Abstract
그것은 심장이 정상적인 노화 동안 부상에 따라 심근 및 심근 매출의 낮은 수준의 발생을 재생하는 제한된 잠재력을 가지고 있음을 인정하고 있지만, 이러한 이벤트의 정량화 도전 남아 있습니다. 이는 공정의 희귀 성 및 다중 셀룰러 소스 심근 유지에 기여한다는 사실에 부분적으로있다. 또한, 심근 세포 내에서 DNA 복제는 종종 배수체 심근로 연결 만 거의 세포 분열에 의해 새로운 심근 세포로 연결합니다. 정확하게 이러한 프로세스 사이에 심근 매출 차별을 정량화하기 위해 필수적이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 핵 분리 및 후속 PCM1의 immunolabeling를 이용하여 식별 DNA 복제 및 심근 핵의 결과로서 생겨 모든 핵 라벨 위해 장기 클레오 표지를 사용한다. 함께이 (C)의 뉴 클레오 사이드 라벨의 정확하고 민감한 식별을 허용핵 인구 ardiomyocyte. 또한, 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 라벨 및 핵 배수성의 분석은 배체 동안 뉴 클레오 시드 통합 한 핵에서 신 심근 핵의 차별을 할 수 있습니다. 이 방법은 심근 binucleation를 통제 할 수는 없지만 배체를 차지하면서, 그것은 신 심근 핵의 신속하고 강력한 정량화 할 수 있습니다. 이 방법은 심근의 재생을 향상시키는 잠재력을 평가 치료제 또는 심근 회전율 및 배수성에 심장 질환의 효과를 조사하고 포함 하류 다수의 애플리케이션을 갖는다. 이 기술은 모든 심장 세포 유형에서 뉴 클레오 사이드 혼입의 정량화를 허용 추가적인 하류 면역 조직 기술과 호환된다.
Introduction
최근 몇 년 동안 심장은 말기 차별화 된 후 유사 분열 장기 1,2 있다는 상상에 도전하는 증거가 축적되고있다. 그러나, 심근 매출 및 재생의 정량화 도전 남아 있습니다.
정확하게 표준 면역 조직 화학 기술을 사용하여 희귀 심근 세대를 식별의 어려움을 잘 3을보고됩니다. 또한, 심근 세대의 세포 소스는 심근의 증식에 의해뿐만 아니라 줄기 세포 분화 4-6으로 기여 증거가 불확실하다. 따라서, 심근 전구 표현형의 지식을 필요로 혈통 추적 모델의 사용이 불가능하고 심근을 포함하는 단일 인구의 확산의 정량화하고, 부적절한. 더욱이 심근가 karyokinesis없이 endoreplication에 대한 잠재력을 가지고있다 (A 배수체 차 결과diomyocyte) 또는 세포질 분열의 (a 이핵 심근의 결과로) 7,8의 부재에서 karyokinesis. 심근 매출의 정확한 정량이 이벤트와 진정한 신 심근 세대를 구별 할 수있는 능력에 달려있다. 심근 세포의 DNA 복제 및 사이클린 의존적 인산화 효소의 발현이 독점적으로 진정한 세포 분열 9,10을 입증하지 않기 때문에이 독특한 합병증을 만듭니다.
장기의 새로운 방법에 의해 버그만 등. 7,11 바와 같이 신 심근 세대의 정량을 지원하기 위해 설립 된 핵 분리 기술 및 심근 핵 식별을위한 pericentriolar 재료 (1) (PCM1)의 면역 라벨을 결합했다 DNA 라벨 및 배수성 분석. PCM-1은 차별화, 비 사이클링 근육 세포의 핵 표면에 축적 중심체 단백질이다. 이전의 연구에 대한 항체 것을 증명하고있다PCM-1은 특히 심근 핵 7,11 라벨 등 PCM1 독립적 그룹들에 의해 사용 된 바와 같이 심근 1,12,13의 동정을 행 하였다. 또한, 우리는 PCM1 표현은 TNT-CRE 형질 전환 마우스 모델 (14) (보충 그림 1)에서 유전자 표지 심근 핵에 매핑 있음을 증명하고있다.
여기에 설명 된 프로토콜에 관계없이 의한 분석 (도 1C 및 D)에서 배체 셀룰러 기원 (도 1A 및 B)를 동시에 클레오 라벨을 제외한 상태에서의 마우스 심장 네오 심근 핵 생성의 정확하고 민감한 식별을 가능하게한다. 이 방법은 심근 binucleation에 대해 제어 할 수 있지만, 심근 매출의 정확한 정량에 필요한 신 심근 핵의 신속하고 강력한 정량화 할 수 있습니다. 더욱이,그것은 심근 세대의 역학의 잠재적 변화를 평가하기위한 신속한 검사 도구를 제공합니다.
DNA 라벨링 일반적 티미 딘 유사체로서 5- 브로 모 -2'- 데 옥시 우리 딘 (BrdU의)을 포함하지만, 여기에 설명 된 프로토콜은보다 신속한 대한 적은 처리 단계를 필요로 5-에 티닐 -2'- 데 옥시 우리 딘 (EDU) 기반 분석을 사용하여 스루 - 넣고 다른 면역 염색 프로토콜과 그에있어서의 전위 하류 어플리케이션 증가와 호환 제작, 면역 검출 용 DNA의 변성 필요로하지 않는다.
그림 1 : 에듀와 연속 펄스에 관계없이 자신의 조상의 신 심근 레이블. (A)는 EDU 세포 분열 동안 심근 세포의 DNA에 혼입된다. 심근 인구의 확산이 있습니다 END_STRONG_1합니다심근의 증가, 또는 교체에 t 및 따라서 생산적인 DNA 합성이 (조직 유지 보수 및 수리에 기여)입니다. (B)는 EDU 세포 분열 동안 심장 전구 세포의 DNA에 혼입된다. 이는 심근 계보로 분화하는 동안 셀에 유지됩니다. 이것은 줄기 세포의 분화는 심근 세포의 수가 증가를 초래하기 때문에 조직의 유지 보수에 기여한다. (C) 심근 세포가 심근 비대증 심근 개조와 관련된 증가 심근 배수성, 결과적으로 "비 제조"DNA 복제를 겪게 할 가능성이 있지만, 손실 된 심근 세포를 대체하지 않는다. 그것은 두 개의 상동 염색체 (> 2N)의 네 개 이상의 세트들을 포함하는 하나의 핵을 가진 심근 결과로서 배체하는 과정 binucleation 다르다. 연속 핵 P는 다음 (D)ulse,이 프로토콜은 심근 배수성 및 에듀 법인 모두의 정량화 할 수 있도록 PCM1 식에 의한 심근 핵의 핵 분리 및 식별을 설명합니다. PCM1의 표현과 유동 세포 계측법하여 검출 듀 설립. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
동물의 작업은 권한과 뉴캐슬 대학 윤리 심의위원회에 의해 승인되었다. 모든 동물의 절차는 과학적인 목적으로 사용되는 동물의 보호에 지침 2010 유럽 의회 / 63 / EU의 가이드 라인을 준수하여 수행 하였다.
1. 에듀 관리
- 멸균 식염수에 녹여 EDU (W / V 0.9 %) 12.5 ㎎ / ㎖의 최종 농도.
- 완전히 용해시키기 위해 40 °의 C 및 와류의 용액을 가열한다. 6 매일 주사를 허용 연구에 모든 쥐를 주입하기 위해 4 ° C에서 충분히 에듀 / 식염수를 저장합니다.
참고 : 일반적으로 6 위에 마우스를 각 실험군이 필요합니다. 그러나, 전력 계산 독립적 연구를 위해 수행되어야한다.
- 완전히 용해시키기 위해 40 °의 C 및 와류의 용액을 가열한다. 6 매일 주사를 허용 연구에 모든 쥐를 주입하기 위해 4 ° C에서 충분히 에듀 / 식염수를 저장합니다.
- 개인 마우스의 무게를. 각 마우스에 EDU / 식염수 100 μg의 / g (g 당 재고 에듀 솔루션 8 μl를) 관리하는 데 필요한 볼륨을 계산합니다.
- 적절한 있습니다 volum을 그립니다25 G 바늘 인슐린 주사기에 EDU / 식염수의 전자.
- 승인 홈 오피스 기술을 사용하여 마우스를 처리하는 동안 복강 내 (IP) 주사를 수행합니다.
- 케이지 뚜껑에 마우스를 놓습니다. 조심스럽게 꼬리의 기초에 다시 당겨 단단히 목덜미에 의해 마우스를 파악.
- 머리의베이스 근처의 검지 손가락과 엄지 손가락으로 마우스를 잡고 바닥을 향해 거꾸로 동물의 머리를 팁으로 주입을위한 복부를 노출.
- 70 % 알코올 용액으로 복부를 닦아주십시오. 동물의 정중선과 오른쪽 아래 사분면을 찾습니다. 오른쪽 아래 사분면에 동물에 EDU / 식염수를 주입한다.
- EDU / 식염수로 쥐를 주사하고 일의 시간을 기록한다.
- 반복 연속 6 일 동안 하루 동시에 1.4-1.2 단계.
주 : 듀 대조군은 유세포 분석에 게이트를 설정하기 위해 필요한 바와 같이, 추가의 연령, 성별 주입 실험적 일치에듀없이 식염수의 동등한 볼륨 에디션 마우스입니다. 이것은 필요한 제어 (NO 듀 제어)를 제공한다. 모든 연구는 시약의 배치의 변화를 허용하는이 컨트롤은 포함되어야하며, 사이토는 설정합니다.
2. 수확 하트
- 6 일 EDU 주입 후 24 시간에서 자궁 경부 전위 (또는 1 홈 오피스 승인 다른 일정 방법)을 사용하여 마우스를 희생.
- 부정사 위치에 희생 동물을 놓고 수술 가위로 다이어프램 중반 복부에서 피부 절개를합니다.
- 다이어프램을 절단하고 심장을 노출 양측 절단, 체강에서 멀리 흉골을 들고입니다.
- 약간 마음을 들어 올려 흉강에서 심장을 해부 유출 기관의 주요 혈관을 잘라.
- 즉시 PBS 4 ℃로 냉각 10 ml에 포함 된 개별 15ml의 원심 분리기 튜브에 각각의 마음을 놓습니다.
- SEP하는 마음을 전송arate 10cm 배양 접시, 메스가 시상 방향이 각의 마음을 잘라 부드럽게 포셉 한 쌍의 압박에 의해 마음을 씻어 사용. 그리고 가능한 한 많은 혈액을 제거하기 위해 PBS를 교체합니다. 두 번이 단계를 반복합니다.
- 동일한 개인 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 각각 심장의 두 부분을 놓습니다.
- 3 또는 선택적으로 저장 표본 단계로 -80 ° C ~ 단계 2.9과 2.10에 설명 된대로 계속합니다.
- 25 G 바늘을 사용하여 심장이 처리 될 때 microcentrifuge 관 뚜껑에 작은 구멍으로 인해 가스의 팽창 개구로부터 뚜껑을 방지 할 수 있습니다.
- 동결 액체 질소 용기에 각 microcentrifuge 관과 장소를 라벨.
3. 핵 해리와 심근 핵 라벨
. (11)이 핵 분리 및 심근 핵 라벨이 버그만 등의에서 적응 주입 모든 샘플에서이 절차를 수행합니다에듀와 주입 된 식염수 (아무 에듀 제어) 음성 대조군과. 다음 단계를 수행하는 데 필요한 솔루션의 조리법은 표 1을 참조하십시오.
- 각각의 마음을 분석하기 위해서는, 30 분 동안 품어, 초 원심 분리기 튜브에 1 % BSA / PBS 용액 36 ml에 배치 솔루션을 폐기 후 자연 건조를 할 수 있습니다.
참고 :이 튜브는 단계 3.6에서 사용된다. - 마음은 닦지 과정에서 해동 할 수 있도록 메스를 사용하여 얼음과 말하다에 10mm 접시에 개별 얼어 붙은 마음을 놓습니다.
- 50 mL의 원심 분리 튜브에 세포 용해 완충액 15 mL를 다진으로 마음에두고, 실온에서 25,000 rpm으로 15 초 동안 프로브 균질기로 균질화.
- 원심 분리기 튜브에 세포 용해 버퍼의 추가 15 ML을 추가하고 대형 통관 유봉과 40 ml의 다운스에 전송합니다. 유봉 10 스트로크를 수행하고 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 100 μm의를 통해 다음 40 μm의 셀 스트레이너를 필터링 할 수 있습니다.
- 10 분 A에 대한 원심 분리기t 700 4 ° C에서 XG에 상층 액을 제거합니다.
- 자당 기울기 용액 25 ㎖의 핵 펠렛을 재현 탁하고 3.1에서 제조 한 초 원심 분리기 튜브에서 신선한 수크로오스 구배 용액 10 ㎖의 위에 용액을 함유하는 세포 핵 계층.
- 스윙 아웃 튜브 로터를 사용하여 4 ° C에서 1 시간 동안 13,000 XG에 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 상층 액을 버리고 1.5 ml의 microcentrifuge 관 및 레이블 PCM1에서 핵 저장 버퍼의 1,300 μL의 핵 펠렛을 재현 탁.
- 새로운 microcentrifuge 관에 정지 300 μl를 제거하고 신선한 핵 저장 버퍼 700 μl를 추가 할 수 있습니다. ISO 컨트롤 등이 튜브를 레이블.
- PCM1 표시된 마이크로 원심 튜브 용액 8 μg의 / 최종 농도 항 PCM1 추가 및 ISO 제어 표시된 microcentrifuge 관 8 μg / ml의 농도 토끼 IgG의 이소 타입 대조군 항체를 추가한다.
- 4 ℃에서 밤새 품어. 다음 incubATION, 10 분 동안 700 XG에 원심 분리기는 700 × g으로 10 분 동안 다시 신선한 핵 저장 버퍼에 resuspend 원심 분리기 1 ml의 교체, 상층 액을 버린다. 뜨는을 취소하고 신선한 핵 저장 버퍼의 1 ㎖로 교체합니다.
- 2 μg / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 F (AB ') 염소 항 - 토끼 IgG를 (H + L) 항체 (FITC 또는 동등한 녹색 형광 염료) 2 단편 1 μL를 추가한다.
주 : F (AB ')의 사용은 단편이 항체는 대 식세포 및 B 세포를 포함하여 면역 세포의 비특이적 표시의 가능성을 감소시킨다. - 알루미늄 호일 랩 튜브는 빛으로부터 보호하고, 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
에듀 정관 4. 검출
- 희석 10 배의 탈 이온수로 듀 반응 완충액 1:10 농축시켰다.
- 원심 분리기 PCM-1, ISO 제어 표시 핵 현탁액 10 분 동안 700 XG에, 상층 액을 버리고 1 ml의 핵 펠렛을 재현 탁1 % BSA / PBS 솔루션입니다. 두 번 핵 펠렛을 씻으십시오.
- 최종 세척 후, 상층 액을 버리고 에듀 정착액 100 ㎕로 교체합니다.
- 빛으로부터 보호하고 실온에서 15 분 동안 배양 알루미늄 호일에 튜브를 감싸.
- 700 XG에 1 % BSA / PBS 용액 1 ㎖ 원심 회 샘플을 세척하고 15 분 동안 실온에서 1X 사포닌 계 permeabilization 용액으로 배양한다.
- 1 배 에듀 라벨 칵테일 (표 2)을 준비합니다. 이 반응의 최소는 더 에듀 컨트롤을 포함하지해야합니다.
- 직접 이미 1 배 사포닌 기반 permeabilization 용액 100 ㎕에 핵을 포함하는 각 시료에 1 배 에듀 라벨 칵테일 500 μl를 추가하고 30 분 동안 빛으로부터 보호 실온에서 품어.
- 1 % BSA / PBS 1 ml의 700 XG와에 resuspend 원심 분리기와이 단계를 두 번 더 반복한다.
- 700 XG에 원심 분리기, 뜨는을 버리고 4로 교체DNA 염색 용액 00 μL (자재 표 참조).
| 시약의 이름 |
| 1. 세포 용해 버퍼 |
| 0.32 M 자당 |
| 하고, 10 mM Tris-HC1 (pH가 8) |
| 5 mM의 염화칼슘 (2) |
| 5mM의 아세트산 마그네슘 |
| 2.0 mM의 EDTA |
| 0.5 밀리미터 EGTA |
| 1 mM의 DTT |
| 2.Sucrose 그라데이션 솔루션 |
| 2.1 M 자당 |
| 하고, 10 mM Tris-HC1 (pH가 8) |
| 5mM의 아세트산 마그네슘 |
| 1 mM의 DTT |
| 3. 핵 저장 버퍼 (NSB) |
| 0.44 M 자당 |
| 하고, 10 mM Tris-HC1 (pH는 7.2) |
| 70 밀리미터의 KCl |
| 10 밀리미터의 MgCl 2 |
| 1.5 MM의 페르 민 |
표 1 : 핵 분리 버퍼 성분 프로토콜 (3) (핵 해리와 심근 핵 라벨)에 사용 된 모든 버퍼에 대한 레시피..
5. 유세포 분석
참고 : 이전에 7,11,15 바와 같이 격리 된 핵에 유동 세포 계측법을 수행합니다.
- 첫째, 파편 (그림 2A)에서 핵의 차별을 할 수 있도록 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC)를 설명하는 플롯을 만들 수 있습니다.
- 높이 대 4 플롯에 의해 집계 (그림 2B)에서 하나의 핵을 구별 할 수있는 플롯 ', 6 diamidino-2-페닐 인돌) 만들기 (DAPI) 지역 (3-405 / 450 / 50 A) (33-405 / 450 / 50-H). 그쪽을 확인t 3-405 / 50분의 450-A 신호는 DNA 함량의 정확한 결정을 허용하는 리니어 스케일에 수집된다.
- SSC 대 535분의 488 / 30를 설명하는 플롯 (PCM-1)을 만들고 단일 인구에 PCM-1 발현을 평가하기 위해 5.2에서 만든 단일 게이트에서 이벤트 만 표시합니다.
- 은 PCM-1 개의 긍정적 인 게이트 (그림 2C)를 구축하기 위해 이소 제어 샘플을 실행합니다. PCM1 소량 인구 게이팅 위치 PCM1 발현을 확인하는 샘플을 표지 실행.
- 450분의 405 / 50 A (DAPI를 감지하기 위해) 대 SSC-A를 설명하는 플롯을 작성합니다. 이 도표에서, 디스플레이는 5.3에서 만든 게이트를 사용하여, PCM1 표현 핵을 단일 항. 만 2N 핵 (그림 2D)를 포함하는 추가 계층 게이트를 만들려면이 플롯을 사용합니다.
- 심근 인구를 발현하는 PCM1의 에듀 라벨의 식별을 허용 1-633 / 20분의 660-A 대 535분의 488 / 30을 설명하는 플롯을 작성합니다. 단일, P 만 핵을 표시 위의 게이팅을 사용하여 CM1 + 및 2N.
- 더 듀 컨트롤에서 실행 심장 샘플은 EDU 긍정적 인 게이트 (그림 2E)을 설정합니다. EDU + 세포에 해당하는 게이트를 만듭니다.
- 기록 및 정량화 단일, 에듀를 통합 한 PCM-1 발현, 2N 핵.
- 총 단일, PCM1 + 핵의 비율로이 인구를 계산합니다. 이것은 전체 심근 핵의 백분율로 칠일 듀 펄스 기간 네오 심근 핵 생성 속도를 제공한다.
주 : DNA 결합 DAPI 화학량 바와 같이 형광 강도는 DNA의 양에 비례한다. 이전 7 바와 같이 405 / 50분의 450-A 신호의 강도에 기초하여 배수성을 결정한다. - 총 심근 인구 내에서 배수성을 평가하기 위해 5.5 년에 설립 된 플롯과 DNA 농도 7을 기반으로 게이팅 전략을 사용합니다.
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그림 2 :. 심근 듀 통합과 배수성을 정량화하는 전략을 게이팅 (A) 핵은 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC)를 기반으로 파편 구별된다. (B)는 선형 게이트가 생성되고 단일 핵 인구 DAPI 표시와 영역 신호 vs는 405/450/50 높이에 기초하여 식별된다. (C) 형광 게이팅은 심장 조직에서 심근 핵 (PCM-양성 1) 및 비 심근 (PCM-1 제외) 핵의 분리를 허용한다. DAPI 신호 (D) 강도 DNA 농도 및 PCM1 +의 심근 인구함으로써 핵 배수성을 결정하는데 사용된다. 마우스에서> 심근 핵의 80 %가 이배체 (2n 개의)입니다. (E)은 형광 게이팅은 2N의 분리를 허용, 2N에서 EDU (PCM + / EDU는 + = 0.9 %)을 통합 한 심근 핵, 에듀을 포함하지 않은 심근 (PCM + EDU-). 모든 단계 프로토콜 5.0에 자세히 설명되어 있습니다. MDX에서 표시 예 -. C57 / BL10 배경에 / y를 마우스 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
증가 배체에 대한 제어하면서이 방법으로 인해 심근 핵 분열로 증가 듀 설립 정량화 할 수 있습니다. BrdU의 기초 분석을 이용하여, 우리는 이전에 포유류의 심장 새로운 심근 세포의 재생과, 뒤 시엔 느 근이영양증의 MDX 마우스 모델에서, 만성 심근 손실에 응답 것을 보여 주었다. 우리는 우리의 또 번역 결과를 검증하기 위해 상기 프로토콜의 유용성을 입증하기 위해 여기에 설명 된 방법을 사용했다. 기술 된 프로토콜에 따라; 성인 (12주 이전) MDX 및 제어 bl10 마우스 7 일 EDU 중 하나 매일 주입 펄스되었고, 실험군 5,13 사이의 정적 분석을 할 수 있도록 이전에보고했다. 펄스 마음의 면역 조직 분석 EDU (그림 3A)를 통합 한 심근을 표현 PCM1의 존재를 보여줍니다. 그러나 데이터가 얻어 날기에듀를 통합 한 다른 종류의 세포가 심근 세포로 잘못 식별 할 수있는 g 면역 조직 방법, 잘못 해석 될 수있다. 이러한 예 보충도 1A 및 B에서 입증된다. 또한 면역 조직 방법은 원자력 부문 배체를 구분하지 않습니다. 이 프로토콜에 설명 된 세포 계측법 분석 흐름으로 인해 배체에 EDU를 통합 한 세포를 제외하면서, MDX 및 제어 마우스에서 심근 원자력 부문의 급속한 정량화 할 수 있습니다. 이전에 게시 된 데이터 (13)와 마찬가지로, 분석은 나이에 비해 MDX 마우스 마음에 신 심근 핵 발전의 속도의 증가를 보여 컨트롤 (도 3B 및 C 0.17 % 대 1.2 %)을 일치.
그림 3 : EDU의 정량화는 야생형 및 MDX 마음에서 심근를 표시. MDX 마음의 40 μm의 두께 섹션에서 촬영 Z 스택의 돌기 (A) 이미지. PCM-1 발현 심근 핵 EDU (빨간색)를 포함하고있다 (녹색). 노란색 화살표는 EDU는 심근 레이블을 나타냅니다. I 및 II 개별 EDU는 Z 평면에 나타낸 심근 레이블을 나타냅니다. (- C57 / BL10 배경에 / y를 MDX) 핵은 DAPI (파란색) (B 및 C) 세포 계측법 격리 된 핵의 흐름 12-13주 된 야생형 (C57 / BL10) 및 MDX 마우스에서 대표 플롯을 나타내는 표지. (B) 히스토그램 2N과> 2N 핵 사이에 DAPI 강도와 차별을 표시합니다. 이 프로토콜에 설명 된대로 분석 할 때 2N의 심근 핵 인구 듀 결합을 보여주는 (C) 플롯. 모든 쥐를 들어 에듀 1에서 1 주 동안 투여 하였다나이 2 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 :. PCM-1 심근 핵에 대한 특정 마커 프로토콜을 사용은 핵이 ROSA NT / NG CRE 민감한 기자 라인 (16)과 TNT-CRE 마우스 (14)를 교차에 의해 생성 된 이중 형질 전환 마우스에서 분리되었다 설명했다. 트로포 닌 T (TNT) 프로모터의 제어하에 생성 된 마우스 CRE 활성화의 핵에 지역화와 GFP의 돌이킬 수없는 표현으로 이어집니다. 핵은 GFP 발현 심근 핵 인구 (530분의 488 / 30 A)를 식별하는 능력을 보여 아이소 타입 컨트롤 (ISO)으로 표시. 안티 PCM1과 핵의 레이블 (감지 차 항체 633-660 /-A 20)에 GFP 표현 cardiomyocy와 PCM1 식의 상관 관계를 보여줍니다테 핵 인구. TNT의 프로모터 활성에 의해 식별, PCM1 항체에 의해 표시되어 심근 핵의 예 98.8 %에서. 보충 그림 1을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2 :. 면역 조직 기술에 의해 심근 갱신을 정량화하기위한 도전 (A) 2D 이미지는 EDU (적색) 표지 한 것으로 나타났습니다이 PCM-1 발현 심근 핵 (녹색)를 보여줍니다. 노란색 화살표는 EDU를 통합 한 심근 세포로 보이는 나타냅니다. 이는 PCM1 발현과 에듀 라벨이-dimentional 이미징을 사용하여 시각의 명백한 공동 현지화이다. (B)이 이미지의 3 차원 돌출부가 EDU 세포가 심근 아니지만 PC 놓인 비 심근 세포이다 식별 표지M1은 심근 핵 발현. 실험에 사용 연령 12 주에서 C57 / BL10 마우스. 보충도 2a를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충도 2b를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 반응 구성 요소 | 반응의 수 | |
| 이 | (5) | |
| PBS | 875 μL | 2.19 ml의 |
| 구리 보호제 | 20 μL | 50 μL |
| 형광 염료 콜릴 아 지드 | 5 μL | 12.5 μL |
| 희석 반응4.1에서 제조 된 버퍼 | 100 μL | 250 μL |
| 총 반응 부피 | 1 ml의 | 2.5 ml의 |
표 2 : 에듀 칵테일 재료입니다. 에듀 라벨 칵테일 레시피 프로토콜 (4) (감지 듀 설립) 필요.
Discussion
정확하게 심근 매출을 정량화하고 재생 분석은 진정한 심근 생성 및 비생산적인 DNA 부문을 구분해야합니다. 많은 연구에만 사이클린 운동성 및 세포주기 마커의 발현을 통해 심근 증식을 정량화, 단순히 이러한 비생산적인 이벤트를 무시하고 계속합니다. 이러한 비생산적인 이벤트를 제어하는 암시 남아있는 동안 심근 매출의 정확한 정량을 할 수있는 하나의 방법 날짜합니다. 특히 이는 심근 DNA 복제의 13 ~ 65 %가되도록 기여 심근 배체를 고려하는 것이 곤란 남아있다. 따라서 심근 발생의 정확한 정량 우리가 증가 배수성 결과 DNA 복제를 배제하면서 네오 심근 핵의 비율의 강력한 정량을 가능하게하는 프로토콜을 개발 지원하기. 비록이 프로토콜 할 수있는 신 심근 장군 사이하지 차별기 및 심근 이중 핵, 그것은 신속 정확하게 사용 상한 심근 세대 (배수성 차지)를 계산할 수있다. 이 프로토콜은 따라서 질병 모델에서 심근 생성 및 배체의 비율의 잠재적 변화를 평가하기 위해 또는 치료제의 잠재적 효율성을 평가하기 위해 선별 도구를 제공합니다. 네오 심근 핵 생성 속도의 변경이 프로토콜을 이용하여 확인되면 심근 핵 번호 심근 세대의 변화에 의한이 이전 2,13,17,18 바와 같이하면 후속 연구를 확인하는데 사용될 수있다. 이 펄스 기간 동안 조직 학적 정량 심근 핵 역학의 사용을 포함하거나의 단핵 및 다핵 심근 개체수 듀 혼입 비교 듀 펄스 동물로부터 얻은 조직 절편의 분석.
때문에 심근 회전율이 낮은 수준프로토콜은 7 일 동안 EDU 여러 주사를 사용한다. 이것은 또한이 심근 세대 셀룰러 모든 잠재적 소스 "쫓는"이 기간 동안 누적 심근 핵 생성의 정량화를 허용 할 수 있습니다. 연구에 따라,이 기간은 심근 생성의 예측 수치에 맞게 조정될 수있다. 심근 핵에 듀 혼입의 정확한 정량화를 들어, PCM-1 반응성을 검출하는 데 사용되는 이차 항체로 핵에는 비 특정 표시가없는 것이 필수적이다. 따라서, 그 이외의 이차 항체가이 프로토콜이 사용되는 경우에 특히 제안 된 프로토콜의 이러한 측면을 최적화하기 위하여 추가 이차 항체 적정 실험을 수행하기 위해 신중하다. 여기에 설명 된 프로토콜은 심근 핵을 식별 PCM-1의 발현을 사용한다. 이 확립 된 심근 세포 마커 인 반면, 다른 마커 확인하는데 사용될 수있다데이터; 이 부분적으로 심근 핵 1에서 지역화로 확인 된 심장 트로포 닌 T에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 마찬가지로, 다른 핵 단백질은 국소 심근 이외 핵 집단에 듀 혼입를 식별하고 정량화하기 위해 사용될 수있다. 이 DNA 합성의 운명을 알 및 세포 분열 또는 증가 배수성 하나 될 수 있으므로 적극적 유사 분열을 겪고있는 모든 심근 핵은 분석에서 제외하는 것이 중요하다. PCM1 따라서, 유사 분열 진행하는 것은 PCM1 식에 의해 식별되지 심근 세포주기의 M 단계에서 분해된다. 또한 세포주기의 S 단계에서 모든 핵 후속 분석에서 제외한다. 이것은 2N과 4N 집단 사이 DAPI 강도와 그들을 포함 2N 인구 위에 DAPI 강도 모든 핵을 게이팅함으로써 달성 될 수있다.
그것은 점점이지만심장이 정상 노화와 다음과 같은 급성 부상 중 심근을 대체 할 수있는 능력을 가지고 있음을 인정,이 가능성의 원인과 정도는 논란이 남아있다. 또한, 심근 매출의 서로 다른 비율은 1,7,20-22을보고되었다. 이는 정확하게 파악하고 신 심근 세대 19 정량화의 어려움을 부분적으로 할 수있다. 대부분의 연구 만 조직 학적 분석의 사용과 심근 매출 및 갱신 2,4,23,24의 정량화에 대한 근절의 단백질을 포함하여 세포질 단백질의 발현을 통해 심근의 식별에 의존 한 날짜합니다. 이러한 방법의 사용은 증식 마커의 발현을 검출하거나, 여기에 설명 된대로, 티미 딘 유사체의 결합은 쉽게 심근 다른 심장 세포 유형의 오인을 초래할 수있다. 3D 공 초점 이미지의 사용은 제 이러한 문제를 완화하는 데 도움이 될 수 있지만ESE 방법은 비용과 시간이 소요된다. 흥미롭게도, 여기에 설명 된 프로토콜 네오 심근 핵 생성 주 당 0.17 %의 비율로 발생 보여준다. 이 최대 0.13 % 5 주간 이직률을 보여주는 기초 연구 세포 계측법 다른 흐름과 일치한다. 그것은 이전의 연구 2,5,25,26에서와 같이,이 데이터를 기반으로 연간 매출 비율을 추정 할 유혹하지만 매출의 비율이 동물 (13)의 수명 기간 동안 동적으로,이 부적절하다.
이 방법은 심근의 재생을 향상시키는 잠재력을 평가 치료제 또는 심근 회전율에 심장 질환의 효과 심근 배체의 비율을 조사하는 전위를 포함한 다수의 애플리케이션을 갖는다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.32 M sucrose | Sigma | 84100 | |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) | Sigma | T3253 | |
| 5 mM CaCl2 | Sigma | c5086 | |
| 5 mM magnesium acetate | sigma | M-5661 | |
| 2.0 mM EDTA | Sigma | E5134 | |
| 0.5 mM EGTA | Sigma | 63779 | |
| 1 mM DTT | Sigma | D0632 | |
| 70 mM KCl | Sigma | P9541 | |
| 10 mM MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 1.5 mM spermine | Sigma | 85590 | |
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade | abcam | abc7415 | |
| Rabbit anti-PCM-1 antibody | Sigma | HPA023374 | |
| Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragment of Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A-11070 | |
| cell strainers 70 μm and 100 μm | Fisher scientific | 11597522, 11517532 | |
| Glass dounce (40 ml) and pestle large clearance | Sigma | D9188-1SET | |
| EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) | Life technologies | A10044 | |
| Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Flow Cytometry Assay Kit | Life technologies | C10634 | This kit inlcudes reagents required for section, EdU reaction buffer, EdU fixative, saponin-based permeabilization solution and the reagents required for the EdU labelling cocktail. |
| CyStain DNA 2 step kit, | Sysmex Partec | 05 5005 | This kit inlcudes reagents required for DAPI labelling (DNA staining solution) |
| Probe homogeniser, e.g., TissueRuptor | Qiagen | 9001273 | |
| TissueRuptor Disposable Probes | Qiagen | 990890 | |
| ultracentrifuge | Sorvall | ||
| Facscanto II | BD Biosciences | ||
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Polypropylene. 38.5 ml, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 326823 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 |
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