Abstract
El desarrollo embrionario es un proceso de múltiples etapas que implica la activación y la represión de muchos genes. Los elementos potenciadores en el genoma se sabe que contribuyen a los tejidos y células de tipo regulación específica de la expresión génica durante la diferenciación celular. Por lo tanto, su identificación y de la investigación es importante para entender cómo se determina el destino celular. La integración de los datos de expresión de genes (por ejemplo, microarrays o RNA-seq) y los resultados de la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP), con base en los estudios de genoma completo (chip-ss) permite la identificación a gran escala de estas regiones reguladoras. Sin embargo, la validación funcional de potenciadores específicas del tipo de célula requiere más in vitro y en los procedimientos experimentales in vivo. A continuación se describe cómo se pueden identificar y validar experimentalmente potenciadores activos. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo paso a paso que incluye: 1) la identificación de regiones reguladoras por análisis, 2) la clonación y exper datos chip-ssvalidación imental del potencial regulador putativo de las secuencias genómicas identificadas en un ensayo reportero, y 3) la determinación de potenciador de la actividad in vivo mediante la medición de nivel de transcrito de ARN potenciador. El protocolo que se presenta es suficientemente detallada para ayudar a cualquier persona para establecer este flujo de trabajo en el laboratorio. Es importante destacar que, el protocolo puede ser adaptado fácilmente y utilizado en cualquier sistema de modelo celular.
Protocol
1. Selección del reforzador basado en el análisis de Chip-ss
- Descargar el archivo de datos en bruto FASTQ RXR chip-ss (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) de http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
- Descargar y extraer el archivo de índice BWA requerida para la alineación (en nuestro caso: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
NOTA: Visita a https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts para obtener más información con respecto a las etapas de análisis de la bioinformática y para descargar los scripts utilizados a continuación. - Alinear el archivo de ejemplo FASTQ al genoma mm10 (utilizar el script: perform_alignment.sh). Esto creará una carpeta con un archivo .bam y estadísticas de la alineación. los datos de chip-ss RXR alineados (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), y el archivo de índice correspondiente (.bai) están disponibles aquí:
http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
NOTA: ABM es un paquete de software que se alinea relasecuencias relativamente cortas (por ejemplo, resultados de chip-ss) a una base de datos de secuencia, como la referencia del genoma del ratón (por ejemplo, mm10) 13. - Ejecutar el script (callpeaks.sh) para realizar llamadas de pico y de novo motivo de análisis. Utilice el archivo .bam que la entrada. El guión se basa en Homer findPeaks 14.
NOTA: Los archivos de salida nos dan información sobre el número total de picos, el enriquecimiento de los motivos, el porcentaje de los antecedentes, y las secuencias diana con motivos, etc. (Figura 1). Por lo general varios motivos se enumeran en orden de su importancia. - Reasignar el # 1 clasificado con motivos (NR mitad `AGGTCA`) (utilizar el script: remap_motif.sh)
NOTA: Como el resultado, el script genera un archivo .bed que mostrará los cuales chip-picos están cubriendo las regiones genómicas que contienen el sitio de unión canónica del factor de transcripción de interés. - Descargar y visualizar los resultados de la RXR lee el chip-ss alineados (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (también descargar el .bai)) y las ocurrencias AGGTCA motivo (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) por Integrativa Genómica Visor (IGV) 15 para identificar putativo RAR / RXR sitios de unión (Figura 2 y Figura 3).
NOTA: La integración de diversos datos de chip-ss ayudará a predecir con precisión más potenciadores buenos candidatos 16,17. Estudios recientes revelaron que los potenciadores activos se enriquecen típicamente para P300 y se correlacionan con H3K4me1 y H3K27ac, y se encuentran en las regiones de cromatina abierta, mostrando de ese modo la ADNasa-I hipersensibilidad también se recomienda 18-21. - Utilice la opción "Definir una región de interés" en el IGV 15 para obtener 200 - secuencia 400 pb de la región genómica seleccionado y utilizar estas secuencias para los diseños de cebadores siguientes.
2. Ensayo Reportero
NOTA: Se aplica el sistema luciferina / luciferasacomo un ensayo de indicador muy sensible para la regulación transcripcional. Dependiendo de la enzima luciferasa potenciador de la actividad se produce que catalizará la oxidación de luciferina a oxiluciferina resultante en bioluminescense, que puede ser detectado. Como primer paso, secuencias potenciadoras putativos identificados deben ser subclonados en un vector reportero (por ejemplo, TK-luciferasa 22, pGL3 o NanoLuc).
- Diseño de cebadores
- Diseño cebadores de PCR para la amplificación de 200 - 400 pb de las regiones de potenciador putativo por Primer3 (disponible aquí: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
- Copiar y pegar la secuencia genómica del IGV que incluye el supuesto sitio de unión en Primer3 (véase el paso 1.7). Conjunto rango de tamaño del producto a 250 - 300 pb en Primer3.
- Validar los cebadores de PCR utilizando la UCSC Genome Browser es in silico herramienta de PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
NOTA: Este protocolo en un paso posterior utiliza HindIIrestricción BamHI I y enzimas para la clonación. Comprobar si la secuencia amplificada por PCR según lo predicho por la herramienta de PCR UCSC in silico, contendrá AAGCTT o GGATCC sitios de restricción (por ejemplo, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). - Obtener los cebadores necesarios de un proveedor comercial.
- Amplificación por PCR de potenciador de la secuencia de ADN genómico
- Purificar plantilla de ADN genómico a partir de células primarias (por ejemplo, fibroblastos embrionarios primarios). Utilice kit comercial para el aislamiento ADNg y siga las instrucciones del fabricante.
NOTA: La alta calidad de ADNg es esencial para el éxito de la amplificación por PCR. clones BAC apropiados pueden ser utilizados si la PCR no es fácil de gDNA. - Preparar 50 l de reacción de PCR que contiene 100 ng de ADNg, 5 l de 10x tampón, 3 l MgSO4 (25 mM), dNTP 5 l (2 mM cada uno), 1,5 l del Fwd imprimación (10 mM), 1,5 l de cebador Rev (10 M) , 1 l de ADN polimerasa
- Ajuste el ciclo de PCR (2 minutos a 95 ° C, (20 seg 95 ° C, 10 seg 58 - 65 ° C, 18 seg 70 ° C) de repetición x25, 2 min 70 ° C, para siempre 4 ° C). Ajuste la temperatura de recocido con la consideración de la imprimación de predecir valores de Tm.
- Se purificó el producto de PCR con un kit de purificación de PCR comercial y siga las instrucciones del fabricante.
- Introducir los sitios de restricción para la clonación mediante la repetición de la PCR con cebadores tal como se utiliza anteriormente, pero la adición de salientes en sus extremos 5 '(por ejemplo, Fwd: 5'-ATAT AAGCTT XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3' (HindIII), Rev: 5'-TATA GGATCC XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX -3 '(BamHI)).
- Funciona con 5 l de producto de PCR en gel de agarosa para comprobar si los productos de PCR inespecíficos.
NOTA: Si se detectan más bandas, correr todo el producto de la PCR y purificar la banda apropiada mediante un kit de extracción de gel comercial. - Restricción
NOTA: Para clonar inserto aguas arriba del promotor TK 22 el producto purificado de PCR y el vector (por ejemplo, TK-Luc) debe ser digerido con HindIII y BamHI.- Preparar una mezcla de reacción de 50 l que contiene 1 g de producto purificado PCR, 1 HindIII mu l (20 U / l), 1 l BamHI (20 U / l) y 5 l de 10x tampón.
- Preparar un vector que contiene 250 l mezcla de reacción 5μg (TK Luc, o vector indicador alternativo), 5 l HindIII (20 U / l), 5 l BamHI (20 U / l), 5 l termosensible fosfatasa alcalina (1 U / l) y 25 l de 10x tampón.
NOTA: El tratamiento de la AP vector disminuye en gran medida la auto-ligación del vector digerido y por lo tanto solo el fondo. - Se incuban las mezclas de reacción durante 4 horas a 37 ° C, a continuación purificar los productos de la PCR digerido y el vector con un kit de purificación de PCR comercial.
- Ligationorte
- Configurar la reacción de ligación en tubos de PCR incluyendo 2 l de 10x T4 tampón ADN ligasa, 10 ng TK-Luc vector, inserto 50 ng (digerido producto de PCR), 1 l de ADN ligasa de T4 (400 U / l) y libre de nucleasa agua hasta 20 l.
NOTA: Preparar un control negativo, donde la reacción no contiene inserto. - Mezclar suavemente la reacción de la pipeta hacia arriba y hacia abajo, centrifugar brevemente los tubos de PCR utilizando mini centrífuga y luego se incuba a temperatura ambiente durante 10 min.
- Heat inactivar a 65 ° C durante 10 min y después se enfría en hielo y utilizar 5 l de producto para la transformación en 50 l de células competentes (por ejemplo, DH5a).
- Use el procedimiento de choque térmico estándar para transformar bacterias, recoger colonias y aislar el ADN plásmido con un kit comercial. Validar todas las construcciones mediante la secuenciación antes de los pasos a seguir.
- Configurar la reacción de ligación en tubos de PCR incluyendo 2 l de 10x T4 tampón ADN ligasa, 10 ng TK-Luc vector, inserto 50 ng (digerido producto de PCR), 1 l de ADN ligasa de T4 (400 U / l) y libre de nucleasa agua hasta 20 l.
- La transfección de células madre embrionarias
- Utilice placas de 48 pocillos. Añadir 200 l solut gelatina 0,1%ion / pocillo 30 min antes de chapado celular.
- madre embrionarias (ES) las células de la placa al día antes de la transfección. Utilizar células madre embrionarias libres de alimentador y placa a una densidad de 3 x 10 4 células por pocillo en 250 l ES medios / pocillo.
- Preparar las mezclas de plásmidos (cada mezcla se calcula para 8 pocillos, 4 sin tratar y 4 tratado con ácido retinoico) Mezclar 1:. 1250 ng TK-Luc vacío (control negativo), 950 ng de β-galactosidasa vector de codificación (beta Gal), mezcla de 2 : 1.250 ng TK-Luc Hoxa1 potenciador (control positivo), 950 ng beta Gal, mezcla 3: 1.250 ng TK-Luc PRMT8 potenciador (región de interés), 950 ng beta Gal.
NOTA: células madre embrionarias expresan los factores de transcripción deseadas (RAR / RXR). Deja pozos no transfectadas para determinar los valores de base más tarde, durante las mediciones de luciferasa y β-galactosidasa. - Añadir medio de suero reducido de calidad transfección de cada plásmido mezclar hasta 106 l volumen total (suficiente para 8 pocillos).
- Añadir 4,5 l transfectar calidad ESreactivo de iones luego mezclar cuidadosamente con la pipeta 15 veces arriba y abajo. Incubar la mezcla de transfección durante 10 min a RT.
- Añadir 13 l de la mezcla de transfección a las células por pocillo, mezclar bien con la pipeta. Colocar las células de nuevo en la incubadora (37 ° C) O / N antes del tratamiento ligando.
- Retire el medio cuidadosamente por aspiración de las células y añadir 250 l fresca media / pocillo que contiene 0,01 - 1 M ácido trans-retinoico (RA) como la concentración final o DMSO como vehículo. Se incuban las células por 24 - 48 h.
Nota: El ácido retinoico es sensible a la luz.
- Preparación de lisados de células
- Diluir 5x tampón de lisis (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 ditiotreitol M (DTT) (en H 2 O), 10 ml 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml de glicerol, 5 ml de Triton X-100, estéril agua hasta 100 ml) en 1X usando agua estéril, añadir 20 l DTT 1 M / 10 ml y se equilibre a temperatura ambiente antes de su uso. Preparar 10 ml para una placa de 48 pocillos en el día del ensayo. Retire el medio cuidadosamente por aspiración de las células. Enjuagar las células una vez con PBS 1x. Añadir 200 l de 1x tampón de lisis / pocillo directamente a las células.
- Agitar durante 2 horas a RT (lisis química). Congelar los lisados de células en la placa a -80 ° C (lisis mecánica). Los lisados se pueden almacenar a -80 ° C durante varios días.
- Descongelar los lisados. Después de la descongelación completa, la transferencia de lisados de células a una placa de 96 pocillos usando una pipeta multicanal electrónica. Transferencia de 80 l de lisado celular a placas de 96 pocillos clara para el ensayo de β-galactosidasa y 40 l de lisado celular a una placa blanca para la medición de la luciferasa. Evitar la formación de burbujas.
- β-galactosidasa de ensayo
NOTA: beta galactosidasa o segundo reporteros alternativos deben utilizarse como un control interno para tener en cuenta las variaciones experimentales no específicos.- Preparar tampón de sustrato β-galactosidasa: 80,0 g de Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g de KCl, 1,0 g de MgSO 4 • 7H 2 O, realizar hasta 1.000 ml con agua estéril. Ajustar el pH a 7,4. Esterilizar por filtración (0,2 micrómetros) y se almacena a 4 ° C
- Mezclar tampón de sustrato 1 ml β-galactosidasa con 4 mg ONPG (o-nitrofenil-β-D-galactosidasa). Añadir 3,5 l de 2-mercaptoetanol (βME) por 1 ml de tampón justo antes del uso. Añadir 100 l de tampón de sustrato de β-galactosidasa a 80 l de lisado celular.
- Se incuban las reacciones a 37 ° C hasta que un color amarillo tenue se ha desarrollado. Leer la absorbancia a OD 420 nm en un lector de placas y exportación de datos.
NOTA: El tiempo varía dependiendo de la eficiencia de la transfección, por lo general no más de 30 min.
- Ensayo de luciferasa
- Preparar 50 ml de reactivo sustrato luciferina: 15,1 mg de sal de D-luciferina, 82,7 mg de sal ATP, 185 mg MgSO4 • 7H 2 O, añadir a un tubo de 50 ml de polipropileno,a continuación, añadir 1,5 ml de tampón de HEPES 1 M, 48,5 ml de agua libre de ATP, vórtice, asegúrese de que todos los compuestos se disuelven completamente. Mantener 5 - 10 ml alícuotas a -80 ° C.
- Caliente reactivo sustrato luciferina 5 ml a temperatura ambiente antes de comenzar. Pipetear 100 l de reactivo de sustrato a cada pocillo de la placa de blanco que contiene los 40 l de lisado celular y medir la señal inmediatamente usando una máquina de contador luminiscente.
- Obtener actividades de al menos tres experimentos independientes en transfecciones por triplicado.
- Calcular primero la actividad de la luciferasa normalizada base y los valores de β-galactosidasa normalizados de base para cada pocillo restando los valores medios medidos para las células no transfectadas de cada valor medido. A continuación, calcular la relación de la actividad de luciferasa / β-galactosidasa.
3. Caracterización del ARN del reforzador
NOTA: Un indicador más directo de la actividad potenciador ha surgido de reciente genoma-wide estudios que identificaron muchos ARNs no codificantes cortos, que varían en tamaño desde 50 a 2.000 nt, que se transcribe a partir de potenciadores, y se denominan ARN potenciador (16,25,26) Ernas (Figura 4). inducción erna altamente correlaciona con la inducción de genes de exones codificantes adyacentes. Por lo tanto, potenciador de la actividad dependiente de la señal se puede cuantificar in vivo mediante la comparación de la producción erna entre diversas condiciones de RT-qPCR.
- Directrices para la cartilla de diseño para la detección erna por RT-qPCR
- Seleccionar regiones genómicas para mediciones erna que son al menos 1,5 - de 2 kb lejos de los sitios de inicio de transcripción anotada.
NOTA: Es importante destacar que los altos niveles de la transcripción del ARNm a través de potenciadores de intragenic prevenir la cuantificación exacta de erna en la orientación sentido, Ernas antisentido en potenciadores intragenic son detectables y son similares en el nivel de Ernas en potenciadores extragenic. - Como regla general, utilizar regiones 200 - 1000 pb from el centro del factor de transcripción sitio de interés para el diseño del cebador, ya sea en el sentido o hebra anti-sentido (Figura 4 y la Figura 6) de unión.
NOTA: Si GRO-ss, ss-DNasa, H3K4me1, H3K4me3 o los datos H3K27ac chip-ss están disponibles a partir de los tipos de células deseados y las condiciones que se puede utilizar para el primer diseño más preciso. Ernas se transcriben a partir de regiones de potenciador putativo que se caracterizan por altos niveles de H3K4me1 y ME3. La expresión de Ernas se correlaciona positivamente con el enriquecimiento de la marca activada promotor de histona H3K27ac. - Cebadores de PCR para la medición Diseño RT-qPCR de Ernas basado en colorante fluorescente por Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Generar secuencia anti-sentido (complemento de la cadena de sentido inverso) para el diseño de cebadores según: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. De inserción 200 - 300 pb de la secuencia con sentido o antisentido para el primer diseño.
- Seleccionar regiones genómicas para mediciones erna que son al menos 1,5 - de 2 kb lejos de los sitios de inicio de transcripción anotada.
- La medición de Erna Transcripción
- Aislar el ARN total a partir de células tratadas con el reactivo de extracción con fenol ácido comercial / basados en cloroformo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
- Utilice DNaseI para tratar ARN aislado antes de usarlos en la reacción de transcripción inversa. Inactivar la DNasa acuerdo con las recomendaciones del fabricante antes de la transcripción inversa.
- Medir la concentración de ARN después del tratamiento con DNasa I y el uso de 1,000 ng por reacción de RT. Utilice la transcriptasa inversa de alta calidad.
NOTA: Como gran número de Ernas puede no poliadenilado, transcripción inversa requiere el uso de cebadores aleatorios. - Detectar a transcripción inversa erna por RT-qPCR utilizando un procedimiento estándar. Medida de un ARNm no tratamiento dependiente de la normalización (por ejemplo, 36B4, Ppia, GAPDH, Actb).
- Purificar plantilla de ADN genómico a partir de células primarias (por ejemplo, fibroblastos embrionarios primarios). Utilice kit comercial para el aislamiento ADNg y siga las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
Se utilizó un anticuerpo específico para RXR-pan con el fin de identificar los genes que RA-regulada en todo el genoma tienen enriquecimiento receptor en su proximidad. Bioinformática análisis de los datos de RXR chip-ss obtenidas a partir de células madre embrionarias tratados con ácido retinoico reveló el enriquecimiento de la mitad sitio receptor nuclear (AGGTCA) bajo el RXR ocupado sitios (Figura 1). El uso de un algoritmo de bioinformática hemos mapeado vuelta el resultado motivo de búsqueda para el sitio de la mitad de los datos RXR chip-ss (Figura 2). Este análisis nos ha ayudado a identificar con precisión los picos de chip que se solapan con los sitios de unión a receptores nucleares canónicas. La visualización de estos sitios en IGV indicó enriquecimiento de estos factores de transcripción en la proximidad de Hoxa1, un objetivo de RAR / RXR previamente caracterizado (Figura 2 y Figura 3). También se identificó un gen diana novedosa RA, a saber PRMT8 27. esta latter región contiene una repetición directa con ningún nucleótido espaciador entre los dos medios sitios (AGGTCAAGGTCA) (Figura 3). Para validar funcionalmente que el elemento identificado por Hoxa1 de hecho se puede unir RAR / RXR y regulada por la AR que construyó vectores indicadores de TK-luciferasa que contenían ~ región genómica de 300 bp, incluyendo los elementos identificados. También se construyeron vectores sin el elemento de respuesta (Figura 5). Las células ES se transfectaron y la actividad luciferasa se midió en ausencia y presencia de ácido retinoico (Figura 5). Las construcciones que contienen el elemento de respuesta al ácido retinoico (RARE) sí mostró aumento de la intensidad de la señal de luciferasa tras el tratamiento RA, mientras que la construcción sin la RARO no era inducible.
También se estudió la actividad dependiente de ácido retinoico del potenciador Hoxa1. Para determinar si el sentido y antisentido expresión erna del potenciador con destino a RXR Hoxa1 RAR / correlate con la expresión de ARNm del gen, también medimos el nivel de Hoxa1 mRNA (Figura 6). Estos resultados confirmaron que el potenciador de la actividad es inducida por tratamiento de la AR a corto plazo (3 h), lo que confirma que el potenciador es probable que participan en la regulación del promotor de RA-dependiente.
Figura 1. Homer D e Novo Motif Resultados. Se muestra una salida HTML (homerResults.html) generada por Homero para el ejemplo RXR chip-ss. Secuencia de logotipos correspondientes al inicio motivos factor de transcripción enriquecidos identificados por novo motivo descubrimiento en loci con destino a RXR. 7463 RXR ocupada regiones genómicas se utilizaron para la búsqueda de motivos. 77.66% de estas regiones contiene motivos AGGTCA similar (clasificado como # 1). Para una descripción más detallada puede visitar: (http://homer.salk.edu/ho mer / adorno /) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Encontrar genómicos que contienen las regiones con motivos de interés. La visualización del RXR chip-ss alineado lecturas (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam y las ocurrencias AGGTCA motivo (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) por Integrativa Genómica de visualización (IGV). Las alineaciones son de color por el filamento de lectura (Lecturas en la cadena +: rojo, - línea de acción:. azul) Genoma utiliza para la alineación: mm10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Genómica loci de Hoxa1 y potenciadores. PRMT8 IGV instantánea de RXR señales chip-Seq obtenidos a partir de células madre embrionarias (24 hr, 1 M) tratados y tratados con RA 27 se muestran. Identificaron secuencias de unión son de color rojo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 4. Diseño experimental para pruebas de Erna secuencias de codificación potenciadores elegidos para el ARN promotor de medición (ERNA) se debe colocar al menos 1,5 - de 2 kb de distancia con respecto al sitio de inicio de transcripción (TSS) del gen más cercano. ChIP datos-seq del factor de transcripción (TF) de interés y el análisis motivo se pueden utilizar para identificar los sitios de unión directa en todo el genoma. Como unión de trascripcióncional coactivador (por ejemplo, P300) a menudo marca potenciadores distales, regiones enriquecidas tanto para el TF y P300 son buenos candidatos potenciador. La expresión de Ernas se correlaciona positivamente con el enriquecimiento de la marca activada promotor de histona H3K27ac. Regiones 200 -. 1.000 pb de distancia, en el sentido o dirección antisentido del centro del factor de transcripción unión de se recomienda para el primer diseño erna Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. luciferasa actividad del indicador Indicados construcciones en las células madre embrionarias. regiones genómicas indicadas del potenciador Hoxa1 se clonaron en TK-Luc vector y se transfectaron en células madre embrionarias. Construir 1 y 2 contiene el elemento de respuesta al ácido retinoico (RARE, ONUsecuencia subrayadas). Las células fueron tratadas con RA (24 hr, 1 M). beta Gal se utilizó como un control interno para la normalización. Las barras representan valores normalizados medias de cuatro repeticiones biológica. Sd ± *** P <0,005 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. niveles de ácido retinoico inducida por ARN mejorador de transcripción. HOXA1 ARNm y Erna como se mide por RT-qPCR. ARN total fue aislado de las células ES tratados durante 3 horas con ácido retinoico (RA) o DMSO como vehículo (veh). Se muestran los cebadores directos para el sentido y anti-sentido detección erna y los amplicones de PCR. Distancia de las regiones detectadas por erna RT-qPCR desde el centro del sitio de unión RXR se indica. Los valores se normalizaron a la media de 36B4 mRN / A. Los datos representan la media ± SEM *** P <0,005 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA polymerase | Merck Millipore | 71085-3 | for PCR amplification of enhancer from gDNA |
| DNeasy Blood & Tissue kit | Qiagen | 69504 | for genomic DNA isolation |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | for PCR product purification |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | for gel extraction if there are more PCR product |
| HindIII | NEB | R3104L | restriction enzyme |
| BamHI | NEB | R3136L | restriction enzyme |
| FastAP | Thermo Scientific | EF0651 | release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | for ligation |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | for plasmid isolation |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | ES media |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | ES media |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Sigma | M7145 | ES media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | ES media |
| Beta Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ES media |
| FuGENE HD | Promega | E2311 | transfection reagent |
| Opti-MEM® I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-062 | for transfection |
| All-trans retinoic acid | Sigma | R2625 | ligand, for activation of RAR/RXR |
| 96-well clear plate | Greiner | 655101 | for Beta galactosidase assay |
| 96-well white plate | Greiner | 655075 | for Luciferase assay |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio.com | 115144-35-9 | for Luciferase assay |
| ATP salt | Sigma | A7699-1G | for Luciferase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Luciferase assay |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | for Luciferase assay |
| Na2HPO4 •7H2O | Sigma | 431478-50G | for Beta galactosidase assay |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma | S9638-25G | for Beta galactosidase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Beta galactosidase assay |
| KCl | Sigma | P9541-500G | for Beta galactosidase assay |
| ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) | Sigma | N1127-1G | for Beta galactosidase assay |
| TRIzol® | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4368814 | reverse transcription of eRNA |
| Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | Dnase treatment |
| SsoFast Eva Green | BioRad | 750000105 | RT-qPCR mastermix |
| CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System | BioRad | qPCR machine | |
| BioTek Synergy 4 microplate reader | BioTek | luminescent counter |
References
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