Introduction
Glycolipides, des glycoprotéines, des protéoglycanes et glycosaminoglycanes constituent les quatre principales classes d'hydrates de carbone, hétérogènes complexes collectivement appelés glycanes. En tant que composants omniprésents et intégrales de la membrane plasmique, glycocalyx, et de la matrice et des fluides extracellulaires, les glycanes participent à de tels procédés biochimiques divers que l'endocytose, le trafic intracellulaire, la motilité cellulaire, la transduction du signal, la reconnaissance moléculaire, l'activation du récepteur, l'adhésion cellulaire, l'interaction hôte-pathogène , la communication intercellulaire, immunosurveillance et immunitaire initiation de réponse. 1 Présent dans presque tous les domaines de la vie, enzymes appelées glycosyltransférases qui construisent des polymères glycanes agissent en tandem avec glycoside hydrolases (également connu sous le nom glycosidases, qui décomposent les glycanes) pour construire, rénover, et , finalement , produire finalisé polymères glycanes 2. Bien que chaque glycosyltransférase peut fonctionner sur différents glycoconjugués, une glycosyltransféraseforges généralement une liaison glycosidique linkage- et anomère spécifique en transférant le fragment monosaccharide d'un nucléotide activé donneur de sucre particulier (par exemple, GDP-fucose) à une certaine catégorie d'accepteurs nucléophiles (par exemple, un lipide, un polypeptide, un acide nucléique, ou de plus en plus oligosaccharide). Il a été estimé que plus de 50% de protéines ( en particulier membranaires et des protéines sécrétoires) sont post-traductionnelle modifié par glycosylation 3 calculs combinatoires rudimentaires fournissent une appréciation de la variabilité considérable, la polyvalence et la spécificité accordée aux glycoprotéines par glycosylation. Par exemple, si un substrat de polypeptide ne possède que 10 sites de glycosylation et chaque site peut former une liaison glycosidique avec une des extrémités réductrices seulement trois monosaccharides différents, alors, en principe, la glycoprotéine finale peut prendre 10 = 3 59049 identités distinctes. Dans les glycoprotéines, les liaisons glycosidiques forment communément avec la chaîne latérale d'azote of résidus d'asparagine dans la séquence Asn-X-Ser / Thr (X peut être un acide aminé quelconque excepté la proline) pour obtenir le N -glycans 2 et des chaînes latérales hydroxyles des résidus de serine et de threonine pour donner -glycans O 4. La composition du glycome d'une cellule ( par exemple, son complément de produits de glycosylation) est unique et limitée parce que, à quelques exceptions près, les glycosyltransférases présentent des donateurs stricte, accepteur, et la spécificité de liaison. 5 glycoprotéines de plasma sanguin importants et abondants souffrent glycosylation aberrante comme conséquence aval de l' expression de la glycosyltransférase et l' activité anormale due à de nombreux états pathologiques, en particulier le cancer et les maladies inflammatoires. 6-24
Principalement en raison de facteurs épigénétiques, l'glycome est nettement plus diversifiée, dynamique et complexe que le protéome et du transcriptome. 25,26 Alors qu'environ 1% du génome de mammifère code pour la formation, la modification, etEnsemble de glycanes, 27 glycosylation se déroule de manière-un contraste marqué non orientés modèles de polypeptide et de la biosynthèse des acides nucléiques. L'interaction entre la quantité relative et l' activité des enzymes de glycosylation et des facteurs environnementaux tels que la disponibilité des nutriments et d'un précurseur détermine finalement la nature, le taux et l' étendue de la glycosylation. 5,28 embryogenèse (par exemple, la détermination et de la différenciation), l' activation cellulaire et la progression à travers l'expression de l' influence du gène de cycle cellulaire ( par exemple, la transcription et la traduction) et modifier l'identité et la quantité des glycosyltransférases disponibles, dont l' activité est le facteur déterminant en amont immédiat du profil glycane de la cellule. Parce que (certains) le proliférative, adhésif, et les propriétés invasives des cellules cancéreuses ressemblent à celles des cellules embryogènes ordinaires, des changements spécifiques dans les voies de biosynthèse glycane (par exemple, l' accumulation de précurseur, l' expression dérégulée, aberrant modification, troncature structurelle ou formation roman) servent de biomarqueurs du cancer comme universels qui indiquent différentes étapes de la formation de tumeurs, la progression, la migration et l' invasion 29 Bien que la glycosylation est très complexe, évidemment que quelques modifications de glycosylation peuvent permettre à la carcinogenèse et les métastases. apparemment, certains produits de glycosylation "aberrantes" en effet bénéficier des cellules cancéreuses en leur permettant de se soustraire à la reconnaissance immunitaire et de survivre aux exigences de la migration dans des environnements intravasculaires et métastatiques inhospitalières. 28,30,31 Sans surprise, les expériences ont montré que la perturbation ou la prévention des motifs de changé l' expression génique et la formation glycane aberrante peuvent stopper la tumorigenèse. 29 Néanmoins, les glycanes aberrantes détectées dans un échantillon de fluide biologique (par exemple, l' urine, la salive et le plasma ou le sérum sanguin) peuvent ne pas être des indicateurs directs de cancer (ou une autre maladie), mais plutôt en aval résultats de subtile mais significativedes changements dans le système immunitaire ou des ramifications quantifiables d'une condition pernicieuse dans un organe imprévisible. 32
Bien qu'ils fournissent des informations universelles sur le glycome, de nombreux glycomique à base d'interaction-techniques moléculaires (par exemple, lectine / matrices d' anticorps et métabolique / marquage covalent) dépend de la détection de structures glycanniques entières et ne fournissent pas des informations structurelles détaillées sur glycanes individuelles. En contraste marqué, la spectrométrie de masse (MS) peut aider à identifier et quantifier les structures glycanniques individuelles et révéler de telles informations structurelles que les sites de fixation à noyaux polypeptidiques. l'expression ou l'activité d'une seule glycosyltransférase dérégulée peut initier une cascade d'événements moléculaires nuisibles dans de multiples voies de glycosylation. Parce que chaque glycosyltransférase peut fonctionner sur plus d'un substrat de glycoconjugué et à travers différents polymères glycanes croissance, cascades biosynthétiques déréglementés donnent dispropornellement des quantités accrues d'un seul produit glycane mais plusieurs classes hétérogènes de glycanes aberrantes dans les fluides intra- ou extracellulaires. 33 Cependant, ces glycanes aberrants uniques sont parfois considérés comme peu pratique en tant que biomarqueurs pour le cancer ou d' autres pathologies glycanes-affectif parce que, par rapport à la grande piscine des glycanes bien réglementé, ces glycanes aberrantes représentent une très petite fraction qui peut souvent rester indétectable même par des techniques très sensibles comme la spectrométrie de masse. Par exemple, dans des fluides corporels intra- et extracellulaire, le large spectre de protéines de concentration (qui couvre huit ordres de grandeur) peut empêcher la détection de glycoprotéines rares qui sont masquées par les espèces les plus abondantes. 32 En outre, la détermination de l' activité de glycosyltransférase reste un important pratique et défi théorique parce que beaucoup de glycosyltransférases sont absents dans biofluides cliniques ou devenir inactif ex vivo. Malgré la difficulté de consistendétecter tly et la quantification des quantités ultra-minute de glycanes entiers uniques, les praticiens de la spectrométrie de masse ont fait d'énormes progrès vers l'emploi glycanes intactes comme marqueurs cliniques. Nous avons récemment développé une approche complémentaire à l'analyse des glycanes intactes, utilisant GC-MS, facilite la détection de toutes les branches point constituant et monosaccharides spécifiques liaison ( "noeuds glycanes") qui confèrent ainsi un caractère unique à chaque glycane et dans de nombreux cas servent directement substituts moléculaires qui permettent de quantifier l'activité relative de la glycosyltransférase (s) coupable.
Depuis sa première rapporté application directe à l' analyse glycanes en 1958, chromatographie en phase gazeuse (GC) a prouvé une technique puissante pour analyser les mono- et disaccharides per-méthylé, 34 déterminer leur anomericity et la configuration absolue, et de les séparer pour analyse ultérieure par spectrométrie de masse. 35 Entre 1984 et 2007, Ciucanu et ses collèguesintroduit et affiné une technique de perméthylation glycane phase solide qui employait l' hydroxyde de sodium et de l' iodométhane, suivie d' une extraction liquide / liquide de glycanes perméthylés utilisant de l' eau et le chloroforme. 35,36 Entre 2005 et 2008, Kang et ses collègues ont intégré une rotation de gain de temps approche -column dans l'étape de perméthylation. 37,38 En 2008, le groupe de recherche Goetz a conçu une phase solide quantitative perméthylation méthode glycane-profilage par laser désorption-ionisation assistée par matrice (MALDI) spectrométrie de masse pour comparer et potentiellement distinguer invasive et non les cellules cancéreuses du sein -invasive; 39 puis, en 2009, l'équipe Goetz combinée enzymatique et les techniques de libération chimiques clivent O -glycans de glycoprotéines intactes dans un schéma de perméthylation en phase solide fortement alcalin 40 Bien que la procédure Goetz facilitée perméthylation simultanée et la libération de produits chimiques. de -glycans O, il a été appliqué uniquement aux pré-isolé glycoles protéines. Nous avons modifié cette technique en 2013 et adapté pour biofluides non fractionnées entiers et des échantillons de tissus homogénéisés en incorporant l' acide trifluoroacétique (TFA) hydrolyse, réduction et acétylation étapes. 33 Ces étapes supplémentaires libérer également les glycanes de glycolipides et N lié en glycanes de glycoprotéines et convertir les en acétates partiellement méthylés d'alditols (PMAAs, figure 1), dont les modèles de méthylation et acétylation distinctive de faciliter l' analyse par GC-MS et uniquement caractériser les nœuds glycanes constitutifs dans l'original intact polymère glycane 41 (Figure 2). 33 en fin de compte, ce procédure produit un portrait composite de tous les glycanes dans un fluide biologique complexe basé sur la quantification par rapport direct des caractéristiques uniques, telles que des glycanes "fucosylation du noyau", "6-sialylation", "GlcNAc bissecteur", et "bêta 1-6 ramification» - chaque dérivé d'un seul chromatograp GC-MSpic HIC. Cet article présente l'optimisation du perméthylation, acétylation, l'isolement et les étapes de nettoyage ainsi que des améliorations dans le mode de quantification relative.
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Protocol
Attention: Éviter le contact / des yeux de la peau avec l' un des réactifs utilisés dans cette expérience. Lors de l'exposition, rincer soigneusement la zone touchée avec de l'eau et consulter immédiatement un médecin.
1. perméthylation et Glycan Extraction
- Préparation de la colonne
- Obtenir autant d'unités de colonne microcentrifugeuse de rotation que les échantillons à analyser. Pause et détacher les bouchons de tube de réservoir en plastique. Placer un filtre microfuge mini dans chaque tube réservoir. Placez les colonnes de spin microcentrifugation assemblées (contenant les mini-filtres) dans un rack tube de microcentrifugation.
- Obtenir un stock d'hydroxyde de sodium (NaOH) perles (20-40 mesh). Transférer une partie de NaOH à un petit bateau de pesée ou, si l'humidité est à l'origine agglutination, un mortier de porcelaine chaud que le stock de travail de NaOH. Évitez d'utiliser des bouquets de perles de NaOH ou écrasés / NaOH en poudre.
Attention: NaOH est une toxine puissante et une base corrosive. Rincer la peau exposée / yeux à l'eau pendant 15 min. Thorougnettoyer hly l'établi après avoir terminé l'expérience. - En utilisant une petite cuillère ou une spatule, transférer perles NaOH du stock de travail pour remplir les microcentrifugation mini-filtres avec NaOH jusqu'à la première biseau externe (~ 5 mm au-dessous du bord). Appuyez sur les filtres à centrifuger remplis sur la paillasse pour emballer / condenser les perles de NaOH.
Remarque: Au cours de cette expérience, afin de minimiser l' adsorption d'eau excessive par des billes de NaOH hygroscopiques, de maintenir le niveau de tous les fluides ajoutés (par exemple, l' acétonitrile, le diméthylsulfoxyde, la solution d'analyte) au- dessus de la surface du garnissage de colonne de NaOH et de limiter le contact direct avec l' air. - Obtenir un stock d'acétonitrile (ACN). Transfert ~ 350 pi ACN à chaque mini-filtre microfuge NaOH-emballés. Gardez le NaOH immergé sous ACN et éliminer les grosses bulles d'air en agitant avec un gel de chargement pointe de la pipette tip-frisée.
Attention: Acétonitrile est un irritant inflammable. - Colonne centrifugation
- Disposez les colonnes de microcentrifugation symétriquement à l'intérieur d'une centrifugeuse; utiliser un tube d'équilibrage si nécessaire. Évitez de renverser des granules de NaOH dans la centrifugeuse. Fermez le couvercle de la centrifugeuse.
- Centrifugeuse les colonnes (contenant NaOH et ACN) pour ~ 15 s à 2400 × g.
- À la fin de la centrifugation, supprimer des colonnes microcentrifugation de la centrifugeuse, et jeter le ACN dans un conteneur de déchets dangereux. Gardez la colonne NaOH emballage intact.
- Ajouter ~ 350 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO) à chaque mini-filtre microfuge NaOH-emballés. Gardez le NaOH immergé dans du DMSO et éliminer toutes les grosses bulles d'air avec une pointe de pipette. Comme décrit précédemment, les colonnes de centrifugation pour ~ 15 s à 2400 × g, et jeter le DMSO tout en gardant le NaOH emballage intact.
Attention: Le DMSO est un mutagène et irritant et est facilement absorbé par la peau. - Branchez tous les mini filtres à centrifuger avec les bouchons inclus dans le filtre rotatiftrousse. Transfert ~ 350 pi de DMSO à chaque microfuge mini-filtre NaOH-emballé et utiliser une pointe de pipette 200 pi pour éliminer les bulles d'air dans l'emballage NaOH de sorte que le DMSO atteint toutes les régions à l'intérieur puis l'emballage NaOH. Éviter d'écraser ou de raclage excessivement les billes de NaOH; poudre de NaOH est indésirable. Terminez cette étape aussi rapidement que possible.
- Préparation du contrôle de la qualité Plasma (QC) échantillon (s)
Remarque: Pour obtenir des résultats cohérents dans les lots expérimentaux, envisager d' utiliser au moins une partie aliquote d'un échantillon prélevé à partir d' une grande collection en vrac, homogène de la matière biologique d'intérêt à analyser dans chaque lot. Par exemple, si l'analyse du plasma sanguin, en utilisant aliquote (s) d'une collection en vrac du plasma sanguin comme l'échantillon (s) cr dans chaque lot. Procédé CQ échantillons de la même manière que les échantillons inconnus.- Centrifugeuse un stock échantillon de QC plasma pendant 4 min à ~ 10 000 × g. Lors de la centrifugation, un peu de précipité à haute densité peut régler à the fond et un peu de précipité à basse densité peut flotter à la surface du plasma. Évitez la fois lors du retrait aliquote (s) du plasma.
- Passer à la "1.3) Préparation des échantillons" ci-dessous. Ensuite, revenez à cette étape après centrifugation du plasma est terminée.
- Retrait 9 pi de centrifugé QC plasma et de le transférer à un tube à essai en polypropylène de 1,5 ml étiqueté de manière appropriée équipée d'un bouchon snap-fermeture (ci-après dénommé "tube à essai en plastique de 1,5 ml"). Ajouter 1 pi d'eau déminéralisée pour chaque aliquote; si on le désire, utiliser comme support pour la norme (s) interne.
- Ajouter 270 ul de DMSO à ce contrôle de plasma. Vortex pour garantir une dissolution complète.
- La préparation des échantillons
- Obtenir autant de tubes à essai en plastique de 1,5 ml comme le nombre d'analytes () échantillons biologiques.
- Transfert 9 pi de chaque (analyte) échantillon biologique à son tube correspondant d'essai en plastique de 1,5 ml. Transfert 1 pi d'eau déminéralisée et 270 ul de DMSO dans chaque tube à échantillon.
- Mélanger vigoureusement (par exemple, vortex et / ou à plusieurs reprises la pipette de haut en bas) des échantillons pour assurer une dissolution complète dans le DMSO.
Attention: Effectuez les étapes suivantes à l' intérieur d' une hotte. Utilisés dans les étapes suivantes, iodométhane (CH 3 I), du dichlorométhane (CH 2 Cl 2, alias chlorure de méthylène) et du chloroforme (CHCl 3, le trichlorométhane), sont des liquides volatiles capables de dissoudre certains types de plastique (par exemple, des gants en nitrile) . Assurez-vous d'utiliser des gants résistants aux solvants. En raison de leur pression de viscosité et de haute vapeur faible, ces réactifs peuvent goutter à partir d'une pointe de pipette pendant le transfert. Minimiser la perte de réactif et l'exposition potentielle en maintenant la solution mère à côté de la cuve de réception. - Transférer un volume total suffisant de iodométhane à un petit tube propre. Chaque échantillon d'analyte nécessitera 105 iodométhane ul. Transfert ~ 500 ul de dichlorométhane dans another tube propre. Pour éviter le colmatage seringue, rincer la seringue avec du dichlorométhane immédiatement après le transfert iodométhane.
Attention: iodométhane est photosensible, volatile et puissante toxine capable d'endommager le système nerveux central ou causant la mort en cas d' inhalation ou d' ingestion. Dichlorométhane est un cancérigène potentiel, mutagène reproduction et puissant irritant capable d'endommager plusieurs organes ou de causer la mort. - Utiliser une seringue analytique pour ajouter 105 pi d'iodométhane à chaque échantillon d'analyte. tubes d'analyte Cap immédiatement pour minimiser l'évaporation iodométhane. Bien vortex et, si nécessaire, centrifuger brièvement tous les échantillons pour veiller à ce qu'aucun liquide reste dans le bouchon. Tout changement de couleur (par exemple, au brun, violet ou jaune) signale la dégradation des iodométhane, ce qui peut mettre en péril la réaction de perméthylation suivante.
- Rincer la seringue analytique utilisée pour transférer iodométhane avec du dichlorométhane au moins 3 fois. Cela permettra d'éviter qu'il from colmatage. Éliminer ce rinçage, avec iodométhane supplémentaire et du dichlorométhane dans un récipient de déchets dangereux organique. Placer les tubes d'essai utilisés dans un conteneur de déchets dangereux.
- Obtenir une nouvelle série de tubes de réservoir en plastique de 2 ml. Retirer snap-caps, si désiré.
- Débranchez les filtres microfuge mini. Centrifugeuse les colonnes débranchés pendant 15 secondes à 2400 × g, puis jeter les tubes de réservoir ainsi que l'effluent de DMSO.
- Rebranchez les colonnes de spin centrifugés, et les placer à l'intérieur des nouveaux tubes de réservoir. Numéro de chaque colonne de centrifugation et son tube de réservoir correspondant ayant le même nombre d'échantillons. Assurez-vous que les mini-prises de filtre sont serrés; une fuite potentielle peut avoir un impact à l'étape suivante. Minimiser le temps entre la suppression du DMSO dans les colonnes de centrifugation et de transfert des échantillons d'analyte sur les colonnes de spin.
- perméthylation
- Quantitativement transférer chaque solution d'échantillon à son NaOH-bead rempli co microfuge de spin correspondantlonne. Utiliser un embout de pipette de 1000 pi pour cette étape. Après le transfert, à sertir ~ 2 mm de l'extrémité d'une pointe de 200 pi et le laisser dans le contenu de la colonne à utiliser comme un agitateur. Répétez l'opération pour tous les échantillons.
Note: La faible viscosité de iodométhane peut entraîner une perte échantillon parce que la solution d'analyte peut goutter à partir de la pointe de la pipette pendant le transfert. Maintenir le tube d'échantillon et la colonne de centrifugation adjacents les uns aux autres avec une part, et transférer rapidement la solution d'échantillon avec l'autre main. - Laisser la réaction de perméthylation se dérouler pendant 11 min. Agiter chaque échantillon au moins 4-5 fois au cours de cette période. Pour faciliter perméthylation efficace, qui se produit à la surface de billes de NaOH, utiliser des embouts gel de chargement pipette tip-frisée comme Agitateurs pour mélanger délicatement le contenu de la colonne. mélange agressif peut percer le filtre de spin, pulvérisez et de suspendre des perles de NaOH (ce qui peut réduire l'efficacité de l'extraction liquide / liquide ultérieure), et / ou causer la perte de l'échantillon (comme sagranulés de NaOH mple trempés peuvent déborder de la colonne).
- En préparation à l'étape d'extraction liquide / liquide subséquente, préparer une quantité suffisante de 0,5 M de chlorure de sodium (NaCl) dans un tampon phosphate de sodium 0,2 M (pH 7,0), pour être stocké à température ambiante. Chaque échantillon nécessitera un total de ~ 12 ml de solution de NaCl pendant trois cycles d'extraction liquide / liquide.
- A l'issue de la période de 11 min perméthylation, immédiatement encore débrancher soigneusement les colonnes et les centrifuger pendant 15 secondes à 2400 x g. Jeter les bouchons.
- Quantitativement transférer chaque solution d'échantillon à son NaOH-bead rempli co microfuge de spin correspondantlonne. Utiliser un embout de pipette de 1000 pi pour cette étape. Après le transfert, à sertir ~ 2 mm de l'extrémité d'une pointe de 200 pi et le laisser dans le contenu de la colonne à utiliser comme un agitateur. Répétez l'opération pour tous les échantillons.
- Retirer immédiatement les colonnes de spin de la centrifugeuse et les placer dans une nouvelle série de tubes réservoirs de spin vides, laissant la solution d'écoulement contenant glycanes fraîchement perméthylés derrière. Ne pas jeter quoi que ce soit.
- Dès que possible, ajouter 300 ul d'acétonitrile (ACN) pour les filtres, de spin NaOH remplis secs. Centrifuger les filtres de spin pendant 30 secondes à 9600 x g.
- Immediately par la suite, le transfert de la solution de perméthylation principale ( à savoir, la solution qui a été mis en incubation avec les billes de NaOH pendant 11 minutes , puis filé à travers le filtre de filage dans un tube à centrifuger avant l'addition de 300 pi d'ACN à l'étape précédente) à silanisé 13 x tubes à essai en verre de 100 mm contenant 42 3,5 ml de 0,2 M de tampon phosphate de sodium contenant 0,5 M de NaCl, pH 7,0 et mélanger (vortex) immédiatement. Évitez de transférer tout résidu solide blanc lors de cette étape. Pour ce faire, pour chaque échantillon avant de passer à l'étape suivante.
- Sans délai, le transfert (combiner) l'ACN spin-travers dans chaque tube de réservoir (avec) le reste de l'échantillon liquide dans son tube de verre silanisée respectif et mélanger (vortex) immédiatement. Encore une fois, éviter de transférer tout résidu solide blanc lors de cette étape. Cap, secouer, et le vortex le tube de verre. Répétez l'opération pour chaque échantillon. Jeter les colonnes de NaOH et pipettes Pasteur dans des conteneurs de déchets appropriés.
- Liquid / Liquid extraction et Glycan Purification
- A l'intérieur de la hotte, ajouter 1,2 ml de chloroforme à chaque échantillon. Immédiatement après, boucher les tubes de verre silanisées et vigoureusement mélanger le contenu.
- des blocs métalliques de préchauffage à environ 75 ° C, dans un collecteur d'évaporation. Utilisez des blocs de chauffage avec des puits pouvant accueillir 13 mm x 100 mm tubes en verre.
- Obtenir une nouvelle série de pipettes silanisées Pasteur, pipettes Pasteur non silanisées, et des tubes à essai en verre silanisées avec des bouchons.
Attention: Chloroforme (CHCl 3) est un irritant, mutagène et cancérigène potentiel capable d'imprégner par certains types de gants. - Centrifuger (~ 3 000 x g) des tubes de verre contenant l'échantillon afin de séparer les phases aqueuses et organiques.
- Utiliser une pipette Pasteur silanisées non suffisante pour extraire la couche aqueuse supérieure telle que ~ 3 mm de la couche aqueuse reste au-dessus de la couche organique inférieure.
- Ajouter 3,5 ml de M Na 0,5solution de Cl dans un tampon phosphate de sodium 0,2 M (pH 7) à chaque tube de verre, mélanger vigoureusement et centrifuger brièvement (~ 3 000 x g). Comme dans l'étape précédente (1.4.3), en utilisant une pipette de Pasteur non silanisé pour extraire la couche aqueuse.
- Répétez l'étape précédente (1.4.4), mais laisser ~ 1 ml de la phase aqueuse.
- Utilisez un silanisé pipette Pasteur propre pour transférer la couche organique à un silanisé tube à essai en verre mm propre et correctement étiquetés 13 × 100. Éviter la contamination aqueuse par extraction de la manière suivante:
- Maintenir les deux tubes à essai en verre silanisée de courant et de nouveaux adjacents les uns aux autres dans une main. Avec l'autre main, appuyez sur le bulbe de pipette pour créer des bulles lors de l'insertion de la pipette vers le bas à travers la couche aqueuse.
- Une fois à l'intérieur de la couche organique, cesser de créer des bulles, et maintenir l'ampoule de pipette régulière pour permettre aux couches organiques et aqueuses pour stabiliser et se séparent à nouveau. Ensuite, relâchez lentement l'ampoule de retirer autant de la organic couche possible sans contamination aqueuse.
- augmenter rapidement la pointe de la pipette à travers la couche aqueuse, et de résister le réflexe naturel de relâcher légèrement l'ampoule (qui se traduit par le retrait une certaine contamination aqueuse) tout en augmentant la pipette hors du tube.
- Rapidement transférer la couche organique à faible viscosité pour le nouveau tube adjacent. Toute contamination aqueuse sera visible sous forme de petites gouttelettes de liquide sur le dessus de la couche organique extraite dans les nouveaux tubes de verre. Si la contamination aqueuse / NaCl est visible, retirez-le avec une pipette; centrifuger si nécessaire de mettre en commun les gouttelettes aqueuses en une seule goutte.
- Éliminer correctement les vieux tubes de verre, pipettes et aqueuse et des solutions de déchets organiques. Laver et recycler bouchons de tubes de verre.
- Sécher tous les échantillons sous un courant doux et constant d'azote dans une évaporation collecteur préchauffé à 75 ° C pendant environ 5 min dans une hotte. Pour assurer le refroidissement par évaporation pendant tout ste sec vers le basps, un flux doux et constant d'azote doit perturber la surface liquide sans éclaboussures ou éclaboussant le liquide. Prélever des échantillons provenant de l'évaporation du collecteur lors du séchage complet de l'échantillon final. taches blanches au fond d'un des tubes de verre séchées indiquent tampon / contamination de NaCl.
- Pause la procédure ici s'il n'y a pas assez de temps restant dans la journée pour terminer l'étape d'hydrolyse TFA. Temporairement (ie, la nuit) stocker des échantillons secs à -20 ° C. Pour continuer la procédure après stockage, retirer les échantillons du -20 ° C congélateur et leur permettre de se réchauffer complètement avant de déplafonnement.
- Alors que les échantillons au chaud, en préparation de l'acide trifluoroacétique (TFA) hydrolyse (étape suivante), mis le manteau de chauffage de telle sorte que la température du liquide contenu-éprouvette atteindra 121 ° C. Préparer la solution de TFA de TFA stock (voir l'étape 2.1 ci-dessous).
2. acide trifluoroacétique (TFA) Hydrolyse
3. Réduction 4. acétylation (Joué dans un hottes) 5. chromatographie en phase gazeuse - spectrométrie de masse (GC-MS) Analyse 6. Données
Attention: borohydrure de sodium (NaBH 4) est une toxine réactif à l' eau hygroscopique et irritant puissant qui libère-au contact avec des vapeurs inflammables hautement eau qui causent des brûlures graves lors d'un contact par inhalation, ingestion ou yeux / peau.
Attention: l' hydroxyde d' ammonium (NH 4 OH) est un irritant corrosif et la toxine capable de causer des brûlures graves et des lésions organiques irréversibles au contact par inhalation, ingestion ou yeux / peau. Rincer les zones touchées avec de l'eau pendant 30 minutes, et empêcher la victime de frotter ou de gratter les zones touchées.
Remarque: Pour distinguer les bulles d'air des gouttelettes de liquide, incliner le tube à essai. Seules les gouttelettes de liquide se déplacent après basculement, mais l'inverse est pas toujours vrai: si une bulle ne bouge pas, il peut encore être un (très petit) gouttelette de liquide.
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Representative Results
Chromatogramme de courant ionique total (CIT) présentant perméthylation, de l' hydrolyse, la réduction et l' acétylation des échantillons de plasma sanguin humain par rapport au cas où les deux étapes critiques de la perméthylation ont été exécutées de manière incorrecte sont représentés sur la figure 3.
Absolute Rendement HexNAcs relative à hexoses:
N -acetylhexosamine (HexNAc) acétates alditol partiellement méthylés (PMAAs) ont tendance à avoir un rendement inférieur à hexoses. 43 Pour estimer le rendement absolu de HexNAcs par rapport à hexoses, six échantillons de 10 ug de N -acetyllactosamine (un disaccharide Gal1-4GlcNAc) dans 10 ul d'eau ont été analysés. les aires des pics de TIC pour le galactose terminal (T-Gal) et 4-GlcNAc ont été intégrés. Le pourcentage de 4-GlcNAc par rapport à la quantité totale de t-Gal et 4 GlcNAc était de 11,3 ± 0,7%(SEM). Bien que les rendements HexNAc sont reproductibles (voir ci-dessous), le fait que cette valeur est nettement inférieure à la valeur théorique de 0,5 indique que le rendement en HexNAcs est fondamentalement inférieur à celui des hexoses. (Le rendement théorique est de 0,5 HexNAc parce N -acetyllactosamine est un 1:. Hexose-HexNAc disaccharide 1)
Intra- et Interassay Reproductibilité:
Intra- et reproductibilité inter -essai pour tous les nœuds glycanes contribuant au moins 1% de la hexose totale ou le signal HexNAc sont fournis dans le tableau 1. Ces données ont été acquises par 3 analystes séparés sur 3 jours différents, en utilisant le même stock de plasma EDTA. Données de stabilité Autosampler en vertu du présent protocole optimisé pour les 18 nœuds glycanes les plus abondants dans le plasma humain (ceux avec> 1% de la hexose totale ou d'un signal HexNAc) sont prévus à la figure 4.
Autres observations notables:
Tout en optimisant la méthodologie perméthylation, nous avons constaté qu'il ne soit pas nécessaire pour empêcher l'adsorption de l'eau par les billes de NaOH avant le premier lavage avec de l'acétonitrile. Nous avons également constaté que la présence d'une petite quantité d'eau lors de l'étape d'acétylation finale en combinaison avec une brève période de chauffage avec l'anhydride acétique sans TFA contribue à faciliter une réaction complète. Enfin, la grande puissance de résolution de temps de vol (TOF) spectrométrie de masse est pas nécessaire pour le succès de l'analyse de nœud glycane: Les premiers résultats basés sur l'injection parallèle de la même série d'échantillons sur un GC-TOF-MS et un quadripôle de transmission traditionnelle à base de GC-MS utilisé dans la surveillance d'ions sélectionnés en mode (SIM) montrent des résultats similaires en termes de hexose normalisée finale et abondances relatives HexNAc.
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. Figure 1. Présentation moléculaire de la procédure globale d'analyse de méthylation glycane Un O lié en glycane est illustrée; ceux - ci sont libérés pendant le processus de perméthylation, qui a été adapté de Goetz. 40 Après perméthylation et à l' hydrolyse, les monosaccharides sont réduits et les groupes hydroxyles naissantes "marqués" par acétylation. Le motif unique de méthylation et d' acétylation dans les derniers acétates d'alditols partiellement méthylées (PMAAs) correspond à l'unique "noeud glycane" dans le polymère intact d' origine et fournit la base moléculaire pour la séparation et la quantification par GC-MS. N liés en et glycanes glycolipides sont libérés comme monosaccharides de liaison marqué pendant l'hydrolyse acide. Adapté de Borges et al. 33 avec la permission.> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Vue d' ensemble conceptuelle du concept d' analyse. Une glycosyltransférase régulée à la hausse (par exemple, GnT-V) provoque une augmentation de la quantité d'un résidu de monosaccharide lié glycane unique spécifique (mannose "node" 2,6-linked dans cet exemple) -qui, par l'action ultérieure d'autres glycosyltransférases, peut conduire à la formation d'un mélange de structures entières glycanes hétérogènes à faible nombre de copies de chaque-tout ce qui peut être difficile à détecter et quantifier de façon systématique. la mise en commun analytiquement ensemble les «nœuds glycanes» parmi toutes les structures glycanniques aberrants fournit une mesure de substitution plus directe de l'activité GnT-V que toutes les glycanes intactes simples. Mesure simultanée de N -, O -, et des lipides liés "glyc un des nœuds »dans biospécimens tout tel que décrit ici (et à l' origine ailleurs 33) représente un point de vue conceptuel de nouveaux moyens permettant de détecter et de surveiller les maladies glycane-affectives telles que le cancer. réelles chromatogrammes d'ions extraites à partir d' échantillons de plasma sanguin 10 microlitres indiquées. Numbers adjacentes à les résidus monosaccharide dans des structures glycanniques indiquent la position dans laquelle le résidu supérieure est reliée au reste inférieur. Si aucune des positions de liaison sont indiqués dans l'annotation chromatogramme le résidu est soit en position terminale ou libres en solution (par exemple, le glucose). Tous les résidus . sauf liaison acide sialique vers le bas par l' intermédiaire de leur position 1, les liens d'acide sialique vers le bas par sa position 2 Split en chromatogramme indique le changement dans chromatogrammes d'ions extraits: m / z 117 +129 pour les résidus d'hexoses et m / z 116 + 158 N - acétyl (HexNAc) résidus. Adapté de Borges et al. 33 avec la permission.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les résultats représentatifs. Chromatogrammes courant d'ions total (CIT) pour glycane analyse des noeuds du même échantillon EDTA plasma sanguin humain dans lequel a) l'échantillon a été traité correctement, B) , le résidu blanc dans la solution de perméthylation qui a été filé à travers le NaOH la colonne a été effectuée dans le mélange ultérieur pour l' extraction liquide / liquide, et C) la solution de perméthylation qui a été filé à travers la colonne de NaOH a été ajouté au tampon phosphate mais pas bien mélangé avant l'addition du chloroforme pour l' extraction liquide / liquide. Légende fourni à la figure 2. S'il vous plaît cliquer havant d'afficher une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Autosampler stabilité. Autosampler stabilité de plus de 48 heures pour les 18 nœuds glycanes les plus abondants dans le plasma humain. A 22 heures, l'échantillon a été complètement séché et reconstitué dans 120 ul d'acétone. Chaque groupe de points de données représente quatre injections consécutives du même échantillon. Les lignes noires englobent ± 15% de la valeur normalisée moyenne pour chaque noeud glycane. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. intra- et reproductibilité inter -essai . Les valeurs représentent% CV de hexose totale ou HexN totaleNœuds glycanes individuels Ac-normalisées. Tous les nœuds glycanes contribuant au moins 1% de la hexose totale ou d'un signal HexNAc sont répertoriés. Les données ont été acquises par 3 analystes séparés sur 3 jours différents, en utilisant le même stock de plasma EDTA. N = 6 échantillons par lot. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce tableau comme une feuille de calcul Excel.
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Discussion
En général, la production réussie d'acétates d' alditol partiellement méthylés de (PMAAs) à partir des hexoses se heurte à moins de difficultés et est plus robuste que la production réussie de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Le mécanisme exact de ce phénomène car il joue dans toutes les étapes de cette procédure est inconnue, mais doit se rapporter à la chimie unique du groupe acétyl N (plutôt que le groupe hydroxyle) qui est unique à HexNAcs par rapport à hexoses. Le mécanisme de ce phénomène en ce qui concerne l' hydrolyse acide est expliqué ailleurs. 43 En bref, la capacité de la -methylacetamido N pour devenir chargé positivement lors de l' hydrolyse acide permet la liaison glycosidique résistant à l' hydrolyse acide. Ceci explique le faible rendement de HexNAc par rapport à hexose (11,3% du HexNAc + hexose signal total, plutôt que 50% du total) , comme décrit ci - dessus pour l'analyse de la N -acetyllactosamine. Notamment, ce relativement lrendement eurs de HexNAcs ne les rend pas difficile à détecter dans biofluides et tissus complexes, ou empêcher la détection facile des noeuds glycanes dérivés de grandes glycanes complexes (par exemple, le 2,4-Man, le 2,6-Man, 3,4,6 -man, et le 3,4-GlcNAc, figure 2). 33 Compte tenu de la manière dont les zones de pic XIC de noeuds de glycane sont normalisées (étape 6.3), tant que le rendement relatif de chaque individu HexNAc reste cohérente par rapport aux autres HexNAcs ( ce qu'il fait, voir le tableau 1), des informations utiles sur les quantités relatives des différents HexNAcs entre les différents échantillons peuvent être obtenus. Cela est vrai pour hexoses ainsi. De plus, nous avons précédemment montré que les rapports des hexoses à HexNAcs affichent un comportement cohérent quantitative et 33 - un phénomène qui est continuellement surveillée par incorporation de QC échantillon (s) dans chaque lot.
La manière dont perméthylation est effectuée a le plus grand impact surle rendement global et la reproductibilité des HexNAc PMAAs. En particulier, un grand soin doit être pris pour éviter complètement l'exposition des glycanes perméthylés à alcalin conditions aqueuses. Deux étapes clés à cet égard sont 1) laissant tout précipité blanc dans les solutions spin-par derrière (étapes 1.3.13 et 1.3.14), et 2) le mélange immédiatement les solutions de spin-through une fois qu'ils sont ajoutés au tampon phosphate ( étapes 1.3.13 et 1.3.14). Un tampon plutôt que d'une solution de sel simple, est inclus à ce stade, et pour les étapes ultérieures / liquide d'extraction de liquide pour empêcher l'alcalinisation par inadvertance de la solution aqueuse. Nous pensons que dans des conditions alcalines, le groupe acétyle, le groupe 2-amino-méthylé et acétylée de HexNAcs peut subir une hydrolyse, ce qui entraîne une amine secondaire plus polaire qui diminue le rendement global d'extraction de l'glycane associé au chloroforme.
La caractéristique la plus facilement reconnaissable de HexNAcs sans succès perméthylés estl'intensité de la GlcNAc 4-linked (4-GlcNAc) pic chromatographique par rapport à celle de la 6-Gal, 3,6-Man, et l'intensité de référence de l'arrière - plan au cours de la dernière colonne étuvage (figure 3). Lorsque l'abondance absolue de la 4-GlcNAc PMAA est faible, son abondance normalisée par rapport à tous les autres HexNAcs tend aussi à être faible, avec une augmentation concomitante (le plus sensiblement) de 3,4-GlcNAc.
Quelques changements visant à optimiser le rendement et le dosage robustesse globale ont été accomplis depuis notre première publication décrivant cette approche analytique 33 L' un de ces changements est la façon dont les chromatogrammes intégrés d'ions extraits (de Xics) sont normalisées. Par souci de simplicité, on divise maintenant la surface de chaque individu hexose XIC par la somme de toutes les zones hexose XIC; De même, la surface de chacun HexNAc XIC est divisée par la somme de toutes les zones HexNAc XIC. Comme on le voit dans le tableau 1, interdosages globale / inter-analyste reproducibillité pour tous les nœuds glycanes qui contribuent à> 1% de leurs hexose ou HexNAc moyennes respectives de signal 13% de CV.
À notre connaissance, ceci est la seule incarnation de glycomique vraiment bottom-up dans lequel les glycanes sont d'abord décomposés puis leurs composants analysés pour construire un portrait de l'échantillon à l'échelle quantitative de la composition glycanes. Ici, au lieu de la libération enzymatique traditionnelle, le processus de perméthylation élimine non-réductive (rejets) O glycanes liés en de leurs protéines respectives, 40 glycanes tandis que N lié en sont libérés lors de l' hydrolyse acide. 33 Comme une approche complémentaire à glycomique traditionnels top-down , cette approche est en mesure de mettre en commun les caractéristiques glycanes uniques d'intérêt tels que "fucosylation de base", "6-sialylation", "bissectrice GlcNAc", et "bêta 1-6 ramification" en signaux analytiques simples (voir, 4,6-GlcNAc , 6-Gal, 3,4,6-Man et de 2,6-Man noeuds dans la figure 2, respectively). Dans les approches traditionnelles de haut en bas, des caractéristiques telles que celles - ci qui dépendent en dernier ressort des activités uniques d'un ou deux glycosyltransférases clés 33 sont généralement répartis dans des dizaines de glycanes intacts et peuvent parfois être difficiles ou impossibles à résoudre (par exemple, 3-sialylation vs. 6-sialylation) en raison de la dégénérescence des masses glycane intactes. En outre, l'approche bottom-up présenté ici a démontré la promesse initiale dans la détection non-invasive du cancer du poumon. 33 D' autres études sont en cours pour valider ces premiers résultats, ainsi que les résultats non publiés, mais se rapportant à la détection d'autres formes de cancer.
La plus grande limitation de l'approche décrite ici est qu'il est limité en termes de ses limites de détection, si elle devait être appliquée glycoprotéines de pré-isolés. Sur la base des analyses inédites de normes glycanes individuelles sans protéine porteuse, les limites de quantification for glycanes individuels semblent se situer dans l'ordre du microgramme faible. Ceux-ci ne sont nullement faibles LQ en termes absolus, mais ce fait n'a pas d'importance en ce qui concerne le champ d'application prévu à l'origine de l'essai, qui n'a pas été conçu pour et n'a pas besoin d'atteindre de faibles LQ (au moins pour les fins décrites ici et dans notre précédente publication 33). En fait, le plasma humain / sérum contient des glycoprotéines dans les 10s de concentration mg / ml gamme- à- dire que , pour l'analyse du plasma sanguin / sérique nous injectons seulement ~ 1/100 ème du volume de l' échantillon final et partagé 40 des 41 parties de cette petite quantité à déchets dans le port d'injection de GC. Sans cette pratique, certains des noeuds glycane peut saturer le détecteur. quantités Picomole de glycoprotéines qui peuvent produire des signaux glycanes intacts adéquats par top-down MALDI-MS conventionnelle ou LC-MS approches fondées ne peuvent pas être détectées avec cette approche. Le perfectionnement de la méthodologie est en cours pour remédier à cette limitation.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
| 0.9 ml Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
| GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps |
| 1.5 ml polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| 2 ml polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
| Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
| Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
| Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
| 13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
| Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
| Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
| Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
| Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
| Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
| Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0-30.0% |
| Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
| Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
| Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
| Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
| Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
| Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
| Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
| Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
| Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep) |
| Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
| Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
| Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
| DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
| Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
| Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
| *Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. | |||
References
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