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Chemistry

Glycan नोड विश्लेषण: Glycomics के लिए एक नीचे अप दृष्टिकोण

Published: May 22, 2016 doi: 10.3791/53961
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Introduction

Glycolipids, ग्लाइकोप्रोटीन, प्रोटेयोग्लाईकैन्स, और glycosaminoglycans जटिल, विषम कार्बोहाइड्रेट सामूहिक ग्लाइकान के रूप में जाना के चार मुख्य वर्गों का गठन। के रूप में प्लाज्मा झिल्ली, glycocalyx, और बाह्य मैट्रिक्स और तरल पदार्थों का सर्वव्यापी और अभिन्न घटकों, ग्लाइकान endocytosis, intracellular तस्करी, सेल गतिशीलता, संकेत पारगमन, आणविक मान्यता, रिसेप्टर सक्रियण, कोशिका आसंजन, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के रूप में इस तरह के विभिन्न जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में हिस्सा लेना , कहनेवाला संचार, immunosurveillance, और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया दीक्षा। जीवन के लगभग हर क्षेत्र में 1 वर्तमान, glycosyltransferases रूप में जाना जाता एंजाइमों कि glycan पॉलिमर का निर्माण ग्लाइकोसाइड हाइड्रोलिसिस (भी glycosidases रूप में जाना जाता है, जो नीचे ग्लाइकान तोड़ने) के निर्माण के लिए, फिर से तैयार के साथ मिलकर काम करते हैं, और अंत में glycan पॉलिमर 2 को अंतिम रूप उत्पादन। प्रत्येक glycosyltransferase अलग glycoconjugates पर काम कर सकते हैं, एक glycosyltransferaseआम तौर पर न्युक्लेओफ़िलिक स्वीकारकर्ताओं का एक खास वर्ग (जैसे, एक लिपिड, पॉलीपेप्टाइड, न्यूक्लिक एसिड, या बढ़ती करने के लिए एक विशेष सक्रिय न्यूक्लियोटाइड चीनी दाता (जैसे, सकल घरेलू उत्पाद-fucose) की मोनोसैकराइड आधा भाग के हस्तांतरण से एक linkage- और anomer विशेष glycosidic बंधन forges oligosaccharide)। यह अनुमान लगाया गया है कि प्रोटीन (विशेष रूप से झिल्ली और स्रावी प्रोटीन) के 50 से अधिक% के बाद translationally ग्लाइकोसिलेशन द्वारा संशोधित कर रहे 3 प्रारंभिक मिश्रित गणना काफी परिवर्तनशीलता, चंचलता, और विशिष्टता ग्लाइकोसिलेशन द्वारा ग्लाइकोप्रोटीन को दी लिए एक प्रशंसा प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, यदि एक पॉलीपेप्टाइड सब्सट्रेट केवल 10 ग्लाइकोसिलेशन स्थलों की है और प्रत्येक साइट के केवल 3 अलग मोनोसैकराइड को कम करने के सिरों में से 1 के साथ एक glycosidic संबंध फार्म कर सकते हैं, तो फिर, सैद्धांतिक रूप से, अंतिम ग्लाइकोप्रोटीन 3 से 10 = 59,049 विशिष्ट पहचान मान सकते हैं। ग्लाइकोप्रोटीन में, glycosidic लिंकेज सामान्यतः पक्ष श्रृंखला नाइट्रोजन ओ के साथ फार्मअनुक्रम Asn-X-सेवा में च asparagine अवशेषों / Thr एन सेरीन और threonine अवशेषों की 2 और पक्ष श्रृंखला hydroxyls -glycans हे -glycans 4 उपज उपज (एक्स प्रोलाइन को छोड़कर किसी भी एमिनो एसिड) हो सकता है। एक सेल के glycome की संरचना (यानी, ग्लाइकोसिलेशन उत्पादों के अपने पूरक) अद्वितीय और सीमित है, क्योंकि कुछ अपवादों के साथ, glycosyltransferases सख्त दाता, स्वीकर्ता, और लिंकेज विशिष्टता दिखा रहे है। 5 महत्वपूर्ण और प्रचुर मात्रा में रक्त प्लाज्मा ग्लाइकोप्रोटीन एक बहाव के परिणाम के रूप में न्यायपालिका ग्लाइकोसिलेशन पीड़ित असामान्य glycosyltransferase अभिव्यक्ति और गतिविधि के कई रोग की स्थिति, विशेष रूप से कैंसर और भड़काऊ रोगों के कारण है। 6-24

मुख्य रूप से epigenetic कारकों की वजह से, glycome स्तनधारी जीनोम के लगभग 1% गठन, संशोधन को कूटबद्ध जबकि काफी अधिक विविध गतिशील, और proteome और transcriptome से जटिल है। 25,26, औरग्लाइकान की विधानसभा, एक गैर टेम्पलेट चालित ढंग-एक चिह्नित विपरीत में 27 ग्लाइकोसिलेशन आगम पॉलीपेप्टाइड और न्यूक्लिक एसिड biosynthesis करने के लिए। रिश्तेदार मात्रा और ग्लाइकोसिलेशन एंजाइमों और पोषक तत्व और अग्रदूत उपलब्धता के रूप में इस तरह के पर्यावरणीय कारकों की गतिविधि के बीच परस्पर क्रिया अंततः प्रकृति, दर, और ग्लाइकोसिलेशन की हद तक निर्धारित करता है। 5,28 Embryogenesis (जैसे, दृढ़ संकल्प और भेदभाव), सेलुलर सक्रियण, और प्रगति के माध्यम से सेल चक्र प्रभाव जीन अभिव्यक्ति (यानी, प्रतिलेखन और अनुवाद) और पहचान और उपलब्ध glycosyltransferases की मात्रा, जिसका गतिविधि सेल के glycan प्रोफ़ाइल के तत्काल नदी के ऊपर निर्धारक है परिवर्तन। क्योंकि (कुछ) proliferative, चिपकने वाला, और कैंसर कोशिकाओं के आक्रामक गुण साधारण embryogenic कोशिकाओं, glycan biosynthetic रास्ते (जैसे, अग्रदूत संचय, नियंत्रण मुक्त अभिव्यक्ति, aberran में विशिष्ट परिवर्तन की उन जैसे लगते हैं। टी संशोधन, संरचनात्मक ट्रंकेशन, या उपन्यास गठन) के रूप में सार्वभौमिक कैंसर बायोमार्कर कि ट्यूमर गठन, प्रगति, प्रवास, और आक्रमण 29 के विभिन्न चरणों से संकेत मिलता है हालांकि ग्लाइकोसिलेशन अत्यधिक जटिल, जाहिर है केवल ग्लाइकोसिलेशन में कुछ परिवर्तन कैंसरजनन और मेटास्टेसिस सक्षम कर सकते है की सेवा; जाहिर है, कुछ "न्यायपालिका" ग्लाइकोसिलेशन उत्पादों वास्तव में प्रतिरक्षा मान्यता से बचने और दुर्गम intravascular और मेटास्टेटिक वातावरण में पलायन की मांग को जीवित करने के लिए उन्हें सक्षम करने से कैंसर कोशिकाओं को फायदा होगा। 28,30,31 आश्चर्य नहीं, कि प्रयोगों में खलल न डालें या बदल के पैटर्न को रोकने से पता चला है जीन अभिव्यक्ति और न्यायपालिका glycan गठन बहरहाल tumorigenesis रोक सकते हैं। 29, न्यायपालिका एक biofluid नमूना (जैसे, मूत्र, लार, और रक्त प्लाज्मा या सीरम) में पाया ग्लाइकान कैंसर के प्रत्यक्ष संकेतक (या किसी अन्य रोग), बल्कि नीचे की ओर नहीं हो सकता सूक्ष्म अभी तक महत्वपूर्ण के परिणामोंप्रतिरक्षा प्रणाली या एक अप्रत्याशित अंग में एक सांघातिक हालत की मात्रात्मक नतीजों में बदल जाता है। 32

वे glycome के बारे में व्यापक जानकारी, कई आणविक बातचीत के आधार पर Glycomics तकनीक (जैसे, लेक्टिन / एंटीबॉडी और चयापचय / सहसंयोजक लेबलिंग) प्रदान हालांकि पूरे glycan संरचनाओं का पता लगाने पर निर्भर करते हैं और अलग-अलग ग्लाइकान के बारे में विस्तृत जानकारी संरचनात्मक प्रदान नहीं करते। उल्लेखनीय इसके विपरीत, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) की पहचान में मदद मिलेगी और व्यक्ति glycan संरचनाओं यों और पॉलीपेप्टाइड कोर के लिए लगाव साइटों के रूप में इस तरह के संरचनात्मक जानकारी प्रकट कर सकते हैं। नियंत्रण मुक्त अभिव्यक्ति या केवल एक glycosyltransferase की गतिविधि कई ग्लाइकोसिलेशन रास्ते में हानिकारक आणविक घटनाओं की एक झरना आरंभ कर सकते हैं। क्योंकि प्रत्येक glycosyltransferase एक से अधिक glycoconjugate सब्सट्रेट पर और अलग से बढ़ glycan पॉलिमर भर में काम कर सकते हैं, अविनियमित biosynthetic cascades उपज disproportionally बड़ा पूल की तुलना में केवल एक glycan उत्पाद की मात्रा लेकिन अंतर या बाह्य तरल पदार्थ में न्यायपालिका ग्लाइकान के कई विषम कक्षाओं में वृद्धि हुई। 33 हालांकि, इस तरह के अनूठे न्यायपालिका ग्लाइकान कभी कभी कैंसर या अन्य glycan-भावात्मक विकृतियों क्योंकि लिए बायोमार्कर के रूप में अव्यावहारिक माना जाता है, की अच्छी तरह विनियमित ग्लाइकान, इन न्यायपालिका ग्लाइकान एक बहुत छोटा सा अंश है कि अक्सर भी मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में इस तरह के अति संवेदनशील तकनीक द्वारा undetectable रह सकती है प्रतिनिधित्व करते हैं। उदाहरण के लिए, अंतर और बाह्य शरीर के तरल पदार्थ में, व्यापक प्रोटीन एकाग्रता स्पेक्ट्रम (जो परिमाण के आठ आदेशों तक फैला) दुर्लभ ग्लाइकोप्रोटीन कि अधिक प्रचुर मात्रा में प्रजातियों द्वारा नकाबपोश कर रहे हैं का पता लगाने को रोका जा सकता। 32 इसके अलावा, glycosyltransferase गतिविधि का निर्धारण करने के लिए एक काफी व्यावहारिक बनी हुई है और सैद्धांतिक चुनौती है क्योंकि कई glycosyltransferases नैदानिक ​​biofluids में अनुपस्थित या निष्क्रिय पूर्व vivo हो जाते हैं। Consisten की कठिनाई के बावजूदtly का पता लगाने और अद्वितीय पूरे ग्लाइकान की अल्ट्रा मिनट मात्रा बढ़ाता, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के चिकित्सकों नैदानिक ​​मार्कर के रूप में बरकरार ग्लाइकान रोजगार की ओर भारी प्रगति की है। हमने हाल ही में बरकरार ग्लाइकान का विश्लेषण करने के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है कि, रोजगार जीसी एमएस, सभी घटक शाखा-बिंदु और लिंकेज-विशिष्ट monosaccharides ( "glycan नोड्स") है कि एक साथ प्रत्येक glycan करने के लिए और कई में विशिष्टता प्रदान का पता लगाने की सुविधा विकसित किया है मामलों सीधे रूप में आणविक surrogates कि दोषी glycosyltransferase (एस) के रिश्तेदार गतिविधि यों सेवा करते हैं।

इसके बाद से पहली बार 1958 में glycan विश्लेषण करने के लिए सीधे आवेदन सूचना दी, गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) एक शक्तिशाली तकनीक साबित कर दी है, 34 प्रति-methylated मोनो और डिसैक्राइड विश्लेषण उनकी anomericity और निरपेक्ष विन्यास निर्धारित करते हैं, और बाद में बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण के लिए उन्हें अलग करने के लिए। 35 1984 और 2007, Ciucanu और सहयोगियों के बीचशुरू की है और एक ठोस चरण glycan permethylation तकनीक है कि सोडियम हाइड्रोक्साइड और iodomethane कार्यरत हैं, permethylated ग्लाइकान की तरल / तरल निष्कर्षण के द्वारा पीछा पानी और क्लोरोफॉर्म। 35,36 का उपयोग कर परिष्कृत 2005 और 2008 के बीच, कांग और सह कार्यकर्ताओं एकीकृत एक समय की बचत स्पिन permethylation कदम में -column दृष्टिकोण। 37,38 2008 में, Goetz अनुसंधान समूह की तुलना और संभावित आक्रामक और गैर भेद करने के लिए मैट्रिक्स की मदद से लेजर desorption-आयनीकरण (MALDI) मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग glycan-प्रोफाइलिंग विधि permethylation एक मात्रात्मक ठोस चरण तैयार -invasive स्तन कैंसर की कोशिकाओं, 39 तो, 2009 में, Goetz टीम संयुक्त एंजाइमी और रासायनिक रिलीज तकनीक एक उच्च क्षारीय ठोस चरण permethylation योजना में फोड़ना करने हे बरकरार ग्लाइकोप्रोटीन से -glycans 40 यद्यपि Goetz प्रक्रिया एक साथ permethylation और रासायनिक रिहाई में मदद की। हे -glycans की, यह केवल पूर्व पृथक glyco करने के लिए लागू किया गया थाप्रोटीन। हम 2013 में इस तकनीक को संशोधित और trifluoroacetic एसिड को शामिल करके पूरे unfractionated biofluids और homogenized ऊतकों के नमूनों के लिए इसे अनुकूलित (टीएफए) हाइड्रोलिसिस, कमी, और एसिटिलीकरण कदम। 33 इन अतिरिक्त कदम भी glycolipids और एन से ग्लाइकान रिलीज ग्लाइकान ग्लाइकोप्रोटीन से से जुड़े और कन्वर्ट आंशिक रूप से मिथाइल एसीटेट alditol (PMAAs, चित्रा 1), जिसका विशिष्ट मेथिलिकरण और एसिटिलीकरण पैटर्न जीसी एमएस और विशिष्ट द्वारा विश्लेषण की सुविधा मूल बरकरार glycan बहुलक 41 (चित्रा 2) में संविधान glycan नोड्स को चिह्नित में उन्हें। 33 अंतत: यह प्रक्रिया इस तरह के "मूल fucosylation", "6-sialylation", "GlcNAc bisecting", और "बीटा 1-6 शाखाओं में बंटी 'के रूप में अद्वितीय glycan सुविधाओं के प्रत्यक्ष, रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के आधार पर एक जटिल biofluid में सभी ग्लाइकान की एक समग्र चित्र का उत्पादन - प्रत्येक एक एकल जीसी एमएस chromatograp से निकाली गईयहाँ शिखर। यह लेख permethylation के आगे अनुकूलन, एसिटिलीकरण, अलगाव, और रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के मोड में सुधार के साथ-साथ साफ-अप चरणों प्रस्तुत करता है।

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Protocol

सावधानी: इस प्रयोग में इस्तेमाल किया अभिकर्मकों से किसी के साथ त्वचा / आँख से संपर्क करने से बचें। जोखिम पर, अच्छी तरह से पानी के साथ प्रभावित क्षेत्र फ्लश और तत्काल चिकित्सक से सलाह लें।

1. Permethylation और glycan निष्कर्षण

  1. कॉलम तैयारी
    1. प्राप्त के रूप में कई microfuge स्पिन स्तंभ इकाइयों के रूप में नमूनों का विश्लेषण किया जाना है। तोड़ और प्लास्टिक ट्यूब जलाशय टोपियां अलग। प्रत्येक जलाशय ट्यूब में एक microfuge मिनी फिल्टर रखें। इकट्ठे microfuge स्पिन स्तंभों (मिनी फिल्टर युक्त) एक microfuge ट्यूब रैक में रखें।
    2. (NaOH) मोती (20-40 जाल) सोडियम हाइड्रॉक्साइड के एक शेयर प्राप्त करते हैं। एक छोटा सा वजन नाव के लिए कुछ NaOH के स्थानांतरण या, अगर नमी clumping, NaOH के काम कर स्टॉक के रूप में एक गर्म चीनी मिट्टी के बरतन मोर्टार पैदा कर रहा है। NaOH या कुचल / पाउडर NaOH के मोतियों की झुरमुटों के प्रयोग से बचें।
      सावधानी: NaOH एक शक्तिशाली विष और संक्षारक आधार है। फ्लश उजागर त्वचा / 15 मिनट के लिए पानी के साथ आँखें। Thoroughly प्रयोग पूरा करने के बाद कार्यक्षेत्र साफ।
    3. एक छोटे से स्कूप या रंग का उपयोग, काम स्टॉक से NaOH मोती हस्तांतरण (सीमा से नीचे 5 मिमी ~) पहला बाहरी उठाव के लिए ऊपर NaOH के साथ microfuge मिनी फिल्टर भरने के लिए। पीठ टॉप पैक / NaOH मोती गाढ़ा करने पर भरा microfuge फिल्टर टैप करें।
      नोट: इस प्रयोग के दौरान, हीड्रोस्कोपिक NaOH मोतियों से अत्यधिक पानी सोखना को कम NaOH स्तंभ पैकिंग की सतह से ऊपर किसी भी जोड़ा तरल पदार्थ का स्तर (जैसे, acetonitrile, डाइमिथाइल sulfoxide, analyte समाधान) को बनाए रखने और हवा के साथ सीधे संपर्क को सीमित करना।
    4. acetonitrile (ACN) के एक शेयर प्राप्त करते हैं। स्थानांतरण ~ 350 μl प्रत्येक NaOH पैक microfuge मिनी फिल्टर करने के लिए ACN। NaOH एसीएन के तहत जलमग्न रखें और एक टिप-crimped जेल लोडिंग विंदुक टिप के साथ सरगर्मी से बड़े हवाई बुलबुले को दूर।
      सावधानी: Acetonitrile एक ज्वलनशील अड़चन है।
    5. कॉलम केन्द्रापसारण
      1. संतुलित रूप से एक सेंट्रीफ्यूज के अंदर microfuge कॉलम व्यवस्थित; एक संतुलन ट्यूब का उपयोग यदि आवश्यक है। सेंट्रीफ्यूज के अंदर किसी भी NaOH कणिकाओं spilling से बचें। सेंट्रीफ्यूज ढक्कन बंद कर दें।
      2. अपकेंद्रित्र स्तंभों के लिए ~ 15 सेकंड में 2,400 × छ (NaOH और एसीएन युक्त)।
      3. centrifugation के पूरा होने पर, सेंट्रीफ्यूज से microfuge कॉलम को हटाने, और एक खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में ACN त्यागें। NaOH स्तंभ बरकरार पैकिंग रखें।
    6. ~ 350 μl डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) प्रत्येक NaOH पैक microfuge मिनी फिल्टर करने के लिए जोड़ें। NaOH DMSO के तहत जलमग्न रखें और एक विंदुक टिप के साथ किसी भी बड़े हवाई बुलबुले को दूर। पहले से 2,400 × छ पर के लिए ~ 15 सेकंड में वर्णित है, सेंट्रीफ्यूज स्तंभों के रूप में, और DMSO त्यागने बरकरार पैकिंग NaOH रखते हुए।
      सावधानी: DMSO एक उत्परिवर्तजन और अड़चन है और आसानी से त्वचा के माध्यम से अवशोषित कर लेता है।
    7. प्लग स्पिन फिल्टर में शामिल के साथ सभी microfuge मिनी फिल्टर प्लगकिट। स्थानांतरण ~ 350 μl DMSO प्रत्येक NaOH पैक microfuge मिनी फिल्टर करने के लिए और NaOH पैकिंग में हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग करें ताकि DMSO तो NaOH पैकिंग के भीतर सभी क्षेत्रों तक पहुँचता है। पेराई या जरूरत से ज्यादा NaOH मोती स्क्रैप से बचें, NaOH पाउडर अवांछनीय है। इस कदम के रूप में तेजी से संभव के रूप में समाप्त करें।
  2. प्लाज्मा गुणवत्ता नियंत्रण की तैयारी (क्यूसी) नमूना (s)
    नोट:     प्रयोगात्मक बैचों भर में लगातार परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, एक नमूना ब्याज की जैविक सामग्री की एक बड़ी, सजातीय थोक संग्रह से लिया प्रत्येक बैच में विश्लेषण किया जाना कम से कम एक विभाज्य प्रयोग करने पर विचार। उदाहरण के लिए, यदि रक्त प्लाज्मा का विश्लेषण करने, प्रत्येक बैच में क्यूसी नमूना (एस) के रूप में रक्त प्लाज्मा के एक थोक संग्रह का विभाज्य (एस) का उपयोग करें। अज्ञात नमूने के रूप में एक ही तरीके से प्रक्रिया क्यूसी नमूने हैं।
    1. अपकेंद्रित्र ~ 10,000 × छ पर 4 मिनट के लिए क्यूसी प्लाज्मा के एक शेयर नमूना। centrifugation के दौरान, कुछ उच्च घनत्व वेग वें करने के लिए व्यवस्थित कर सकते हैंई नीचे और कुछ कम घनत्व वेग प्लाज्मा के ऊपर फ्लोट कर सकते हैं। दोनों जब हटाने प्लाज्मा के विभाज्य (एस) से बचें।
    2. "1.3) नमूना तैयार" नीचे करने के लिए आगे बढ़ें। फिर, इस कदम पर लौटने प्लाज्मा centrifugation पूरा होने के बाद।
    3. centrifuged क्यूसी प्लाज्मा के 9 μl वापस लेने और एक उचित लेबल 1.5 मिलीलीटर polypropylene परीक्षण एक स्नैप-बंद टोपी के साथ सुसज्जित ट्यूब को हस्तांतरण (इसके बाद "के रूप में 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब" कहा जाता है)। प्रत्येक विभाज्य विआयनीकृत पानी की 1 μl जोड़ें; अगर वांछित, आंतरिक मानक (एस) के लिए एक कैरियर के रूप में इस का उपयोग करें।
    4. इस प्लाज्मा नियंत्रण करने के लिए 270 μl DMSO जोड़ें। भंवर पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए।
  3. नमूना तैयार करना
    1. जैविक (analyte) नमूनों की संख्या के रूप में कई 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब प्राप्त करते हैं।
    2. स्थानांतरण 9 अपनी इसी 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब करने के लिए प्रत्येक जैविक (analyte) नमूने के μl। स्थानांतरण 1 विआयनीकृत पानी और 27 के μlप्रत्येक नमूना ट्यूब 0 μl DMSO।
    3. सख्ती मिश्रण (जैसे, भंवर और / या बार-बार पिपेट अप और डाउन) के नमूने DMSO में पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए।
      सावधानी: एक धूआं हुड के अंदर निम्न चरणों का प्रदर्शन। उतार-चढ़ाव भरे प्लास्टिक के कुछ प्रकार भंग करने में सक्षम तरल पदार्थ निम्नलिखित कदम, iodomethane (सीएच 3 मैं), क्लोराइड (सीएच 2 सीएल 2, क्लोराइड उर्फ), और क्लोरोफॉर्म (CHCl 3, trichloromethane), में किया जाता है (उदाहरण के लिए, nitrile दस्ताने) । विलायक प्रतिरोधी दस्ताने का उपयोग सुनिश्चित करें। उनके कम चिपचिपापन और उच्च वाष्प दबाव के कारण, इन अभिकर्मकों स्थानांतरण के दौरान एक विंदुक टिप से टपक कर सकते हैं। शेयर समाधान प्राप्त पोत से सटे धारण करके अभिकर्मक नुकसान और संभावित जोखिम को कम।
    4. एक छोटी सी, स्वच्छ ट्यूब को iodomethane की पर्याप्त कुल मात्रा स्थानांतरण। प्रत्येक analyte नमूना 105 μl iodomethane की आवश्यकता होगी। स्थानांतरण ~ 500 μl anoth में क्लोराइडस्वच्छ ट्यूब इंजी। सिरिंज clogging रोकने के लिए, तुरंत iodomethane हस्तांतरण के बाद क्लोराइड के साथ सिरिंज कुल्ला।
      सावधानी: Iodomethane, सहज अस्थिर है, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को नुकसान पहुँचाए या मौत के कारण अगर साँस या किया जाता का शक्तिशाली विष सक्षम। DICHLOROMETHANE एक संभावित कैसरजन, प्रजनन उत्परिवर्तजन, और कई अंगों को नुकसान पहुँचाए या मौत के कारण का प्रबल अड़चन सक्षम है।
    5. प्रत्येक analyte नमूने के लिए 105 μl iodomethane जोड़ने के लिए एक विश्लेषणात्मक सिरिंज का प्रयोग करें। कैप analyte नलियों तुरंत iodomethane वाष्पीकरण कम से कम। अच्छी तरह से भंवर और, यदि आवश्यक हो तो, संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज सभी नमूनों सुनिश्चित करें कि कोई तरल टोपी में रहता है। किसी भी रंग बदलने (जैसे, भूरे रंग बैंगनी, या पीले रंग के लिए) iodomethane गिरावट है, जो निम्नलिखित permethylation प्रतिक्रिया को खतरे में डाल सकता है का संकेत है।
    6. विश्लेषणात्मक क्लोराइड के साथ iodomethane हस्तांतरण करने के लिए कम से कम 3 बार इस्तेमाल किया सिरिंज कुल्ला। यह यह इधर-उधर कर पाएगाएम clogging। इस कुल्ला के निपटान, अतिरिक्त iodomethane और एक कार्बनिक अपशिष्ट खतरनाक बर्तन में क्लोराइड के साथ। टेस्ट ट्यूब का इस्तेमाल किया एक खतरनाक अपशिष्ट कंटेनर में रखें।
    7. 2 मिलीलीटर की प्लास्टिक जलाशय नलियों का एक नया सेट प्राप्त करते हैं। निकालें स्नैप-टोपी अगर वांछित।
    8. microfuge मिनी फिल्टर हाल चलाना। अपकेंद्रित्र 2,400 × छ 15 सेकंड, और उसके बाद के लिए अनप्लग कॉलम DMSO के प्रवाह के साथ-साथ जलाशय नलियों त्यागें।
    9. centrifuged स्पिन स्तंभों को फिर से प्लग, और उन्हें नए जलाशय ट्यूबों के अंदर जगह है। संख्या प्रत्येक स्पिन स्तंभ और एक ही नमूना संख्या के साथ अपनी इसी जलाशय ट्यूब। सुनिश्चित करें कि मिनी फिल्टर प्लग तंग कर रहे हैं; संभावित रिसाव अगले कदम को प्रभावित कर सकते हैं। स्पिन स्तंभों से DMSO हटाने और स्पिन स्तंभों पर analyte नमूने के हस्तांतरण के बीच के समय को कम।
    10. Permethylation
      1. मात्रात्मक अपनी इसी NaOH मनका-भरा microfuge स्पिन सह करने के लिए प्रत्येक नमूना समाधान के लिए स्थानांतरणlumn। इस कदम के लिए 1,000 μl पिपेट टिप का उपयोग करें। हस्तांतरण के बाद, समेटना ~ 2 एक 200 μl टिप के अंत की मिमी और स्तंभ सामग्री में इसे छोड़ने के एक दोषी के रूप में उपयोग करने के लिए। सभी नमूनों के लिए दोहराएँ।
        नोट: iodomethane की कम चिपचिपापन नमूना नुकसान हो सकता है क्योंकि analyte समाधान स्थानांतरण के दौरान विंदुक टिप से टपक कर सकते हैं। नमूना ट्यूब और स्पिन स्तंभ एक दूसरे के निकट एक हाथ से पकड़, और तेजी से दूसरे हाथ से नमूना समाधान हस्तांतरण।
      2. permethylation प्रतिक्रिया 11 मिनट के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें। इस अवधि के दौरान प्रत्येक नमूना कम से कम 4-5 बार हिलाओ। कुशल permethylation, जो NaOH के मोतियों की सतह पर होता है की सुविधा के लिए, टिप-crimped जेल लोडिंग पिपेट सुझावों का उपयोग के रूप में stirrers धीरे स्तंभ सामग्री मिश्रण करने के लिए। आक्रामक मिश्रण, स्पिन फिल्टर पंचर कर सकते घोटना और NaOH मोती निलंबित (जो बाद में तरल / तरल निष्कर्षण के प्रभाव को कम कर सकते हैं), और / या नमूना नुकसान (कारण SA के रूप मेंNaOH कणिकाओं कर सकते हैं mple लथपथ स्तंभ से अतिप्रवाह)।
      3. बाद में तरल / तरल निष्कर्षण कदम के लिए तैयार करने में, एक 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर (7.0 पीएच) में 0.5 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl) समाधान के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सके। प्रत्येक नमूना तरल / तरल निष्कर्षण के सभी तीन चक्रों के लिए ~ 12 मिलीलीटर NaCl समाधान की कुल आवश्यकता होगी।
      4. 11 मिनट permethylation अवधि के पूरा होने पर, तुरंत अभी तक ध्यान से कॉलम हाल चलाना और 2,400 × छ 15 सेकंड के लिए उन्हें अपकेंद्रित्र। प्लग त्यागें।
    11. इसके तत्काल बाद सेंट्रीफ्यूज से स्पिन स्तंभों को हटाने और उन्हें खाली स्पिन जलाशय नलियों का एक नया सेट में जगह है, प्रवाह के माध्यम से पीछे हौसले permethylated ग्लाइकान युक्त समाधान छोड़ने। कुछ भी नहीं छोड़ें।
    12. जितनी जल्दी हो सके, सूखी, NaOH से भरे स्पिन फिल्टर करने के लिए 300 μl acetonitrile (ACN) जोड़ें। पर 9,600 × छ 30 सेकंड के लिए स्पिन फिल्टर अपकेंद्रित्र।
    13. immediatelY इसके बाद मुख्य permethylation हल हस्तांतरण (यानी, समाधान है कि 11 मिनट की तो पिछले चरण में ACN के 300 μl के अलावा पहले एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्पिन फिल्टर के माध्यम से काता के लिए NaOH के मोतियों के साथ incubated था) silanized करने के लिए 13 x 100 मिमी ग्लास टेस्ट ट्यूब 42 3.5 0.2 एम सोडियम फास्फेट 0.5 एम NaCl, पीएच 7.0 से युक्त बफर और मिश्रण (भंवर) तुरंत मिलीलीटर से युक्त। इस कदम के दौरान किसी भी ठोस सफेद अवशेषों को स्थानांतरित करने से बचें। अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले प्रत्येक नमूना के लिए यह करो।
    14. देरी के बिना, हस्तांतरण (गठबंधन) एसीएन स्पिन के माध्यम से प्रत्येक जलाशय ट्यूब में (साथ) अपने संबंधित silanized ग्लास ट्यूब में तरल नमूना के बाकी और मिश्रण (भंवर) तुरंत करने के लिए। फिर, इस कदम के दौरान किसी भी ठोस सफेद अवशेषों को स्थानांतरित करने से बचें। कैप, शेक, और भंवर ग्लास ट्यूब। प्रत्येक नमूना के लिए दोहराएँ। उचित कचरे के कंटेनर में NaOH कॉलम और पाश्चर pipettes त्यागें।
  4. तरल / तरल अतिरिक्तction और glycan शोधन
    1. धूआं हुड के अंदर, प्रत्येक नमूने के लिए 1.2 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म जोड़ें। इसके तत्काल बाद, silanized ग्लास ट्यूब टोपी और सख्ती सामग्री मिश्रण।
    2. एक वाष्पीकरण कई गुना में लगभग 75 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्मी धातु ब्लॉकों। कुओं कि × 100 मिमी ग्लास ट्यूब 13 मिमी समायोजित कर सकते हैं के साथ हीटिंग ब्लॉकों का प्रयोग करें।
    3. silanized पाश्चर pipettes, गैर silanized पाश्चर pipettes, और टोपी के साथ silanized गिलास टेस्ट ट्यूब का एक नया सेट प्राप्त करते हैं।
      सावधानी: क्लोरोफॉर्म (CHCl 3) एक अड़चन, उत्परिवर्तजन, और संभावित दस्ताने के कुछ प्रकार के माध्यम से permeating में सक्षम कैसरजन है।
    4. संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज (~ 3,000 × छ) नमूना युक्त ग्लास ट्यूब जलीय और जैविक परतों को अलग करने के लिए।
    5. एक गैर-silanized पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें कि जलीय परत की ~ 3 मिमी नीचे कार्बनिक परत के ऊपर बनी हुई है शीर्ष जलीय परत इस तरह की पर्याप्त निकालने के लिए।
    6. 0.5 एम ना के 3.5 मिलीलीटर जोड़ेंप्रत्येक ग्लास ट्यूब के लिए एक 0.2 एम सोडियम फॉस्फेट बफर में सीएल समाधान (7 पीएच), सख्ती मिश्रण, और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज (~ 3,000 × छ)। पिछले चरण (1.4.3) के रूप में, एक गैर silanized पाश्चर विंदुक का उपयोग जलीय परत निकालने के लिए।
    7. पिछले चरण (1.4.4) दोहराएँ, लेकिन छोड़ ~ जलीय परत के 1 मिलीलीटर।
    8. एक स्वच्छ और उचित लेबल silanized 13 × 100 मिमी ग्लास टेस्ट ट्यूब के लिए जैविक परत हस्तांतरण के लिए एक साफ silanized पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें। निम्नलिखित तरीके से निकालने के द्वारा जलीय संक्रमण से बचने:
      1. दोनों वर्तमान और नए silanized गिलास टेस्ट ट्यूब एक हाथ में एक-दूसरे से सटे पकड़ो। दूसरे हाथ से, जबकि जलीय परत के माध्यम से नीचे पिपेट डालने बुलबुले बनाने के लिए पिपेट बल्ब दबाएँ।
      2. एक बार जब कार्बनिक परत के अंदर, बुलबुले बनाने बंद करो, और पिपेट बल्ब जैविक और जलीय परतों को स्थिर और फिर से अलग करने के लिए अनुमति देने के लिए स्थिर पकड़। फिर, धीरे-धीरे संगठन के रूप में ज्यादा के वापस लेने के लिए बल्ब जारीसंभव के रूप में सी परत किसी भी जलीय संदूषण के बिना।
      3. तेजी से जलीय परत के माध्यम से विंदुक टिप बढ़ा है, और थोड़ा बल्ब (जो कुछ जलीय प्रदूषण को वापस लेने में यह परिणाम) जारी करते हुए ट्यूब से बाहर पिपेट जुटाने के प्राकृतिक पलटा का विरोध।
      4. तेजी से सटे नया ट्यूब कम चिपचिपापन कार्बनिक परत हस्तांतरण। किसी भी जलीय प्रदूषण को नई ग्लास ट्यूब में निकाले कार्बनिक परत के शीर्ष पर छोटे तरल बूंदों के रूप में दिखाई जाएगी। अगर जलीय / NaCl संदूषण दिखाई दे रहा है, एक विंदुक के साथ इसे हटाने; अपकेंद्रित्र अगर एक भी छोटी बूंद में जलीय बूंदों पूल करने की जरूरत है।
    9. ठीक से पुराने ग्लास ट्यूब, pipettes, और जलीय और जैविक कचरे के निपटान के समाधान। धो और ग्लास ट्यूब टोपियां रीसायकल।
    10. एक धूआं हुड के अंदर ~ 5 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर एक preheated वाष्पीकरण कई गुना में नाइट्रोजन की एक कोमल और निरंतर प्रवाह के तहत सभी नमूनों सूखी। सभी सूखी-नीचे काएं दौरान बाष्पीकरणीय ठंडा सुनिश्चित करने के लिएपुनश्च, नाइट्रोजन का एक कोमल और निरंतर प्रवाह splashing या तरल spattering बिना तरल सतह को परेशान करना चाहिए। अंतिम नमूना की पूरी सूखने पर वाष्पीकरण कई गुना से नमूने निकालें। एक सूखे ग्लास ट्यूब के नीचे सफेद specks बफर / NaCl संदूषण का संकेत मिलता है।
    11. यहाँ प्रक्रिया रोकें अगर वहाँ पर्याप्त समय दिन में शेष टीएफए हाइड्रोलिसिस चरण को पूरा करने के लिए नहीं है। अस्थायी रूप से (यानी, रातोंरात) सूखी नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। भंडारण के बाद प्रक्रिया जारी है, -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से नमूने को हटाने और उन्हें uncapping से पहले पूरी तरह से गर्म करने के लिए अनुमति देने के लिए।
    12. नमूने गर्म, trifluoroacetic एसिड (टीएफए) हाइड्रोलिसिस (अगले चरण) के लिए तैयारी में, हीटिंग मेंटल सेट जबकि ऐसी है कि तरल टेस्ट ट्यूब सामग्री का तापमान 121 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाएगा। टीएफए स्टॉक से टीएफए समाधान तैयार (नीचे 2.1 कदम देखें)।

2. trifluoroacetic एसिड (टीएफए) हाइड्रोलिसिस

  1. विआयनीकृत पानी में एक 2.0 एम टीएफए के समाधान के लिए पर्याप्त मात्रा में तैयार करें। प्रत्येक analyte नमूना 2.0 एम TFA समाधान के 325 μl की आवश्यकता होगी। केंद्रित टीएफए 13.0 एम है
  2. प्रत्येक analyte नमूने के लिए 2.0 एम TFA के 325 μl जोड़ें। बाद में सुखाने कदम (नीचे 2.3) के दौरान टीएफए वाष्पीकरण और नमूना नुकसान को रोकने के लिए, कसकर टीएफए को जोड़ने के बाद तुरंत एक नमूना ट्यूब टोपी। सभी ग्लास ट्यूब में समाधान स्तर के निशान। अगले कदम से पहले अच्छी तरह से प्रत्येक नमूना भंवर।
  3. एक उपयुक्त पूर्व गर्म हीटिंग ब्लॉक में 2 घंटे के लिए कसकर छाया हुआ नमूना ट्यूबों सेते हैं या इस तरह ओवन कि सामग्री 121 डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुँचने। एक हीटिंग ब्लॉक के बजाय एक ओवन का उपयोग करते हैं, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर नमूना ट्यूबों ट्यूब के नीचे ट्यूब और नमूना अवशेषों का आंशिक सुखाने के शीर्ष पर टीएफए का संक्षेपण को रोकने के लिए। 20-30 मिनट के बाद नमूना समाधान स्तर की जांच।न्यूनतम टीएफए वाष्पीकरण सुनिश्चित करने के लिए। यदि आवश्यक हो, टोपियां आगे कस या एक तंग फिट करने के लिए टोपी की जगह।
  4. 2 घंटे की प्रतीक्षा के दौरान, अगले कदम (नीचे 2.4 देखें) के लिए 75 डिग्री सेल्सियस के लिए एक और वाष्पीकरण कई गुना निर्धारित किया है।
  5. जब 2 घंटे की अवधि हीटिंग ~ के लिए 15 मिनट नाइट्रोजन गैस की एक सौम्य धारा के तहत 75 डिग्री सेल्सियस पर पूरा, सूखी नमूने है। अधिक से अधिक 15 मिनट के लिए पहुंच से बाहर नमूने मत छोड़ो। अक्सर पूछे जाने वाले नमूनों की जांच, और हीटिंग और सुखाने बंद एक बार सभी नमूनों सूख रहे हैं।
  6. यहाँ प्रक्रिया रोकें अगर वहाँ पर्याप्त समय दिन में शेष कमी चरण को पूरा करने के लिए नहीं है। अस्थायी रूप से (यानी, रातोंरात) की दुकान -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने हैं। भंडारण के बाद प्रक्रिया जारी रखने के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से नमूने निकालें, और उन्हें uncapping से पहले पूरी तरह से गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं।

3. कमी

  1. एक धूआं हुड के अंदर, 1 एम ammoni में एक 10 जी / एल सोडियम borohydride के लिए पर्याप्त मात्रा में (NaBH 4) समाधान तैयारउम हाइड्रॉक्साइड (एनएच 4 OH)। प्रत्येक नमूना इस समाधान के 475 μl की आवश्यकता होगी। नमूने के प्रत्येक बैच के लिए एक ताजा समाधान करें। केंद्रित अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (27-30% w / w राष्ट्रीय राजमार्ग 3) लगभग 14.5 है एम
    सावधानी: सोडियम borohydride (NaBH 4) एक हीड्रोस्कोपिक, पानी प्रतिक्रियाशील विष और शक्तिशाली अड़चन है कि विज्ञप्ति-upon-पानी अत्यधिक ज्वलनशील वाष्प कि साँस लेना, घूस, या आंख / त्वचा से संपर्क करें पर गंभीर जलता पैदा साथ संपर्क करें।
    सावधानी: अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (एनएच 4 OH) एक संक्षारक अड़चन और विष गंभीर रूप से जल और साँस लेना, घूस, या आंख / त्वचा से संपर्क करें पर अपरिवर्तनीय अंग क्षति पैदा करने में सक्षम है। 30 मिनट के लिए पानी के साथ प्रभावित क्षेत्रों फ्लश, और मलाई या प्रभावित क्षेत्रों scratching से शिकार को रोकने के।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए, 1 एम एनएच 4 OH में 10 ग्राम / एल NaBH 4 के 475 μl जोड़ें। मिक्स नमूने अच्छी तरह से किसी भी अवशेषों को भंग करने के लिए। कैप टेस्ट ट्यूब औरकमी प्रतिक्रिया 1 घंटे के लिए जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. 1 घंटे की प्रतीक्षा के दौरान, 75 डिग्री सेल्सियस तक गर्म वाष्पीकरण कई गुना निर्धारित किया है। ग्लास ट्यूब के लिए उचित कुओं (नीचे 3.4 देखें) के साथ एक हीटिंग ब्लॉक का प्रयोग करें।
  4. जब 1 घंटे की प्रतिक्रिया की अवधि पूरी हो चुकी है, प्रत्येक नमूने के 63 μl मेथनॉल (MeOH) जोड़ें। एक अपेक्षाकृत अस्थिर तरल है कि 68 डिग्री सेल्सियस पर फोड़े - यह कदम और निम्नलिखित कदम trimethyl borate के रूप में अवशिष्ट बोरान को हटा दें।
  5. ~ के लिए 15 मिनट नाइट्रोजन गैस की एक सौम्य धारा के तहत 75 डिग्री सेल्सियस पर (पूर्व गर्म कई गुना में) सूखी नमूने हैं। अक्सर पूछे जाने वाले नमूनों की जांच और उन्हें छोड़ पहुंच से बाहर नहीं है। ग्लास ट्यूब के तल पर छोटे तरल बूंदों से संकेत मिलता है कि नमूना अभी तक सूखा नहीं है।
    नोट: तरल बूंदों से हवा के बुलबुले भेद करने के लिए, टेस्ट ट्यूब झुकाव। केवल तरल बूंदों झुकने के बाद कदम होगा, लेकिन बातचीत हमेशा सच नहीं है: अगर एक बुलबुला कदम नहीं करता है, यह अभी भी एक (बहुत छोटे) तरल छोटी बूंद हो सकता है।
  6. एक बार जब samplतों पूरी तरह से सूख रहे हैं, एक 9 तैयार: मेथनॉल (MeOH) और एसिटिक एसिड (AcOH) की 1 (वी / वी) समाधान। प्रत्येक नमूने के AcOH समाधान: इस MeOH के 125 μl जोड़ें।
  7. नाइट्रोजन गैस की एक सौम्य धारा के तहत 75 डिग्री सेल्सियस पर सूखी नमूने (एक पूर्व गर्म कई गुना में)।
  8. जब नमूने पूरी तरह से सूख रहे हैं, कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए नमूने वैक्यूम सूखी: (जैसे FoodSaver द्वारा बेचा उन के रूप में) एक प्लास्टिक वैक्यूम टब में प्लेस के नमूने, वैक्यूम ढक्कन बंद, वैक्यूम डायल करने के लिए "वैक्यूम" कनेक्ट सेट वैक्यूम नली, और वैक्यूम पर बारी। वैक्यूम जुदा करने के लिए, इन चरणों रिवर्स। प्रणाली के लिए प्रतीक्षा पूरी तरह वैक्यूम ढक्कन खोलने के लिए प्रयास करने से पहले दबाव हटाना।
  9. यहाँ प्रक्रिया रोकें अगर वहाँ पर्याप्त समय दिन में शेष कमी चरण को पूरा करने के लिए नहीं है। अस्थायी रूप से (यानी, रातोंरात) की दुकान -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूने हैं। भंडारण के बाद प्रक्रिया जारी है, -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से नमूने निकालें, और उन्हें uncappin से पहले पूरी तरह से गर्म करने के लिए अनुमति देने के लिएजी।
  10. नमूने वैक्यूम सूखी करने के लिए (या गर्म, भंडारण के बाद) इंतजार करते हुए, अगले कदम के लिए अभिकर्मकों तैयार करते हैं। प्राप्त करें और प्रत्येक नमूना के लिए नंबर एक silanized शंक्वाकार नीचे autosampler (एएस) शीशी (टोपी के साथ)। इसके अलावा, पूर्व गर्मी दोनों एक उथले-साथ ही शीशी हीटिंग ब्लॉक और एक गहरी अच्छी तरह से कांच-ट्यूब ब्लॉक कि इस तरह के ग्लास ट्यूब सामग्री 50 डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुंच जाएगा।

4. एसिटिलीकरण (एक धूआं हुड में प्रदर्शन)

  1. प्रत्येक नमूने के लिए विआयनीकृत पानी 18 μl जोड़ें। कैप और अच्छी तरह से सभी ट्यूबों भंवर पूरी तरह से किसी भी अवक्षेप भंग करने के लिए।
  2. प्रत्येक ग्लास ट्यूब के लिए 250 μl एसिटिक एनहाइड्राइड जोड़ें। कैप, अच्छी तरह से भंवर, और 2 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में sonicate किसी भी अवशेषों और अवक्षेप का पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए।
  3. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ग्लास ट्यूब कवर, और 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के एक आंतरिक तापमान पर सेते हैं।
  4. प्रत्येक नमूने के 230 μl केंद्रित trifluoroacetic एसिड (टीएफए) जोड़ें। इसके तत्काल बाद एक टोपीघ के नमूने मिश्रण। फिर, सेते नमूने से ढके एल्यूमीनियम के साथ पन्नी के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के एक आंतरिक तापमान पर 10 मिनट।
  5. ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक नमूने में जोड़ने के लिए 1.8 मिलीग्राम क्लोराइड (सीएच 2 सीएल 2)। कैप और मिश्रण अच्छी तरह से।
  6. प्रत्येक नमूने के लिए विआयनीकृत पानी 2.0 मिलीलीटर जोड़ें। कैप और अच्छी तरह मिक्स नमूने हैं। 0 से 3,000 × छ अपकेंद्रित्र परतों को अलग करने के लिए। के रूप में कदम 1.4.6 में उल्लिखित, पानी के प्रदूषण से बचने के तरल / तरल निष्कर्षण प्रदर्शन करने के लिए एक गैर-silanized पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें।
  7. निकासी एक बार, दो एक्सट्रेक्शन की कुल के लिए दोहराएँ। शीशियों के रूप में silanized लेबल में कार्बनिक परत (एक के रूप में रैक में सुरक्षित रूप से आयोजित) के हस्तांतरण के लिए silanized पाश्चर pipettes का प्रयोग करें। बस के नीचे किनारा करने के लिए के रूप में शीशियों भरें।
  8. नाइट्रोजन गैस के तहत 40 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सूखी नमूने के एक पूर्व गर्म, उथले अच्छी तरह से हीटिंग ब्लॉक (एएस शीशियों में) का उपयोग करें। खत्म नहीं सूखी करो। अंतिम उत्पादों को आंशिक रूप से मिथाइल एसीटेट alditol (PMAAs) के रूप में जाना जाता है।

5. गैस क्रोमैटोग्राफी - मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी एमएस)

  1. एसीटोन के 100 μl में प्रत्येक नमूना Reconstitute और अच्छी तरह मिलाएँ। जीसी विभाजन मोड लाइनर (280 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा और silanized कांच ऊन का एक छोटा सा प्लग युक्त) में विभाजित मोड में प्रत्येक नमूने की 1 μl इंजेक्षन करने के लिए एक autosampler का प्रयोग करें। एक 0.25 मिमी आईडी और 0.25 माइक्रोन मोटाई फिल्म के साथ एक 30 मीटर DB-5ms जीसी कॉलम के माध्यम से 0.8 मिलीग्राम / मिनट पर निरंतर प्रवाह मोड में वाहक गैस के रूप में 40 के उपयोग हीलियम का एक विभाजन अनुपात का प्रयोग करें।
  2. 0.5 मिनट के लिए 165 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक जीसी ओवन तापमान पकड़ो। 10 डिग्री सेल्सियस / मिनट (जो 10 मिनट लगते हैं) की दर से 265 डिग्री सेल्सियस के तापमान रैंप के लिए, प्रत्येक रन के लिए, 165 डिग्री सेल्सियस से प्रारंभिक पकड़ समय ओवन के बाद, कार्यक्रम और फिर तुरंत तापमान 265 डिग्री सेल्सियस रैंप 30 डिग्री सेल्सियस / मिनट (जो 2 मिनट लगते हैं) की दर से 325 डिग्री सेल्सियस और करने के लिए 3 मिनट के लिए 325 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखें। नमूना प्रति कुल चलाते समय 15.5 मिनट है।
  3. एक समर्थक का प्रयोग करेंPerly देखते और मास स्पेक्ट्रोमीटर calibrated आयनीकरण इलेक्ट्रॉन (ईआई, 250 डिग्री सेल्सियस पर 70 eV) जीसी स्तंभ से eluting नमूना घटकों के अधीन। एक TOF जन विश्लेषक के लिए, एक 0.1 सेकंड पल्स दर के साथ योग मी / z से 800 मी / z 40 से टुकड़े का विश्लेषण। 2.5 मिनट की एक ईआई-रेशा विलायक देरी समय निर्धारित करें।

6. डेटा विश्लेषण

  1. एक TOF मास विश्लेषक का उपयोग करते हैं, तो एक निकाले आयन chromatogram प्राप्त करने के लिए 0.15 दा के एक बड़े पैमाने खिड़की को लागू करने से सबसे प्रचुर मात्रा में और / या नैदानिक ​​प्रत्येक PMAA के लिए टुकड़ा आयनों का योग। प्रत्येक PMAA के लिए लक्ष्य आयनों कहीं और प्रकाशित किया गया है, लेकिन 33 निम्न परिवर्तन कर दिया गया है: टी GLC आयनों अब 145.1 + 205.1 कर रहे हैं; 2-आदमी आयनों 161.1 + 189.1 कर रहे हैं; 3-लड़की आयनों 161.1 + 233.1 रहे, 6-लड़की आयनों 161.1 + 189.1 + 233.1 कर रहे हैं; 2,6-मैन आयन 189.1 है; 3,6 मैन आयनों 189.1 + 233.1 कर रहे हैं।
  2. QuanLynx या अन्य सॉफ्टवेयर का उपयोग स्वचालित रूप से शिखर क्षेत्रों प्रत्येक के लिए आयन chromatogram निकाले अभिव्यक्त एकीकृत करने के लिए।

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Representative Results

कुल आयन वर्तमान chromatogram (घरेलू) के सापेक्ष जिन मामलों में दो महत्वपूर्ण permethylation कदम को गलत तरीके से मार डाला गया के लिए सफल permethylation, हाइड्रोलिसिस, कमी है, और मानव रक्त प्लाज्मा के नमूनों की एसिटिलीकरण दिखा 3 चित्र में दिखाया जाता है।

Hexoses को HexNAcs रिश्तेदार के निरपेक्ष यील्ड:

एन -acetylhexosamine (HexNAc) आंशिक रूप से मिथाइल एसीटेट alditol (PMAAs) hexoses को HexNAcs रिश्तेदार के पूर्ण उपज अनुमान लगाने के लिए hexoses की तुलना में कम उपज हो जाते हैं। 43, एन -acetyllactosamine (एक Gal1-4GlcNAc disaccharide) में से छह 10 माइक्रोग्राम नमूने पानी के 10 μl विश्लेषण किया गया। टर्मिनल गैलेक्टोज (टी-लड़की) और 4-GlcNAc के लिए घरेलू के शिखर क्षेत्रों एकीकृत किया गया। 4-GlcNAc का प्रतिशत टी-लड़की और 4-GlcNAc की कुल राशि के सापेक्ष 11.3 ± 0.7% थी(SEM)। हालांकि HexNAc पैदावार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं (देखें नीचे), तथ्य यह है कि इस मूल्य 0.5 के सैद्धांतिक मूल्य से काफी कम है इंगित करता है कि HexNAcs की उपज hexoses की तुलना में मौलिक कम है। (HexNAc सैद्धांतिक उपज 0.5 है क्योंकि एन -acetyllactosamine एक 1: 1। Hexose-HexNAc disaccharide)

अंतर और interassay Reproducibility:

अंतर और योगदान की कुल hexose या HexNAc संकेत के कम से कम 1% सभी glycan नोड्स के लिए interassay reproducibility तालिका 1 में प्रदान की जाती हैं। इन आंकड़ों, 3 अलग दिनों पर 3 अलग विश्लेषकों द्वारा हासिल किया गया EDTA प्लाज्मा के ही शेयर का उपयोग कर। मानव प्लाज्मा (यानी, कुल hexose या HexNAc संकेत के> 1% के साथ उन) चित्रा 4 में प्रदान की जाती हैं में 18 सबसे प्रचुर मात्रा में glycan नोड्स के लिए इस अनुकूलित प्रोटोकॉल के तहत autosampler स्थिरता डेटा।

अन्य उल्लेखनीय टिप्पणियों:

permethylation कार्यप्रणाली के अनुकूलन जबकि, हमने पाया है कि यह आवश्यक NaOH मोती acetonitrile से धोने प्रारंभिक करने के लिए पहले से पानी की सोखना को रोकने के लिए नहीं है। हम यह भी पाया है कि एक संक्षिप्त टीएफए के बिना एसिटिक एनहाइड्राइड साथ हीटिंग की अवधि के साथ संयोजन में अंतिम एसिटिलीकरण चरण के दौरान पानी की एक छोटी मात्रा की उपस्थिति पूर्ण प्रतिक्रिया की सुविधा के लिए मदद करता है। अंत में, समय की उड़ान (TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री के उच्च शक्ति को हल सफल glycan नोड के विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं है: एक जीसी TOF एमएस और एक पारंपरिक संचरण quadrupole पर नमूने के एक ही सेट के समानांतर इंजेक्शन के आधार पर प्रारंभिक परिणाम आधारित जीसी एमएस में चयनित आयन निगरानी में संचालित (सिम) मोड अंतिम सामान्यीकृत hexose की शर्तें और HexNAc रिश्तेदार प्रचुरता में इसी तरह के परिणाम प्रदर्शित करता है।

er.within-पेज = "1"> आकृति 1
। चित्रा 1. आण्विक वैश्विक glycan मेथिलिकरण विश्लेषण प्रक्रिया का अवलोकन एक हे से जुड़े glycan सचित्र है; इन permethylation प्रक्रिया, permethylation और हाइड्रोलिसिस जिसके बाद Goetz। 40 से अनुकूलित किया गया है के दौरान जारी कर रहे हैं, monosaccharides कम कर रहे हैं और नवजात हाइड्रॉक्सिल समूहों एसिटिलीकरण द्वारा "चिह्नित"। मेथिलिकरण और (PMAAs) अंतिम आंशिक रूप से मिथाइल एसीटेट alditol में एसिटिलीकरण की अद्वितीय पैटर्न अद्वितीय "glycan नोड" मूल बरकरार बहुलक में से मेल खाती है और जीसी एमएस। एन से जुदाई और मात्रा का ठहराव के लिए आणविक आधार से जुड़े और glycolipid ग्लाइकान प्रदान करता है एसिड हाइड्रोलिसिस दौरान लिंकेज से चिह्नित monosaccharides के रूप में जारी किया जाता है। बोर्जेस एट अल से अनुकूलित। अनुमति के साथ 33।> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. विश्लेषणात्मक अवधारणा के वैचारिक सिंहावलोकन। एक upregulated glycosyltransferase (जैसे, GNT-V) एक विशिष्ट, विशिष्ट रूप से जुड़ा हुआ glycan मोनोसैकराइड अवशेषों की मात्रा में वृद्धि (एक 2,6-लिंक्ड Mannose इस उदाहरण में "नोड") का कारण बनता है जो, अन्य glycosyltransferases के बाद कार्रवाई के माध्यम से, प्रत्येक जिनमें से सभी का पता लगाने और दिनचर्या फैशन में अंदाजा लगाना मुश्किल हो सकता है कम प्रतिलिपि संख्या में विषम पूरे glycan संरचनाओं का एक मिश्रण के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। विश्लेषणात्मक एक साथ से "glycan नोड्स" सभी न्यायपालिका glycan संरचनाओं के बीच पूलिंग किसी एक को बरकरार glycan से GNT-वी गतिविधि का एक और अधिक प्रत्यक्ष किराए की माप प्रदान करता है। हे - - एन के साथ माप, और लिपिड जुड़ा "glyc एक नोड्स "पूरे biospecimens के रूप में यहाँ वर्णित (और मूल रूप से कहीं और 33) है जिसके द्वारा पता लगाने और इस तरह के कैंसर के रूप में glycan-भावात्मक रोगों की निगरानी के लिए एक धारणात्मक उपन्यास साधन का प्रतिनिधित्व करता है। 10-microliter रक्त प्लाज्मा के नमूनों से वास्तविक निकाले आयन chromatograms दिखाया गया है। से सटे नंबर glycan संरचनाओं में मोनोसैकराइड अवशेषों स्थिति है, जिस पर उच्च अवशेषों कम अवशेषों से जुड़ा हुआ है संकेत मिलता है। कोई संबंध पदों वर्णलेख एनोटेशन में संकेत कर रहे हैं, तो छाछ या तो टर्मिनल की स्थिति में या समाधान (जैसे, ग्लूकोज) में नि: शुल्क। सभी अवशेषों है ।; छोड़कर अपने 1-स्थिति के माध्यम से नीचे सियालिक एसिड लिंक नीचे अपने 2-स्थिति के माध्यम से सियालिक एसिड लिंक वर्णलेख में विभाजित निकाले आयन chromatograms में परिवर्तन को इंगित करता है: hexose अवशेष और मी / z 116 + 158 N के लिए के लिए मी / z 117 129 - acetylhexosamine (HexNAc) के अवशेष। बोर्जेस एट अल। से अनुमति के साथ 33 अनुकूलित।61 / 53961fig2highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि परिणाम है। एक ही मानव रक्त प्लाज्मा EDTA नमूने के glycan नोड विश्लेषण जो ए) में नमूना सही ढंग से संसाधित किया गया था के लिए कुल आयन वर्तमान chromatograms (tics), बी) permethylation समाधान में सफेद अवशेषों कि NaOH के माध्यम से काता था स्तंभ तरल / तरल निष्कर्षण के लिए बाद मिश्रण में किया गया था, और सी) permethylation समाधान है कि NaOH कॉलम के माध्यम से काता था फॉस्फेट बफर करने के लिए जोड़ा गया था, लेकिन अच्छी तरह से तरल / तरल निकासी के लिए क्लोरोफॉर्म के अलावा पहले नहीं मिलाया। चित्रा 2 में प्रदान की कथा। ज क्लिक करेंअरे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्रा 4
मानव प्लाज्मा में 18 सबसे प्रचुर मात्रा में glycan नोड्स के लिए 48 घंटे से अधिक चित्रा 4. autosampler स्थिरता। Autosampler स्थिरता। 22 घंटे में नमूना पूरी तरह से सूखे और 120 μl एसीटोन में पुनर्गठन किया गया था। डेटा बिंदुओं में से प्रत्येक क्लस्टर ही नमूने के लगातार चार इंजेक्शन का प्रतिनिधित्व करता है। काले लाइनों धरना प्रत्येक glycan नोड के लिए औसत सामान्यीकृत मूल्य के ± 15%। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका एक
तालिका 1. अंतर और interassay reproducibility। मान कुल hexose या कुल HexN का% सीवी का प्रतिनिधित्वएसी सामान्यीकृत व्यक्ति glycan नोड्स। कुल hexose या HexNAc संकेत के कम से कम 1% का योगदान सभी glycan नोड्स सूचीबद्ध हैं। डेटा 3 अलग दिनों पर 3 अलग विश्लेषकों द्वारा हासिल किया गया, EDTA प्लाज्मा के ही शेयर का उपयोग कर। प्रति बैच एन = 6 नमूने हैं। एक एक्सेल स्प्रेडशीट के रूप में इस तालिका डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सामान्य तौर पर, hexoses से आंशिक रूप से मिथाइल एसीटेट alditol के सफल उत्पादन (PMAAs) कम कठिनाइयों से भरा है और एन -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs के सफल उत्पादन की तुलना में अधिक मजबूत है। इस घटना के रूप में यह इस प्रक्रिया के हर कदम में बाहर निभाता पीछे सटीक व्यवस्था अज्ञात है, लेकिन एन -acetyl समूह (बल्कि हाइड्रॉक्सिल समूह की तुलना में) की अनूठी रसायन है कि hexoses को HexNAcs रिश्तेदार के लिए अद्वितीय है से संबंधित होना चाहिए। इस घटना के रूप में यह एसिड हाइड्रोलिसिस से संबंधित है के पीछे तंत्र कहीं और। 43 से समझाया गया है संक्षेप में, क्षमता एन -methylacetamido सकारात्मक एसिड हाइड्रोलिसिस के दौरान आरोप लगाया बनने के लिए glycosidic लिंकेज एसिड हाइड्रोलिसिस के लिए प्रतिरोधी बनाता है। इस hexose को HexNAc रिश्तेदार की कम उपज (कुल HexNAc + hexose संकेत के 11.3%, कुल की बजाय 50%) एन -acetyllactosamine के विश्लेषण के लिए ऊपर वर्णित के रूप में बताते हैं। विशेष रूप से, यह अपेक्षाकृत एलHexNAcs की ower उपज उन्हें जटिल biofluids और ऊतकों में पता लगाने, या बड़े, जटिल ग्लाइकान (जैसे, 2,4-यार, 2,6-यार, 3,4,6 से निकाली गई glycan नोड्स के सतही का पता लगाने में बाधा के लिए मुश्किल नहीं पड़ता मैन, और 3,4-GlcNAc, चित्रा 2)। 33 जिस तरीके से glycan नोड्स के XIC शिखर क्षेत्रों सामान्यीकृत कर रहे हैं को देखते हुए (चरण 6.3), जब तक प्रत्येक व्यक्ति के रिश्तेदार HexNAc उपज रहता अन्य HexNAcs करने के लिए लगातार रिश्तेदार (के रूप में जो यह करता है, विभिन्न नमूनों के बीच अलग HexNAcs के रिश्तेदार मात्रा पर तालिका 1), उपयोगी जानकारी देखने प्राप्त किया जा सकता है। यह रूप में अच्छी तरह hexoses लिए सच है। एक घटना है जो लगातार हर बैच में क्यूसी नमूना (एस) के समावेश के माध्यम से निगरानी रखी जाती है - इसके अलावा, हम पहले कि HexNAcs को hexoses के अनुपात के अनुरूप मात्रात्मक व्यवहार के रूप में अच्छी तरह से 33 प्रदर्शित दिखाया है।

जिस तरीके से permethylation किया जाता है पर सबसे बड़ा प्रभाव हैकुल उपज और HexNAc PMAAs के reproducibility। विशेष रूप से, बहुत ख्याल पूरी तरह से permethylated ग्लाइकान के जोखिम से बचने के लिए जलीय शर्तों क्षारीय लिया जाना चाहिए। इस संबंध में दो महत्वपूर्ण कदम हैं 1) (कदम 1.3.13 और 1.3.14) के पीछे स्पिन के माध्यम से समाधान में सभी सफेद वेग छोड़ रहा है, और 2) तुरंत स्पिन के माध्यम से समाधान मिश्रण एक बार वे फॉस्फेट बफर करने के लिए जोड़ा जाता है ( 1.3.13 और 1.3.14 कदम)। साधारण नमक के घोल के बजाय एक बफर इस स्तर पर और जलीय समाधान के अनजाने alkalinization को रोकने के लिए बाद में तरल / तरल निष्कर्षण कदम के लिए शामिल किया गया है। हमें शक है कि क्षारीय परिस्थितियों HexNAcs की methylated और Acetylated 2 अमीनो समूह के एसिटाइल समूह हाइड्रोलिसिस गुजरना सकता है, एक और अधिक ध्रुवीय माध्यमिक अमाइन कि क्लोरोफॉर्म में जुड़े glycan के समग्र निकासी क्षमता कम हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप।

असफल permethylated HexNAcs के सबसे आसानी से पहचानने की सुविधा है4 से जुड़े GlcNAc (4-GlcNAc) 6-लड़की, 3,6-मैन के उन लोगों के लिए chromatographic चोटी रिश्तेदार की तीव्रता, और अंतिम स्तंभ सेंकना-आउट (चित्रा 3) के दौरान पृष्ठभूमि के आधारभूत तीव्रता। जब 4-GlcNAc PMAA का पूर्ण बहुतायत कम है, अन्य सभी HexNAcs करने के लिए अपने सामान्यीकृत बहुतायत रिश्तेदार भी एक सहवर्ती वृद्धि 3,4 GlcNAc के (सबसे ज़ाहिर) के साथ, कम हो जाता है।

, सादगी के लिए: कुल उपज और परख मजबूती अनुकूलन करने के लिए बनाया गया एक कुछ परिवर्तन के बाद से हमारे प्रारंभिक प्रकाशन के इस विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है इन परिवर्तनों के 33 एक रास्ता है जो एकीकृत निकाले आयन chromatograms (XICs) सामान्यीकृत कर रहे है। अब हम सब hexose XIC क्षेत्रों की राशि से प्रत्येक व्यक्ति hexose XIC के क्षेत्र विभाजित; इसी तरह, प्रत्येक व्यक्ति HexNAc XIC के क्षेत्र में सभी HexNAc XIC क्षेत्रों की राशि से विभाजित है। तालिका 1, समग्र interassay / अंतर-विश्लेषक reproducibil के रूप में देखासभी glycan नोड्स योगदान उनके संबंधित hexose या HexNAc संकेत का औसत 13% सीवी के> लिए 1% के लिए अल्पसंख्यक।

हमारे ज्ञान करने के लिए, यह वास्तव में नीचे से ऊपर Glycomics जिसमें ग्लाइकान पहले टूट रहे हैं और उसके बाद उनके घटकों glycan रचना का एक मात्रात्मक नमूना चौड़ा चित्र का निर्माण करने के लिए विश्लेषण के ही अवतार है। इधर, पारंपरिक एंजाइमी रिहाई के बजाय, permethylation प्रक्रिया गैर reductively समाप्त (विज्ञप्ति) हे उनके संबंधित प्रोटीन, 40, जबकि एन से जुड़े ग्लाइकान परंपरागत ऊपर से नीचे Glycomics के लिए एक पूरक दृष्टिकोण के रूप में एसिड हाइड्रोलिसिस के दौरान जारी किए हैं। 33 से से जुड़े ग्लाइकान , इस दृष्टिकोण इस तरह के "मूल fucosylation", "6-sialylation", "GlcNAc bisecting", और "बीटा 1-6 शाखाओं में बंटी" एकल विश्लेषणात्मक संकेतों (देखें, 4,6-GlcNAc में के रूप में ब्याज की अनूठी glycan सुविधाओं पूल करने के लिए सक्षम है चित्रा 2 में 6-लड़की, 3,4,6 मैन और 2,6 मैन नोड्स, respectively)। परंपरागत ऊपर से नीचे दृष्टिकोण में, इस तरह के रूप में इन सुविधाओं है कि अंतत: एक या दो प्रमुख glycosyltransferases 33 की अनूठी गतिविधियों पर निर्भर आम तौर पर बरकरार ग्लाइकान के दर्जनों भर में वितरित कर रहे हैं और कभी-कभी हल करने के लिए (जैसे, 3-sialylation बनाम मुश्किल या असंभव हो सकता है 6-sialylation) कुछ बरकरार glycan जनता के पतन की वजह से। इसके अलावा, यहाँ प्रस्तुत नीचे अप दृष्टिकोण गैर invasively फेफड़ों के कैंसर का पता लगाने में प्रारंभिक वादा प्रदर्शन किया है। 33 आगे के अध्ययन से इन प्रारंभिक निष्कर्षों, साथ ही, अतिरिक्त अभी तक अप्रकाशित परिणाम कैंसर के अन्य रूपों का पता लगाने से संबंधित मान्य करने के लिए चल रहे हैं।

यहाँ वर्णित दृष्टिकोण की सबसे बड़ी सीमा है कि यह पता लगाने की अपनी सीमा के संदर्भ में विवश है अगर यह लागू किया जा करने के लिए पूर्व पृथक ग्लाइकोप्रोटीन थे। वाहक प्रोटीन के बिना व्यक्ति glycan मानकों के अप्रकाशित विश्लेषण, मात्रा का ठहराव की सीमा के आधार पर foआर व्यक्ति ग्लाइकान कम माइक्रोग्राम रेंज में झूठ बोलने के लिए दिखाई देते हैं। ये कोई पूर्ण रूप में कम LOQs तरह से कर रहे है, लेकिन इस तथ्य परख-जिसके लिए बनाया गया है और कम से कम के लिए यहाँ प्रयोजनों वर्णित कम LOQs प्राप्त करने के लिए (कोई जरूरत नहीं है नहीं किया गया था और के मूल उद्देश्य गुंजाइश के संबंध में कोई फर्क नहीं पड़ता हमारे पिछले प्रकाशन 33) में। वास्तव में, मानव प्लाज्मा / सीरम की 10s में ग्लाइकोप्रोटीन शामिल मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता रेंज-जिसका अर्थ है कि रक्त प्लाज्मा / सीरम के विश्लेषण के लिए हम केवल इंजेक्षन अंतिम नमूना मात्रा की ~ 1/100 वें और 40 के 41 भागों से बाहर विभाजित कि छोटी मात्रा जीसी इंजेक्टर बंदरगाह में बर्बाद करने के लिए। इस अभ्यास के बिना, glycan नोड्स के कुछ डिटेक्टर तर कर सकते हैं। ग्लाइकोप्रोटीन कि पारंपरिक ऊपर से नीचे MALDI एमएस या नियंत्रण रेखा एमएस आधारित दृष्टिकोण से पर्याप्त बरकरार glycan संकेतों का उत्पादन कर सकते हैं की Picomole मात्रा में इस दृष्टिकोण के साथ नहीं पाया जा सकता। कार्यप्रणाली के आगे शोधन इस सीमा के उपाय करने जा रही है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium hydroxide beads  367176 Sigma-Aldrich  20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 ml Spin column 69705 Pierce division of ThermoFisher Scientific  Includes  plugs and polyethylene frits 
GC-MS autosampler vial (silanized)* C4000-9 ThermoFisher Scientific Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 ml polypropylene test tubes 05-402-25 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
2 ml polypropylene test tubes 05-408-138 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) D8418 Sigma-Aldrich  BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane  I8507 Sigma-Aldrich  Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile A955-4 ThermoFisher Scientific  Optima LC/MS
Microcentrifuge 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge ThermoFisher Scientific  24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)* 53283-800 VWR 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes 14-930-15D ThermoFisher Scientific  Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride  S7653 Sigma-Aldrich  >99.5% pure
Chloroform 4440-08 Macron Fine Chemicals 
Trifluoroacetic acid  299537 Sigma-Aldrich  99% purified by redistillation for protein sequencing 
Sodium borohydride 71321 Fluka Analytical  99%
Ammonium hydroxide solution  320145 Sigma-Aldrich  NH3 content: 28.0-30.0%
Methanol AH230-4 Honeywell Burdick & Jackson HPLC grade
Acetic acid  320099 Sigma-Aldrich  99.70%
Plastic vacuum desiccator  Any model of adequate size FoodSaver
Acetic anhydride  539996 Sigma-Aldrich  99.50%
Dichloromethane  D143SK-4 ThermoFisher Scientific  Stabilized HPLC grade
Acetone  9006-03 J.T.Baker Baker Analyzed 
Heated evaporation manifold (main unit) pi18823 ThermoFisher Scientific  Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator) pi18826 ThermoFisher Scientific  ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold pi18816 ThermoFisher Scientific  Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep)
Gas chromatograph Model A7890 Agilent  Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer  GCT Premier (Time-of-Flight) Waters 
Split-mode liner (deactivated / silanized) 5183-4647 Agilent Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column 122-5532 Agilent 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane 95541 Sigma-Aldrich 
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) EW-06536-30 Cole-Parmer 12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.

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References

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रसायन विज्ञान अंक 111 glycobiology ग्लाइकान glycosyltransferase कैंसर permethylation मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) ग्लाइकोप्रोटीन,
Glycan नोड विश्लेषण: Glycomics के लिए एक नीचे अप दृष्टिकोण
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Zaare, S., Aguilar, J. S., Hu, Y., Ferdosi, S., Borges, C. R. Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics. J. Vis. Exp. (111), e53961, doi:10.3791/53961 (2016).

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