° C. Ingen ny inaktive krävs vid användning av.
- Späd värmeinaktiverat serum eller BSA i TBST för att uppnå en slutkoncentration av 5% före användning.
- Förbereda lämpliga primära antikroppar enligt utspädningar i blockeringsbuffert (t.ex. 1: 500 anti-Sox3 10,25 / 1: 250 anti-Myt1 26 / anti-acetylerad tubulin). Använda cirka 100 pl av antikroppslösning på varje objektglas.
- Utarbeta lämpliga fluorescerande antikroppar (t.ex. anti-mus / kanin röd fluorescerande färgämnes konjugerade antikroppar) i blockerande buffert (vanligen 1: 500).
- (Tillval) Lägg till röd fluorescerande färgämne-konjugerad Phalloidin (1: 500) i sekundär antikropp mix för att avslöja aktin nätverk.
- (Tillval) Lägg DAPI (0,5 mikrogram / ml slutkoncentration) till sekundär antikropp mix att visualisera kärnlokaliserings.
- Ta anti-fade monteringsmedium ur frysen och tina i rumstemperatur vattenbad.
- Immunfärgning
- Ta bort de frusna diabilder från -80 ° C och placera dem på en bit handduk papper inuti en dragskåp under minst en timme för att eliminera eventuella kondenserade vattendroppar, sedan baka de torkade glider på en 85-90 ° C värmeblock med skivor vända upp i 15 minuter för att aktivera vidhäftningsmekanismen. Slutligen tillåter objektglasen svalna till rumstemperatur (åtminstone 10 min).
- Fylla färgning burken med ren aceton och inkubera objektglasen i aceton under 10 min för att avlägsna fiskgelatin. Om flera diabilder skall behandlas, ordna dem på en färgning rack. Lufttorka de behandlade-bilder i 15 minuter i en dragskåp. Återanvänd inte använda aceton.
- dra försiktigt en ring runt proven på bilden med hjälp av en PAP penna utan att röra proverna. Säkerställa att ringen är självinnesluten, annars antikroppslösningen kommer att strömma ut under färgning. Helt torka PAP pennan ringen.
- Fyll en annan färgning burk med 1x TBS utan Triton X-100. Insert torkade-glider in färgnings burken och låt rehydrering under minst en timme. Under tiden, förbereda blockerande buffert genom att späda antingen värmeinaktiverat getserum eller BSA till 5% slutkoncentration med användning av 1x TBS med 0,05% Triton X-100.
- Gör en våt ruta genom att placera 1-2 6-brunnsplattor i en klick-lock matlåda och fylla brunnarna halvvägs med ultrarent vatten. Ta rehydratiserade diabilder från färgning burken och placera dem horisontellt på 6-brunnsplattor (utan lock plattan).
- Försiktigt 300-600 il blockerande buffert inne i PAP ringen. Försegla den våta rutan genom att låsa locket i läge och inkubera vid rumstemperatur under minst 1 timme.
- Späd de lämpliga primära antikroppar i blockerande buffert. Generellt använder 100-150 il utspädd antikropp lösning per bild. Om flera bilder bearbetas, skala upp volymen proportionellt.
- Efter blockering, försiktigt bort blockerande buffert från diabilder genom aspiration och snabbt lägga primary antikroppslösning för att förhindra uttorkning, sedan försegla den våta rutan och inkubera vid 4 ° C över natten.
- På nästa dag, ta bort den primära antikroppslösningen från objektglasen genom aspiration. Tvätta bilderna genom infogning i färgningskärl fyllda med 1x TBS med 0,05% Triton X-100, 3 gånger, 15 min vardera. Under tiden, späd de lämpliga fluorescerande sekundära antikroppar med blockeringsbuffert (med eller utan DAPI eller phalloidin).
- Försiktigt 100-150 pl sekundär antikropp lösning på bilderna. Placera glasen inuti den våta rutan och försegla locket. Inkubera objektglasen under 1-2 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta bilderna i färgningskärl fyllda med 1x TBS med 0,05% Triton X-100, 3 gånger, 15 min vardera. Vid den sista tvätten, tina den anti-fade monteringsmedium i ett 50 ° C vattenbad i 10 min vid förvaring vid -20 ° C. Kyl ner monteringsmediet till rumstemperatur före användning.
- Tillsätt ca 20 | il (en droppe) av monteringsmedium påsliden och lägg ett stort täckglas (minst 22 mm x 64 mm) över proverna. Observera att använda fluorescerande eller konfokalmikroskop inom 6 h efter montering.
- Om avbildning inte kan göras på samma dag, försegla diabilder med hjälp av nagellack och placera dem i den våta rutan vid 4 ° C över natten.
OBS: anti-fade monteringsmedium kommer successivt oxiderar efter några dagar (och vrid brunaktiga) så det rekommenderas att ta bilder så snart som möjligt.
- Om avbildning inte kan göras på samma dag, försegla diabilder med hjälp av nagellack och placera dem i den våta rutan vid 4 ° C över natten.
Representative Results
De representativa resultat visar tvärsnitt av etapp 30 Xenopus embryon på olika nivåer, nämligen framhjärnan, mitthjärnan, hindbrain och ryggmärgen, färgade med olika antikroppar (Figur 4). Som nämnts, Sox3-märkt neuronal progenitor cellpopulation lokaliserar i närheten av den lumen i neuralröret, medan MyT1-märkt differentierade primära neuroner migrera utåt och hitta nära den marginella skiktet (basal lamina) av det neurala röret. Anti-acetyl-tubulin etiketter axoner i differentierade neuroner, som kan observeras i hela neuralröret.
Sida-specifika genen knockdown eller överexpression är en brett använd metod i neurobiologi att utvärdera om modulering av uttrycket av specifika gen (er) stör tillväxten och differentieringen av neuronala celler. I sådana fall kan antingen Morpholinos (MOS) eller DNA-konstruktion (er) som bär pro moter-driven gen (er) injiceras in i en av de två blastomerer vid två-cellstadiet 23. Alternativt kan de injiceras in i hjärnan ventrikeln följt av elektroporering, vilket kommer att resultera i knockdown eller överexpression av önskad gen (er) 27. I båda fallen kommer effekterna begränsas till en sida av embryot, vilket gör den motsatta sidan av embryot som obehandlade intern kontroll.
Efter fixering, sektionering, och immunfärgning, är effekterna av genen knockdown / överuttryck kvantifieras genom att räkna och jämföra cell antalet olika populationer på båda sidor av embryo. Genom att ackumulera dessa data från flera embryon, kan utföras statistisk analys. I våra representativa resultat, ingen störning gjorts i embryon. Exempel på gen störning och deras effekter på olika neuronala cellpopulationer kan hittas i referenserna 20,23.
t "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1:. Embryo arrangemang och orientering i avsnittet formen (A) En tecknad skildring visar monteringsaggregatet, notera facket har märkts med datum, arrangera, och orienteringen av embryon. (B) En bild som visar den naturliga utseende av monteringsenheten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Orienteringen och läget för gelatinblocket på provhållskivan (A) En tecknad skildring visar avsnittet blockenheten, observera att embryon i en "heads up" och gelatinblocket sitter stadigt onto provhåll skiva genom den vävnadsfrysmedium vid basen (se Figur 2B). (B) En bild som visar den naturliga utseende avsnitt blockenheten, observera ackumuleringen av vävnadsfrysmedium mellan gelatinblocket och provhållskivan. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Kontinuerlig sektionering (A) Modell av en sektionskammaren. Provet innehavet skivan ska vridas och fixeras i det läge som embryot sidan är vänd uppåt. Efter några (6-10) sektioner, är det lång remsa av kontinuerliga sektionsplattor försiktigt separeras från bladet (blå) med hjälp av en fin pensel, och sedan vände 90 ° på fästplåten. Sedan ett rum-temp positivt laddad slide ärstadigt pressas på avsnittet remsan nedåt och omedelbart lyftas upp till insamlade färdiga remsor. (B) Normalt varje bild rymmer 2 parallella rader av remsor, som visas. Kom ihåg att göra detaljerade uppgifter om bilden etikett med penna. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Tvärsnitt av etapp 30 X. laevis grodyngel och färgning i nervvävnad, 20X. (A) Schema anger de relativa positionerna (framhjärnan, mitthjärnan, hindbrain och ryggmärg) av sektionsplan på Xenopus grodyngel. (B) Motsvarande tvärsnitt färgade med anti-Sox3 (Röd), anti-acetylerade-tubulin (Green), och DAPI (blå), som visar de relativa lägena för neurala stamcells pooler samt neurofilament i neuralröret. (C) Motsvarande tvärsnitt färgade med anti-MyT1 (röd) och DAPI (blå), som visar de relativa lägena för differentierade primära neuroner i neuralröret. Skala bar = 20 pm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här visar vi en bekväm och effektiv metod för att visualisera primär neurogenes i Xenopus embryon. Denna metod medger utvärdering av olika typer av neurala celler, inkluderande neuronala stamceller och differentierade primära nervceller med hjälp av cell typspecifika markörer.
Protokollet är generellt robust med mycket hög grad av reproducerbarhet. För embryon som är på förhand kläckning stadier (dvs upp till steg 28), rekommenderar vi att manuellt ta bort vitellinmembranet före fixering eftersom detta tillåter embryon till fullo uncurl innan fixeringen. Detta är särskilt viktigt när man samlar in embryon vid relativt tidiga stadier (före kläckning), eftersom böjda embryon är extremt svårt att ordna vid den önskade orienteringen inuti monteringskammaren. Vi har inte upplevt en förlust av immunogenicitet efter MEMFA eller PFA fixering därmed ytterligare antigenåtervinning steg är inte nödvändigt för detta protokoll. Dessutom har dennaimmunfärgning förfarande kan utföras i prover från kromogena / fluorescent in situ hybridisering. I ett sådant scenario, är det rekommenderat att hoppa proteaset K behandlingssteget under in situ hybridisering protokoll. Efter kromogent / fluorescerande substrat reaktion kan proverna tvättas med TBS och inbäddade i fiskgelatinlösning på ett liknande sätt till MEMFA / PFA fasta prover. Provflaskor kan skyddas från ljus genom att linda flaskorna i aluminiumfolie om fluorescent in situ hybridisering kommer att avbildas tillsammans med immunofluorescerande färgning senare.
I vissa fall kan embryon krympa alltför efter gelatin penetration. Detta är troligen orsakas av antingen otillräcklig fixering eller otillräcklig TBS-Triton extraktion. Se till att embryon har rättats i PFA / MEMFA minst 2-3 h eller helst över natten vid 4 ° C. Om problemet kvarstår, öka tvättiden TBS-Triton till 3 för en timme.
Under Cryo-ITTning, kan styvheten hos provblocket variera som olika satser av fiskgelatin har olika egenskaper. Detta problem kan delvis kompenseras genom att justera temperaturen av mikrotomen. En lägre temperatur kommer att resultera i en "hårdare" provblocket dock enligt alltför låg temperatur provblocket blir skarp och svår att sektion. Några finjusteringar eller praxis (med mock sampelblock utan embryon) före varje sektionering kan vara fördelaktigt före användning på särskilt värdefulla prover.
Ett vanligt förekommande problem under sektionering är de tunna sektionerna tenderar ibland att fastna på den tjocka glasplatta snarare än stanna platt på stål scenen. Detta kan vara särskilt störa eftersom det ständigt avbryter den kontinuerliga snittningsprocessen. Sådana fall orsakas ofta av en av två skäl: sektionskammaren och (i synnerhet) tjocka glasskivan inte är tillräckligt kallt, eller kraftig statisk laddning på maskinen och operator, särskilt i torrt väder. Den förstnämnda kan lösas genom att vrida ner temperaturen i sektionskammaren och lämnar glasskivan inom extra tid (möjligen över natten); och senare genom korrekt jord kryostaten. Anslutning av metallytan på kryostat till en metall kran eller liknande vatten rörsystem av metall kan vara ett alternativt sätt för att frigöra de statiska laddningar. Efter varje användning bör tjock glasplatta tvättas väl med icke-frätande rengöringsmedel (t.ex. diskmedel), sköljdes med ultrarent vatten, besprutas med ren etanol, och insvept i handduk papper för att skydda ytan och kanterna från skada.
Antikropparna som anges i protokollet är i allmänhet specifik och vi sällan stöter på ospecifik adsorption eller hög bakgrundssignal. Det bör noteras att, om man använder värmeinaktiverat get / lammserum som blockeringsmedel, hög värme-inaktivering (såsom visualiseras genom bildningen av fluffig fällningsmedel i serumet) börundvikas eftersom detta fällningsmedel är mycket attraktiv för sekundära antikroppar och kan bidra till en källa för hög bakgrund.
Det är möjligt, och ibland önskvärt, att utföra dubbelfärgning för att visualisera olika populationer av neuronala celler samtidigt. En sådan dubbelfärgningen är möjligt och i allmänhet ger tillfredsställande resultat med följande kombinationer: Sox3 / N-badkar eller Myt1 / N-badkar. Emellertid är dubbelfärgning av Sox3 och Myt1 kompliceras av det faktum att de två antikropparna är båda från kaninursprung. Vi har testat flera antikropps direkta märkningssatser, emellertid inga tillfredsställande resultat observerades (lågt signal-till-brusnivån), möjligen på grund av bristen på signalförstärkning från sekundära antikroppar. Ett möjligt tillvägagångssätt för att kringgå detta problem skulle vara att öka transgena linjer i Xenopus, såsom diskuteras nedan.
En av de viktigaste begränsningarna i detta protokoll är att, medan detta protokoll kunde tillräckligt distinguish två pooler av neuronala celler, nämligen Sox3-uttryckande neurala stamceller poolen och Myt1-uttryck differentierade neuroner, saknar den förmågan att avslöja olika delpopulationer av differentierade neuroner. Sådana delpopulationer, vilket bland annat, men är inte begränsade till, primära motoriska nervceller, interneuronen och sensoriska neuroner, vanligtvis kännetecknas av sina differentiellt uttryckta markörgener 28-30. Som nämnts ovan, kan de senaste framstegen inom utvecklingen av flerfärgad in situ hybridisering i kombination med antikroppsbaserad immunofluorescens detektionsmetoden i Xenopus embryon fylla i gapet för att avslöja dessa delpopulationer av differentierade neuroner för potentiella utredning 31. Alternativt, som har visats i musmodell, det skulle också vara önskvärt att höja en mer omfattande uppsättning celltyp-specifika antikroppar för att särskilja sådana olika cellpopulationer i Xenopus.
Det ärockså värt att nämna att, som ett komplement till den här metoden, de senaste framstegen inom optisk avbildning och bildanalys, såsom multifoton mikroskopi, 3D-rekonstruktion, och segmentering, kan också tillämpas efter inledande bedömningar att uppnå mer omfattande observationer av Xenopus oocyter samt tidiga embryon, särskilt inom ramen för en levande inställning 32,33. Därför att spåra proliferation, differentiering och förflyttning av nervceller i levande djur, skulle det vara önskvärt att införa ett eller flera transgena linjer som hyser fluorescerande proteiner som drivs av celltyp specifik promotor för att möjliggöra levande observation av sådana cellpopulationer i början av Xenopus embryon. Inrättandet av en X. laevis linje med neuro-specifik β-tubulin promotor som driver tauGFP och dess tillämpningar har gett ett bra exempel 23,34. Med de fullständiga promotorsekvenser både sox3 och myt1 kännetecknat av ryggradsdjur 35-37, är det shOuld vara relativt lätt att etablera ytterligare transgena linjer i Xenopus som i stor utsträckning skulle bidra till både Xenopus samhället och en mer allmän fråga om primär neurogenesis forskning.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Prof. Michael Klymkowsky i University of Colorado i Boulder och professor Nancy Papalopulu vid universitetet i Manchester för vänligt ger anti-Sox3 och anti-Myt1 antikroppar, respektive. Vi tackar medlemmarna i Papalopulu lab för deras insiktsfulla förslag för att utveckla detta protokoll. Detta arbete stöddes av två Healing Foundation anställningar till SZ och JL, två projektbidrag från Healing Foundation till SZ / EA och JL / EA respektive ett program bidrag från Wellcome Trust till EA (WT082450MA), och en institutionell Strategic Support bidrag från Wellcome Trust [097.820 / Z / 11 / Z].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | RDD003 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-015A | |
| Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport | VWR | EMB-200-010K | |
| Superfrost Plus slides | ThermoFisher | 12-550-15 | |
| Tissue Freezing Medium (OCT) | Leica | 14020108926 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Gloves | |||
| Dry Ice | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 85-90 °C Heat block | |||
| PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Acetone, analytical grade | |||
| Staining jar with slide racks | |||
| Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside) | |||
| anti-acetylated tubulin | Sigma-Aldrich | T7451 | |
| Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) | Cell Signaling | 4408 | |
| Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 555 Conjugate) | Cell Signaling | 4413 | |
| Alexa Fluor® 647 Phalloidin | Cell Signaling | 8940 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | P36930 |
References
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
- Wilson, S. W., Houart, C. Early steps in the development of the forebrain. Dev Cell. 6, 167-181 (2004).
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise. Cell. 88, 13-17 (1997).
- Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus. Cell. 77, 273-281 (1994).
- Fainsod, A., et al. The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4. Mech Dev. 63, 39-50 (1997).
- Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4. Cell. 86, 589-598 (1996).
- Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4. Cell. 86, 599-606 (1996).
- Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages. Gene. 188, 101-107 (1997).
- Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives. Mech Dev. 126, 42-55 (2009).
- Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation. Development. 130, 5609-5624 (2003).
- Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis. Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).
- Bellefroid, E. J., et al. X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation. Cell. 87, 1191-1202 (1996).
- Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period. J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).
- Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).
- Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta. Nature. 375, 761-766 (1995).
- Roberts, A. Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates. Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).
- Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
- Hirabayashi, Y., et al. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131, 2791-2801 (2004).
- Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors. J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).
- Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop. Cell Rep. 2, 10-18 (2012).
- Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis. Dev Cell. 20, 19-32 (2011).
- Munoz, R., et al. Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells. Dev Biol. , (2015).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development. Development. 141, 4794-4805 (2014).
- Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8, e79469 (2013).
- Wang, T. W., et al. Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones. J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).
- Sabherwal, N., et al. The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis. Development. 136, 2767-2777 (2009).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).
- Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain. Brain Res. 1239, 92-99 (2008).
- Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis. J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).
- Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus. Dev Biol. 362, 65-75 (2012).
- Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections. Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).
- Canaria, C. A., Lansford, R. Advanced optical imaging in living embryos. Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138, 5451-5458 (2011).
- Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity. Gene. 344, 287-297 (2005).
- Wang, S., et al. Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation. Dev Biol. 317, 531-540 (2008).
- Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo. Dev Biol. , 307-319 (2008).
