Summary
RAPID血液処理方法は、ヒトで使用され、より高いペプチド濃度をもたらすだけでなく、適切な分子形態の評価を可能にすることができます。したがって、この方法は、ペプチド研究の貴重なツールとなるでしょう。
Abstract
食物摂取規制の分野での研究が重要性を増しています。これは、多くの場合、食物摂取を調節するペプチドの測定を含みます。ペプチドの濃度の正確な決意のためには、血液処理中に安定であるべきです。しかし、これはすぐに、内因性のペプチダーゼによって分解されるいくつかのペプチドには当てはまりません。最近、我々はR析出温度、cidificationを用いた血液処理方法を開発し、Pは 私は外因性のコントロールおよびラットでの使用のためのD ilution（RAPID）をsotopic、阻害をrotease。ここでは、ヒトで使用するためにこの技術を確立し、回復、分子形態および食物摂取規制ホルモンの循環濃度を調査しました。迅速な方法が大幅に125 I標識ソマトスタチン28（+ 39％）、グルカゴン様ペプチド-1（+ 35％）の回復、アシルグレリン及びグルカゴン（+ 32％）、インスリンおよびキスペプチン（+ 29％向上しました）、のNesfatin-1（+ 28％）、レプチン（+ 21％）と標準的な処理（氷上でEDTA血液、P <0.001）と比較して、ペプチドYY 3-36（+ 19％）。標準的な処理の後にアシルグレリンの62％がそうdesacylグレリンを表す以前のピークが得られ分解された一方で、高速液体クロマトグラフィーは、迅速な処理後の予想位置での内因性アシルグレリンの溶出を示しました。標準処理た（p = 0.03）以下の1時23分に比べて3：RAPID処理した後、正常体重の被験者の血液中のアシル/ desacylグレリン比は1でした。また、内因性キスペプチンレベルは、標準的な処理に比べRAPID後に高かった（+ 99％、P = 0.02）。 RAPID血液処理方法は、ヒトで使用することができ、より高いペプチド濃度が得られ、正確な分子形態の評価を可能にします。
Introduction
肥満1,2の世界的な増加罹患率の光では、食物摂取規制の分野での研究は重要性を増しています。唯一のペプチドが知られているこれまでのところそれが末梢 生成され、中央に食物摂取を刺激するように作用するが、すなわちグレリン3は 、過去数十年以内に、ペプチドの広い範囲は、例えば 、食物摂取を減少させることが確認されています。レプチン、ペプチドYY（PYY）、また、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）およびインシュリン4は 、そのため、空腹および満腹ペプチドレベルの調節機構を調査する研究において頻繁に評価され、同時に、それが想定され研究ペプチドが安定してプラズマ形成中に高収量で回収されます。 例えばのために前に示したようにしかし、非常に多くの場合、これは、急速な内因性の故障にそうではありません。グレリン5を desacylするアシルから分解されるグレリン。したがって、我々は最近、血液プロセスへのための迅速な方法を説明しましたR析出温度、cidificationを採用したラットで歌う、Pは 私は外因性コントロールとDの ilution 6を sotopic、阻害をrotease。この方法は、標準的な血液処理（氷上でEDTA血液）6と比較して、正しい循環分子形態の決意について試験し、許可された11 12のペプチドの回復を改善しました。この方法は、コルチコトロピン放出因子13と同様に、グレリンの循環の検出のためにいくつかのその後の研究7-12で使用されています。したがって、この方法は、げっ歯類のペプチド研究のために有用であることがわかりました。げっ歯類の研究は常に別の種に翻訳可能ではないので、この方法は、同様に、ヒトの血液中での使用のために確立されるべきです。
本研究の目的は、広く14と頻繁にuの推奨される標準的な血液処理、氷上でEDTA血液、と比較して、ヒトでの血液処理のための迅速な方法を試験することでした臨床だけでなく、研究の場でのsed。 （食物摂取に対する効果を表1に示した）処理の後、我々は、確立されたペプチドを含む食物摂取の調節に関与する125 I標識化ペプチドの選択の回復をテストならびに新しい候補は、最近、摂食調節における役割を果たすことが示唆しました両方の方法で。ホルモンは、異なる長さおよび電荷（ 表2）のペプチドを表すために選択しました。また、グレリンのために我々は、標準およびRAPID方法以下の分子形態（複数可）を調べました。最後に、我々は、ペプチドはまた、最近RAPIDまたは標準処理以下の食物摂取15,16の調節に役割を果たしていることが示唆、内因性グレリン（アシルおよびdesacylグレリン）、ならびにキスペプチンレベルを評価しました。さらに、我々はまた、possibを研究するために（10.2から67.6 kg /日m 2の範囲）ボディマス指数の広い範囲で被験体の集団において、これらのペプチドのレベルを調査しました慢性的に改変された体重に関連するル違い。
診断、評価、およびプラン：
試験参加者
すべての試験参加者は、新たにシャリテ-Universitätsmedizinベルリンで心身医学の部門の（封入病院に入院の2日以内であった）の患者を入院し、書面によるインフォームドコンセントを与えました。性別の影響を回避するために唯一の女性患者が含まれていました。 42科目の合計は、この研究に参加し、3群に分けた：正常体重（BMI 18.5〜25キロ/ m 2であり、N = 12）、神経性無食欲症（BMI <17.5キロ/ m 2であり、N = 15）と肥満（BMI、> 30 kg /日m 2であり、n = 15）。拒食症と肥満患者ました疾患-10の国際分類に従って診断し、それぞれ体重増加（拒食症）や体重減少（肥満）、入院。すべての正常体重の患者は、関連する身体的障害なしに起因する身体表現の症状だけに入院しました。胃腸の身体表現の症状や消化管手術の既往歴のある患者は除外しました。除外基準はまた、年齢<18歳、現在妊娠中や未処理の精神病疾患を包含しました。採血は、それぞれ、体重を増加または減少させるために食事療法を受ける前に、2日目または入院後3で実施しました。人体計測パラメータは、同じ日に評価しました。
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Protocol
プロトコルは、ヒトの研究（プロトコル番号EA1 / 10分の114）のための地域倫理委員会によって承認されました。
1.血液処理
- 標準的な手順やRAPID方法に従って前腕静脈およびプロセスから一晩絶食した後、07：00〜08:00の間の静脈血を採取します。被験者は、採血前に運動したり、喫煙しないように指示します。
- 標準的な処理のために、4℃で10分間、3000×gで10分以内に冷やしたEDTA含有チューブ内の血液や遠心分離機を集めます。上清を収集し、ラジオイムノアッセイによってさらに処理するまで-80℃に保ちます。
- 迅速な処理のために、すぐに血液を希釈し、氷冷緩衝液中で1:10（pHは3.6）、0.1M酢酸アンモニウム、0.5 M NaClを含むおよび酵素阻害剤（採血後1分以内）（ジプロチンA、E-64-D、アンチパイン、ロイペプチン、キモスタチン、1 / mlの）。その後、4℃で10分間、3,000×gで10分以内に遠心分離し、上清たちを集めますラット6で前に詳述したようにポリプロピレン製チューブにピペットをる。
- 、100％アセトニトリル（速度10ml /分）を用いたクロマトグラフィーカートリッジを（360 mgを、55から105μm）を充電0.1％トリフルオロ酢酸（TFA、速度10ml /分）で平衡化し、1mlの一定速度で上清とロード/シリンジポンプを用いて分。
- その後3mlの0.1％TFA（流量10ml /分）でカートリッジを洗浄し、ゆっくりとTFA（2ml /分）0.1％を含有する2 mlの70％アセトニトリルで溶出します。
- ラジオイムノアッセイによってさらに処理するまで-80℃で真空遠心分離およびストアを使用してドライ溶出したサンプル。
注：ポリプロピレン（RAPID処理）とホウケイ酸（ラジオイムノアッセイ）結合特性を有意に低い表面を示すため、26の前に研究したペプチドのほとんどのペプチドの損失を最小限にチューブ内のすべてのステップを実施します。
2.測定
注：このセクションの手順は、実験室で行われるべきです放射性物質との仕事のために認定されています。私が取るべき125での作業のための標準予防策。
- 放射性標識ペプチドの回復
- 125 I放射性標識ヒトのペプチドを得る（ 例えば 、アシル-グレリン、GLP-1、グルカゴン、インスリン、キスペプチン、レプチン、のNesfatin-1、PYY 3-36およびソマトスタチン-28）。
- その後、新鮮に0.1％酢酸（1mlあたり〜10万CPM）で希釈し、実験まで、粉末状のペプチドを保管してください。
- 標準的な血液処理のため、直接チューブ、（実験を開始する前に、直接カウント）3,000-6,000 CPMを含む放射性標識を50μlとチューブへの血液の転送1ミリリットルを含む冷却EDTAに採血後。
- 9ミリリットルRAPIDバッファー（組成は1.3を参照のこと）および30,000〜60,000 cpmのを含む500μlの放射性標識を含むチューブに血液をEDTA含有の迅速な処理のために、転送1ミリリットルの血液。 radiolabeの1:10希釈用10倍高いボリュームに迅速な処理のためのリットル。
- 1.3.2へのステップ1.2で説明したようにその後、プロセスサンプル。
- 回収実験のために、真空遠心分離によりない乾燥試料を行い、-80℃で保管しないでください。その代わりに、直接、その後ガンマカウンターを用いて放射性標識ペプチドの回収率を評価します。
- RAPIDサンプルで使用される放射性標識の量の比較可能性を得るために、全容積の1/10を分析しながら、標準試料中の全上清を測定します。測定には、ガンマカウンターにフィットするチューブに上清を転送し、カウント毎分を評価します
- 100％標準として、処理を受けない125 I放射性標識ペプチドの50μlの二つのサンプルを使用しています。 2.1.7で説明したように他のサンプルと同時に測定します。
- 各ペプチドについての実験を5〜6回を実行します。
- 放射性標識グレリンの高速液体クロマトグラフィー
- （c）に血液を撤回チューブと（実験の開始前に、直接カウント）15,000〜20,000 cpmのを含む200μlの放射性標識されたアシルグレリンを含むチューブへの転送1ミリリットルを含むhilled EDTA。
- RAPID処理、9ミリリットル（組成1.3を参照用）RAPIDバッファおよび15,000〜20,000 cpmのを含む200μlの放射性標識されたアシルグレリンを含むチューブに移す1ミリリットルの血液のために。
- 1.3.2へのステップ1.2で説明したようにその後、プロセスサンプル。
- 逆相HPLCによるさらなる分析のために、直接水中の17％アセトニトリル（いずれも0.1％TFAを補った）で平衡化した安定な結合のC18カラム（×50mmの2.1ミリメートル、1.8μm）の上にサンプルをロードします。
- 5分間の平衡化後、40分（流速1ml /分）でサンプルを溶出するために17-40％のアセトニトリルの勾配を使用します。
- 1ミリリットル毎分の画分を収集し、ガンマカウンターを使用して放射能を分析します。
- 別の実験では、負荷200μlの放射性標識されたアシルグレリンは、15,000〜20,000を含みますcpmを直接カラムにし、ステップ2.2.6に2.2.4で説明したようにHPLCを行います。
- ラジオイムノアッセイ
- ラジオイムノアッセイのために、凍結した上清（標準処理）を解凍し、室温で乾燥した粉末（RAPID法）真空。
- 直前のラジオイムノアッセイ、プラズマ（500μL）の元のボリュームに応じて二重蒸留H 2 Oで乾燥RAPIDサンプルを再懸濁。
- 12,27の前に説明したように、製造業者のプロトコルに従って商業ラジオイムノアッセイを用いてキスペプチンと合計（desacylとアシルグレリンの両方を含む）、ならびにアシルグレリンを評価します。安定したペレットの形成を可能にホウケイ酸チューブを使用してください。
- 初日には、24時間の期間のためにメーカーが提供する希釈でアッセイ緩衝液および一次抗体（ 例えば 、抗グレリン）でサンプルをインキュベートします。
- 2日目に、125 Iトレーサー（ 例えば 、125 I-グレリン）を追加し、VORTEXと24時間の期間インキュベートします。
- 3日目に、沈殿試薬、渦を追加し、製造業者により推奨されるようにインキュベートします。その後、遠心分離管、4℃で20分間、3,000×gで。上清を取り出して、ガンマカウンターを使用して、ペレット中の放射能をカウント
- 総マイナスアシルグレリンの差としてdesacylグレリンを計算します。各個々のサンプルのためdesacylグレリンによってアシルを分割することにより、アシル/ desacylグレリン率を評価します。
- すべてのサンプルを処理する - 可能であれば - 1バッチで、アッセイ間変動を避けるために。今回の実験でアッセイ内変動は<、<アシルグレリンの合計と<9％7％キスペプチンは8％でした。
3.統計分析
- コルモゴロフ - スミルノフ検定を使用して、データの分布を決定します。平均±平均の標準誤差（SEM）としてデータを表現します。
- 両者の違いを評価しますt検定により群。ホルム-シダック法に続くすべてのペアワイズ多重比較手順（テューキー事後テスト）または双方向ANOVAによって複数のグループ間の差異を評価します。
- p <0.05 の有意で検討し、統計プログラムを使用して分析を行います。
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Representative Results
RAPID血液処理は、標準的な血液処理と比較して、ヒト血液中の125 I放射性標識ペプチドの収量を増加させます。
標準的な血液処理（氷上でEDTA血液）の後、放射性標識されたペプチドの回収率は9/9ペプチド（ - K 48から68パーセント、 図1Aに至るまで）で〜60％でした。 RAPID処理アシルグレリン（n-オクタノイルグレリン、グルカゴン様ペプチド-1（+ 35％、 図1B）、（+ 39％、 図1A）、すなわちソマトスタチン28で、すべての125 I標識ペプチドの歩留まりを向上させます+ 32％、 図1C）、グルカゴン（+ 32％、 図1D）、インスリン（+ 29％、 図1E）、キスペプチン（+ 29％、 図1F）、のNesfatin-1（+ 28％、 図1G）、標準処理した（p <0と比較して、レプチン（+ 21％、 図1H）およびペプチドYY 3-36（+ 19％、 図1K）0.001）。これらの9のペプチドでは、迅速な方法後の回復は（71から98パーセント、 図1（a）に至るまで- K）〜90％でした。
図1： 標準またはRAPID血液処理以下のヒト血液中の 125 I標識ペプチド の回収放射性標識ペプチドは、ヒト血液に加え、標準的な手順（氷上でEDTA血液）またはRAPID法（低温、酸性化、プロテアーゼに従って処理しました。阻害、同位体外因性コントロールおよび希釈）。上清を回収し、放射能をカウントしました。各列は、*** P <0.001 対標準処理。5〜6回の実験の平均±SEMを表す。 争うにはこちらをクリックしてください。この図のWA拡大版。
迅速な処理に続いて、グレリンは予想位置で溶出します。
標準的な手順の後に、以前のピークはグレリン（ 図2）を desacylに対応する最も可能性の高い観察されたヒト血液の迅速な処理の後、125 Iで標識されたグレリンは、予想位置で溶出しました。これは、ペプチドの62％の低下を示しました。
図2： 標準またはRAPID血液処理以下のヒト血液中の 125 I標識アシルグレリン の溶出プロフィール放射性標識ペプチドは、ヒト血液に加え、標準的な手順やRAPID方法に従って処理しました。その後、上清を高速液体クロマトグラフィーカラムに充填しました。溶出液はCOLました毎分択し、放射能をカウント。標準の後に早く溶出大きな割合を処理中にRAPID処理した後、予定時間で溶出したペプチドの中で最も、最も可能性の高いdesacylグレリンを表します。略称：cpmで、カウント毎分この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
RAPID血液処理は、標準的な処理と比較して増加した内因性キスペプチン血中濃度アシル/ Desacylグレリン比と結果を向上させます。
血液は、標準またはRAPID手順に従って拒食症、標準体重と肥満の被験者から回収し、処理しました。内因性グレリン（合計およびアシルグレリン）はラジオイムノアッセイにより評価しました。人体および併存疾患は/試験群の薬物は、 表3および4に示されています。 RAPID処理の後正常体重の被験者の血液中のアシル/ desacylグレリン比は1：3の標準的な血液処理した（p = 0.03; 図3A）は、次の1時23分に比べて。 （。; p = 0.04; 図3A 3 対 1：13~1）：（3 対 1時19、P <0.001 1）および肥満条件同様の結果が、拒食症で観察されました。差異は、標準的なまたは迅速処理（ 図3A）のための3つの異なる群の間で観察されませんでした。体重/代謝条件は効果ありませんでしたしながら、双方向ANOVAは、処理方法のFL uenceにおける有意な（F 1,64 = 15.3、P <0.001）を示した（F 2,64 = 0.5、P = 0.62）。
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差は（肥満の条件で有意に達しなかっながら、循環内因性キスペプチンレベルは、有意に高い拒食症における標準処理（+ 60％、P = 0.02）と正常体重の被験者（+ 99％、P = 0.02）と比較して、RAPID以下の通りでした23％、p = 0.39; 図3B）。有意差は、3つの異なるBMI群との間に認められなかった（P> 0.05; 図3B）。体重/代謝状態は効果がなかった双方向ANOVAは、（F 2,74 = 0.5、P = 0.60）の処理方法のFL uenceにおける有意な（F 1,74 = 10.8、P = 0.002）を示しました。
図3：アシル/ Desacylグレリン比を循環し、以下の様々な代謝条件下でキスペプチンの循環レベルRAPIDまたはStandard血液処理血液を標準的な手順やRAPID方法によれば、一晩絶食後に食欲不振、正常体重または肥満の被験者から回収し、処理しました。上清を回収し、アシルならびに総グレリンレベルまたはキスペプチンレベル（B）は、ラジオイムノアッセイによって評価しました。 Desacylグレリンは、総グレリンからアシルを差し引きました。比はdesacylグレリン（A）のアシル基を割ることによって計算しました。グループサイズは、カラムの底部に示されています。データは平均±SEMとして表されます。 * P <0.05、** P <0.01及び*** P <0.001 対 。標準処理。 の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
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Discussion
我々は、血液処理のための迅速な方法は、ラット6で標準的な血液処理に比較して11月12日のペプチドの回復を改善することの前に報告しました。本研究では、この方法は、ヒトにおける使用に適していることを示しています。迅速な処理に続いて、テストした9 125 9のI標識ペプチドの回復は、標準的な血液処理（氷上でEDTA血液）に比べて改善されました。観察された改善は、特に、ペプチドの収率が低い場合にマスクされる可能性がある唯一の微妙な違いが予想される条件下で、関連する可能性がある19-39％の範囲でした。
標準的な血液処理後に2/3がグレリンをdesacylに分解されながら、我々はまた、正しい分子形態（アシルグレリン）を示すRAPID血液処理グレリンがHPLC後に正しい溶出位置で検出された後ことを示しました。アシル基は、D、グレリン受容体28に結合するために必須であるので電子アシル化が大幅ペプチドの生物学的機能を変化させることが期待されます。しかしながら、desacylグレリンは、ますます生物学的に活性なペプチド29として認識されます。興味深いことに、desacylグレリンは、食物摂取量30または結腸運動31のために前に示したようにグレリンの影響を打ち消すことが示唆されました。これにより、正しい分子形態を調査することの重要性を強調しています。
正常体重の被験者におけるキスペプチンの内因性レベルを研究するとき、我々は標準的な血液処理に比べRAPID次大幅に増加したレベル（+ 99％）を示しました。しかし、改善が（ 対肥満正常体重の+ 50％）による全体的な増加キスペプチンのレベルにあり得る、肥満の条件下で観察されませんでした。事実が原因である可能性があり、有意差は認められなかったいずれかの方法で処理した血液中のBMIグループ（拒食症、正常体重および肥満）の間の唯一の断食レベルWERことeは評価しました。違いは明らか食後に、今後の研究で調査されるべきであるという仮説であるかもしれません。
キスペプチンは、氷32のみEDTA管を用いた研究で前に測定（本研究では、標準的な処理と呼ばれる）、またはプロテアーゼ阻害剤33を添加することによってされています。本研究に基づいて、管の冷却は、ペプチドの分解を防止するのに十分ではありません。単独の酸性化または単一のプロテアーゼ阻害剤は、キスペプチンを維持するのに十分であるかどうかは、今後の研究で調査する必要があります。
同様に、迅速な処理も大幅に増加したアシル/ desacylグレリン比によって示されるように、内因性アシルグレリンの収量を増加させる（1：3）を、標準的な血液処理（1時23分）と比較しました。 （標準処理後の午前1時19分に比べて）前に迅速な処理次5：この発見は、我々は1のアシル/ desacylグレリン率を報告した齧歯類の研究と良好な一致を示しています。前に報告された一時55分34,35に1：15のアシル/ desacylグレリン比の広い範囲が原因desacylグレリンの脱アシル化に依存する割合が高いことが最も可能性が高かったです。キスペプチンについて上述したように、アシル/ desacylグレリン比率のない変更は、慢性的に改変された体重（VS。肥満正常体重対拒食症）の異なる条件下で観察されませんでした。これはまた、アシル/ desacylグレリンのみ空腹時レベルを評価し、食後の規制がより重要であるという事実のためであってもよいです。一方、これはまた、慢性的に改変された体重にもかかわらず、アシルおよびdesacylグレリンの割合は、基礎条件下では変更されず、これらの条件下で観察された適応変化に重要な役割を果たしていない可能性があることを示しています。しかし、標準化された食事のプロトコルを使用して、迅速な方法を適用し、将来の研究では、さらにこの質問に答えるのに役立ちます。
RAPID私THODは、次のコンポーネントを使用しています：化学反応は主に温度36氷冷溶液を用いて、温度の低下に依存するので、ペプチドの分解を遅くします。次に、また、pHの低下（酸性化）が劣化37の速度を低下させます。また、pHの減少は、他の表面へのペプチドの吸着を減少させ、したがって、ペプチド消失の危険性を減少させます。 （カテプシンB / H など 。）、チオールプロテアーゼの阻害剤としてのジペプチジルペプチダーゼIVの阻害剤としてのジプロチンA、E-64-dとアンチパイン：ここで使用されるプロテアーゼ阻害剤は、内因性ペプチダーゼの広いスペクトルをカバーするために選択されましたキモトリプシン、パパインおよびカテプシンB / Gのための阻害剤としてトリプシン、パパインおよびカテプシンA / B、トリプシン、プラスミン、パパインおよびカテプシンのための阻害剤としてロイペプチンおよびキモスタチンのための阻害剤。また、同位体ペプチドは、この方法による回収の改善を評価するために有用です。最後に、レートOなどの酵素-基質複合体形成fは酵素（ペプチダーゼ）の濃度に依存し、プラズマの基質（ペプチドホルモン）38希釈が形成速度を減少させ、したがって、分解（10倍希釈率を低下させる百倍ミカエリスに従って-Menten動態）。
RAPID方法の利点にもかかわらず、この方法のいくつかの制限も同様に認められるべきです。プロトコルの最も重要なステップは時間です。血液サンプルは、直ちに臨床設定では難しいかもしれ採血後RAPID緩衝液で希釈する必要があります。この方法は、多くの時間がかかり、また、訓練の高いレベルを必要とし、また、標準的な血液処理よりも高価です。それは、臨床ルーチンで実現するために挑戦することができるが、それだけで微妙な違いが予想される場合は特に、研究目的のために役立つであろう、したがって、ペプチドの高収量が望ましいです。
RAPID方法について説明し、そのすべてのコンポーネントに推奨されるが、本論文では（R析出温度、cidification、Pは 私は外因性コントロールとDの ilutionをsotopic、阻害をrotease）、今後の研究では、この技術の修正を使用してもよいです。同位体の外因性コントロールの使用は必須であるため、迅速な処理を使用してリカバリにおける最大の改善を示しているペプチドを評価するために、パイロット研究に限定されないことがあります。他のペプチドを評価するときにまた、また、プロテアーゼ阻害剤カクテルの組成を改変することができます。新しいペプチドを測定した場合しかし、これは、テストする必要があります。
要約すると、血液処理の迅速な方法は、ヒトの血液のために使用され、非常に標準的な血液処理と比較して試験した9/9のペプチドの回収率を向上させることができます。回復の緩やかな改善にわずかないくつかのペプチドのためので、必要性を認められましたメソッドの新しいペプチドを分析するときにテストする必要があります。アシルグレリンのために示されるようにまた、RAPID方法は、正しい分子形態の検出を可能にし、また、かなり標準的な血液処理と比較して、このようなキスペプチンとしてのペプチドの内因性の循環レベルの収量を増加させます。したがって、この方法は、 例えば 、ペプチドレベルを循環評価する人間の研究に有用なツールであるべきです。空腹と満腹感の調節に関与するもの。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、教育研究03IPT614A（CG）のためのドイツの研究財団STE 1765 / 3-1（AS）とドイツ省によってサポートされていました。私たちは、その優れた技術サポートだけでなく、身体測定値の組織と実行のヘルプのためのカリン・ヨハンソンとクリスティーナHentzschelためのラインハルト・ロンメルとペトラブッセに感謝します
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| Antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| Leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| Chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| Acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| Glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| Insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| Leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| Kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| Nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| Somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 mm x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
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