שיטה מהירה עבור עיבוד דם כדי להגדיל את התשואה של רמות הפפטיד פלזמה בדם אנושי
Summary
שיטת עיבוד דם RAPID ניתן להשתמש בבני אדם ובבעלי מניב רמות פפטיד גבוהות כמו גם מאפשרת הערכה של הטופס המולקולרי הנכון. לכן, שיטה זו תהיה כלי רב ערך במחקר פפטיד.
Abstract
מחקר בתחום הרגולציה צריכת המזון הוא צובר חשיבות. זה בדרך כלל כולל מדידת פפטידים ויסות צריכת המזון. עבור והקביעה הנכונה של הריכוז של הפפטיד, זה צריך להיות יציב במהלך עיבוד דם. עם זאת, זה אינו המקרה במשך כמה פפטידים אשר מפורקים במהירות על ידי peptidases אנדוגני. לאחרונה, פתחנו שיטת עיבוד דם העסקה בטמפרטורות educed R, A cidification, P rotease עיכוב, אני sotopic שולט אקסוגניים ו- D ilution (RAPID) לשימוש אצל חולדות. כאן, הקמנו את הטכניקה הזו לשימוש בבני אדם וחקרתי התאוששות, טופס מולקולרי וריכוז במחזור של הורמונים רגולטוריות צריכת מזון. את השיטה המהירה שיפרה בצורה משמעותית את התאוששות עבור 125 שכותרתו לי סומטוסטטין-28 (+ 39%), כמו-גלוקגון פפטיד-1 (+ 35%), גרלין acyl וגלוקגון (+ 32%), אינסולין kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), לפטין(+ 21%) ו פפטיד YY 3-36 (+ 19%) לעומת עיבוד סטנדרטי (דם EDTA על הקרח, p <0.001). כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים הראה elution של גרלין acyl אנדוגני במיקום הצפוי לאחר עיבוד RAPID, זמן מה לאחר עיבוד סטנדרטי 62% של גרלין acyl היו מפורקים וכתוצאה מכך שיא קודם לכן המייצג סביר גרלין desacyl. לאחר עיבוד RAPID היחס גרלין acyl / desacyl בדם של נושאים בעלי משקל תקין היה 1: 3 לעומת 1:23 הבאים עיבוד סטנדרטי (p = 0.03). כמו כן רמות kisspeptin אנדוגני היו גבוהות לאחר RAPID לעומת עיבוד סטנדרטי (+ 99%, p = 0.02). שיטת עיבוד דם RAPID ניתן להשתמש בבני אדם, מניב רמות פפטיד גבוהות ומאפשר הערכה של הטופס המולקולרי הנכון.
Introduction
לאור השכיחות הגוברת ברחבי העולם ההשמנה 1,2, מחקר בתחום הרגולציה צריכת המזון הוא צובר חשיבות. בעוד עד כה רק פפטיד אחד ידוע כי הוא מיוצר באופן שולי מרכזי פועל כדי לעורר את צריכת מזון, כלומר גרלין 3, בתוך העשורים האחרונים, מגוון רחב של פפטידים זוהה המפחית את צריכת מזון, למשל. לפטין, פפטיד YY (PYY) וגם גלוקגון דמוי פפטיד 1 (GLP-1) ואינסולין 4, לכן, במחקרים חוקרת את מנגנוני ויסות רמות הרעב פפטיד שובע מוערכים לעתים קרובות בעת ובעונה אחת, ההנחה היא כי הפפטיד למד יציב התאושש על תשואות גבוהות במהלך היווצרות פלזמה. עם זאת, לעתים קרובות זה לא המקרה עקב התמוטטות אנדוגני מהירה כפי שמוצג לפני עבור למשל. גרלין אשר נפגע מן acyl כדי desacyl גרלין 5. לכן, תיארנו לאחרונה שיטה מהירה למחזור הדםלשיר בחולדות העסקת בטמפרטורות educed R, A cidification, P rotease עיכוב, אני sotopic שולטת אקסוגניים ו- D ilution 6. שיטה זו שפרה את ההתאוששות עבור 11 של 12 פפטידים נבדקו ואפשרו לקביעה בצורה המולקולרית הנכונה במחזור לעומת עיבוד דם רגיל (דם EDTA על קרח) 6. שיטה זו נעשה שימוש בכמה מחקרים עוקבים 7-12 לצורך זיהוי של מחזורי גרלין וכן גורם משחררים corticotropin 13. לכן, השיטה הוכיחה שימושית למחקר פפטיד במכרסמים. עם זאת, מאז מחקרים במכרסמים אינם תמיד לתרגום לזן אחר, השיטה צריכה להיות הוקמה לשימוש בדם אנושי.
מטרת המחקר הנוכחי הייתה לבחון את השיטה המהירה לעיבוד דם בבני אדם לעומת עיבוד דם רגיל, דם EDTA על קרח, אשר מומלץ נרחב 14 ולעתים קרובות used בסביבה וכן המחקר הקלינית. בדקנו את ההתאוששות של מבחר של 125 פפטידים שכותרתו ערבו בויסות צריכת מזון כוללים פפטידים הוקם וכן מועמדים חדשים הציע לאחרונה לשחק תפקיד האכלת רגולציה (השפעות על צריכת מזון מוצגות בלוח 1) העיבוד הבא עם שתי השיטות. הורמונים נבחרו גם לייצג פפטידים באורך ולחייב שונים (טבלה 2). יתר על כן, עבור גרלין חקרנו בצורה המולקולרית (ים) בעקבות השיטה הסטנדרטית ומהירה. לבסוף, אנו העריכו גרלין אנדוגני (acyl ועל גרלין desacyl) כמו גם רמות kisspeptin, פפטיד גם הציע לאחרונה לשחק תפקיד בוויסות צריכת המזון 15,16 הבאים עיבוד RAPID או רגיל. בנוסף, גם חקרנו רמות פפטיד אלה בקרב אוכלוסיה של נבדקים עם מגוון רחב של מדד מסת הגוף (החל 10.2-67.6 ק"ג / מ 2) ללמוד possibהבדלי le הקשורים למשקל גוף שינה באופן כרוני.
אבחון, הערכה, ואת תוכנית:
משתתפי המחקר
כל משתתפי המחקר אושפזו חדשים חולים (הכללה הייתה בתוך ימים של אשפוז בבית החולים) של אגף רפואת פסיכוסומטית ב Charité-Universitätsmedizin בברלין ומסרו בכתב הסכמה מדעת. כדי למנוע השפעה של מגדר רק מטופלות נכללו. סך של 42 נבדקים השתתפו במחקר זה חולקו לשלוש קבוצות: בעלי משקל תקין (BMI 18.5-25 ק"ג / מ 2, n = 12), אנורקסיה נרבוזה (BMI <17.5 ק"ג / מ 2, n = 15) והשמנה (BMI> 30 ק"ג / מ 2, n = 15). אנורקסית וחולים הסובלים מהשמנת יתר היומאובחנים על פי סיווג המחלות-10 הבינלאומי ואושפז לעלייה במשקל (אנורקסיה נרבוזה) או הפחתת משקל (השמנה), בהתאמה. כל חולי המשקל התקינים אושפזו באופן בלעדי עקב סימפטומים סומאטי ללא הפרעות סומטיות רלוונטיות. חולים עם תסמינים סומאטי עיכול או היסטוריה של ניתוחים במערכת עיכול לא נכללו במחקר. הכללת קריטריונים גם הקיפו בעידן <18 שנים, הריון נוכחי ומחלות פסיכוטי מטופל. איסוף דם בוצע ביום 2 או 3 לאחר אשפוז בבית החולים לפני קבלת טיפול תזונתי על מנת להגביר או להפחית את משקל גוף, בהתאמה. פרמטרים אנתרופומטריות הוערכו על אותו היום.
Protocol
Representative Results
Discussion
דיווחנו לפני ששיטת RAPID לעיבוד דם השתפרה ההתאוששות עבור 11/12 פפטידים לעומת עיבוד דם רגיל בחולדות 6. במחקר הנוכחי אנו הראינו כי בשיטה זו מתאימה גם לשימוש בבני אדם. בעקבות עיבוד RAPID, ההתאוששות עבור 9 מתוך 9 125 פפטידים שכותרתו בדקה השתפרה לעומת עיבוד דם רגיל (דם EDTA …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי גרמנית Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) וגרמנית משרד לחינוך ולמחקר 03IPT614A (CG). אנו מודים ריינהרד Lommel ופטר בוסה לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם, כמו גם קארין ג'והנסון וכריסטינה Hentzschel לעזרה עם ארגון וביצוע מדידות אנתרופומטריות
Materials
| diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
References
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
- Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
- Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
- Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
- Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
- Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
- Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
- Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
- Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
- Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
- Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
- De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
- Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
- Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
- Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
- Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
- Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
- Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
- Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
- Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
- Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
- Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
- Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
- Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
- Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
- Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
- Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
- Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
- Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
- Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
- Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
- White, A., Handler, P., Smith, E. L. . Principles of Biochemistry. , (1973).
