Summary
Formålet med denne protokol er at demonstrere isolation og kultur teknikker til murine primære vaskulære glatte muskelceller (VSMC) fra koronar cirkulation. Når VSMC'er er blevet isoleret, kan de bruges til mange standard kultur teknikker.
Abstract
Mens isolering og dyrkning af vaskulære glatte muskelceller (VSMC) fra store skibe er veletableret, vi søgte at isolere og kultur VSMC'er fra koronar cirkulation. Hjerter med intakte aorta buer blev fjernet og perfunderet via retrograd Langendorff med fordøjelsen opløsning indeholdende 300 enheder / ml collagenase type II, 0,1 mg / ml sojabønnetrypsininhibitor og 1 M CaCl2. De perfusater blev opsamlet med 15 minutters intervaller i 90 minutter, pelleteret ved centrifugering, resuspenderet i plating medier, og udpladet på vævskulturskåle. VSMC blev karakteriseret ved tilstedeværelsen af SM22α, α-SMA, og vimentin. En af de vigtigste fordele ved at bruge denne teknik er evnen til at isolere VSMC fra koronar cirkulation af mus. Selvom det lille antal celler opnået kan begrænse nogle af de anvendelser, til hvilke kan anvendes cellerne kan isolerede koronare VSMC anvendes i en række veletablerede celledyrkningsteknikker og ASSAys. Undersøgelser undersøger VSMC fra genetisk modificerede mus kan give yderligere oplysninger om struktur-funktion og signalering processer forbundet med vaskulære patologier.
Introduction
Målet med denne fremgangsmåde er at isolere vaskulære glatte muskelceller (VSMC) fra det murine koronar omsætning til anvendelse i cellekultur og standard celledyrkningsassays. Vi udviklede denne teknik til at vurdere de molekylære mekanismer i vaskulær remodellering ved diabetes. Vi har tidligere rapporteret indad hypertrofisk remodellering i den septale koronararterioler i db / db musemodel for diabetes 1. På grund af den begrænsede mængde væv findes i de murine septumdefekter blodpropper, standard eksperimentelle teknikker, der undersøger protein ændringer (f.eks Western blot) i db / db mus og kontrolmus er vanskelige i bedste. Derudover har vi tidligere vist, at angiotensinreceptorblokker (ARB) losartan reducerer remodeling observeret i db / db-mus 2. Derfor isolering af primære VSMC fra koronar cirkulation giver os mulighed for yderligere at undersøge ændringer i VSMC fænotype eller aktiverede signaleringsveje i diabetiske mus, som kan være contribuTing til negativ koronar arteriole remodeling.
Talrige undersøgelser har belyst kanoniske signalveje ved anvendelse VSMC isoleret fra gnaver aorta, i stedet for i hvert enkelt vaskulære leje. Vi har imidlertid påvist vaskulære leje specifik remodeling i koronar, aorta, og mesenteriske oplag af db / db mus 1, hvilket tyder på VSMC i hvert vaskulære leje kan være anderledes. Det er derfor nødvendigt at isolere VSMC fra hver vaskulære leje for bedre at forstå de patologiske forandringer i hvert sæt VSMC. Der er en overflod af forskellige metoder til isolering og dyrkning af aorta VSMC. Men i øjeblikket, er der kun én undersøgelse, som er offentliggjort på isolering af VSMC fra muse koronar cirkulation 3. Teng et al. var den første til at rapportere en metode til isolering VSMC'er fra musen koronar omsætning; dog har vi ændret protokollen betydeligt som de isolerede også endotel cells. Andre labs har også brugt protokollen fra Teng et al. At isolere koronare arterielle myocytter og luftvejenes glatte muskelceller 4,5. Ændringerne Vi har indarbejdet vil give en population af celler stærkt beriget for VSMC fra koronar cirkulation.
Den retrograd perfusion af den isolerede pattedyr hjerte, eller Langendorff teknik, blev etableret i 1897 6 af Oscar Langendorff og er stadig i vid udstrækning anvendes i dag til isolering af hjerte-kar-celler. Teknikken præsenteres her, kombineret med udviklingen af moderne murine genetiske modifikationer, giver et værdifuldt redskab til nærmere undersøgelse af den molekylære adfærd VSMC'er fra koronar cirkulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guidelines, og det blev godkendt af institutionen Animal Care og brug Udvalg på Nationwide Børnehospital.
1. Forberedelse / Opsætning
Bemærk: Denne isolation teknik kræver to Langendorff varmespiraler anbragt side om side på en ring stativ, og forbundet parallelt med et cirkulerende vandbad.
- Slå cirkulerende vandbad og justere temperaturen at opnå en endelig temperatur på 33-34 ° C ved spidsen af Langendorff kanyle (vandbadet anvendt i denne opstilling er indstillet til 40 ° C på grund af en 6-7 ° C tab i temperatur tværs slanger). Tænd perfusionen pumper og indstille perfusionshastigheden til 0,5 ml / min.
- Rengør begge vand med kappe varmelegemer, vedhæftet slange og 25 gauge kanyle ved at skylle hver med 50 ml 70% ethanol, efterfulgt af 100 ml autoklaveret ultrarent vand.
- Ryd varmeslangerved at skubbe luft med en sprøjte og vask med 10 ml Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) uden phenolrødt. Lad HBSS i varmeslanger og slanger.
- Vedhæft en steril 10 ml luer-lock sprøjte fyldt med stuetemperatur HBSS uden phenolrødt til slangen. Sørg for, at er fanget luftbobler inde i slanger og varmelegemer, når du monterer HBSS fyldt injektionssprøjte da dette kan forårsage luft emboli under omsætningen til negativ indflydelse på VSMC isolation.
- Fjern 25 gauge kanyle fra varmeslanger og sted på en anden steril 10 ml sprøjte fyldt med iskoldt HBSS uden phenolrødt. Hold dette på is indtil klar til brug. Gentag for den anden kanyle.
- Forbered enzymfordøjelse Solution.
- Afvej collagenase type 2 ifølge specifik partinummeret i 75 ml fordøjelse løsning til at opnå en slutkoncentration på 300 enheder / ml.
- Opløs collagenase i 75 ml HBSS med phenolrødt. Dernæst tilsættes 1,5 ml 0.1 Mg / ml sojabønnetrypsininhibitor og 75 pi 1 M CaCl2 til blandingen.
- Hvis du bruger fordøjelsen opløsning umiddelbart, varme det til 37 ° C. Hvis ikke, placere den ved 4 ° C i op til 6 timer. Denne løsning skal gøres fersk dagligt.
- Forbered stop-løsning / plating medier.
- Tilsæt 100 ml varmeinaktiveret FBS, 5 ml L-glutamin, 5 ml af ikke-essentielle aminosyrer, 5 ml HEPES og 1 ml primocin til 500 ml høj glucose (4,5 g / L) DMEM. Filtersterilisering anbefales.
- Alikvot 6 ml af stopopløsning til hver af tolv 15 ml koniske rør, nummereret A1-A6 og B1-B6, og den anbringes ved 4 ° C. Portion 50 ml stop-løsning i en 50 ml konisk og sted i 37 ° C inkubator.
Bemærk: Dette trin kan også fremstilles dagen før isolering evt. Denne stop-løsning vil blive brugt som klædningen medier efter celle isolation.
- Forbered to 1 ml sprøjter udstyret med en 30 G nålmed 100 pi heparin (1.000 enheder / ml).
- Skær et 5 cm stykke 5-0 kirurgisk silke. Bind en løs overhånd knude i kirurgisk silke med en ende dobbelt så lang som den anden. Placer på 25-gauge kanyle, men ikke stramme. Gentag for de andre 25 G kanyle.
- Fyld fire 35 mm sterile petriskåle (# 1-4) med 2 ml sterilt, iskold, HBSS uden phenolrødt. Hold på is.
2. Eutanasi, Heart Isolation og Kanylering
- Før hjerte isolation, sørge for, at fordøjelsen opløsning og 50 ml konisk stopopløsning er varme. Fjern HBSS fyldt injektionssprøjte med fastgjort 25 G kanyle fra isen og sted i en burette klemme (eller ring stå klemme) på en ring stativ.
- Bedøver mus ved hjælp af 3% isofluoran. Bekræft musen bedøvet med en tå touch på hver bagben. Hvis benet ryk, er musen endnu ikke bedøvet så vente 1 min og gentag tå touch.
- Eksponere halsvenen ved at fjerne skind and hud på den forreste del af halsen med en saks. Brug derefter pincet til forsigtigt at fjerne noget fedt omkring halsvenen. Efter at have fjernet fedt, langsomt injicere 100 pi af heparin (1.000 enheder / ml). Placer en kirurgisk svamp over venen for at undgå overdreven blødning.
- Efter 1 min, til åben bryst eksponere hjerte, elevator hjerte med buede pincet og punktafgifter det ved hjælp af en saks, og sørg for at holde opstigende aorta intakt gennem den første brachiocephale gren. Anbring straks hjerte i en 35 mm skål (# 1) med iskold HBSS uden phenolrødt og skyl.
Bemærk: Udfør følgende 4 trin ved hjælp af en dissekere omfang. - Placer 25 G kanyle, der er monteret på ringen henstå ved en 45 ° vinkel, så spidsen er placeret lige under overfladen af iskold HBSS i skålen # 2 og er tydeligt gennem dissektionsmikroskop. Overfør hjertet til fadet # 2.
- Under anvendelse Dumont pincet, udsætte aorta ved forsigtigt at fjerne overskydende fedtvæv via stump dissektion til pRevent punkturdel eller rivning af aorta. Brug derefter pincet til at glide aorta over 25 G kanyle.
- Guide kanylen nedad gennem aorta, tæt på, men ikke ud over aortaklappen, som vil kompromittere integriteten af ventilen, og derfor den retrograd perfusion. Når kanylen er på plads, skal du skubbe pre-bundet silke over aorta, og stram. Bind en anden knude for at danne en knude rundt om aorta for at fastgøre hjertet.
- Når aorta er forsvarligt bundet, forsigtigt skylle resterende blod fra koronar omsætning med iskold HBSS i sprøjten fæstnet til 25 G kanyle. Vær omhyggelig med at ikke skubbe for meget til at undgå overdreven koronar pres. Kun en meget langsom og blid flush er nødvendig for at fuldføre flush. Lækage-fri aorta kanylering kan også iagttages i løbet af denne blide flush.
- Tænd perfusion pumpe til at begynde strømmen af HBSS. Fjern 25 G kanyle (med hjertet vedlagt) fra HBSS fyldt injektionssprøjte, idet manholde navet kanyle fyldt med HBSS, og slut den til de varme HBSS-fyldt varmelegemer. Begynd perfusion af hjertet med perfusionen ved en hastighed på 0,5 ml / min i 8 minutter.
- Efter den første hjerte er en kanyle og bliver perfunderet på systemet, skal du gentage trin 2,1-2,8 for den anden hjerte. Disse isolationer vil fordeles for hver hjerte derfor omhyggelig planlægning og timing er påkrævet.
3. Fordøjelse
- Efter skylning med HBSS, ændre 10 ml HBSS sprøjte øjeblikket på pumpen til en fyldt med 10 ml foropvarmet fordøjelse opløsning. Perfundere hvert hjerte med fordøjelsen opløsning i 12 minutter ved en hastighed på 0,5 ml / min. Må ikke indsamle fraktioner stammer fra denne første fordøjelse, da dette vil indeholde rest blod og endotelceller.
- Efter 12 min, ændre perfusion sats på 0,4 ml / min, placere en 15 ml konisk (rør A1 eller B1, der svarer til den første eller anden hjerte for hver fordøjelse) fyldt med kold stop-solution i en isspand under hjertet for at begynde at VSMC-beriget perfusat kollektion.
- Efter 15 min ændre samlingen konisk til rør A2 eller B2 og centrifugering konisk rør A1 og B1 ved 89 x g i 10 minutter umiddelbart efter indsamlingen af begge fraktioner. Når sprøjten fyldes med fordøjelsen løsning på pumpen har mindre end 1 ml opløsning, udskiftes med en frisk fyldt 10 ml sprøjte med fordøjelsen opløsning.
- Efter centrifugering aspireres supernatanten fra hver kollektion rør, efterlader ca. 0,5 ml. Resuspender pellet fra A1 med 2 ml varmt stopopløsning (eller plating media). Tilføj resuspension fra A1 rør til B1 rør og sted rør i 37 ° C inkubator med hætten løs.
- Gentag trin 3.3 og 3.4 indtil alle rørene (gennem A6 og B6) anvendes til en total samling tid på 90 min. Ved 80 min med fordøjelsen, skar hjertet apex til at skylle ud eventuelle celler, der kan være fanget inde i ventriklen og indsamle disse celler i rør A6 og B6, respectively.
Bemærk: lejlighedsvis hjertet falder af kanylen før 90 min tidspunkt. Hvis dette sker, hente hjerte og sted i en steril 35 mm petriskål fyldes med 2 ml fordøjelse opløsning. Skær hjertespidsen og forsigtigt skylle hjerte med fordøjelsen opløsning. Dernæst filtrere 2 ml fordøjelsen løsning gennem et sterilt 100 um celle si i en 50 ml konisk og tilføje til rør A6 eller B6. - Efter hver tur af efterfølgende rør (A2 og B2), tilsæt resuspenderede VSMC'er til den forrige samling rør (kombineret A1 og B1). Også passe på ikke at lade fordøjelsen løsning i pumpen løbe ud og skifte 10 ml sprøjter, som er nødvendige i hele fordøjelsen.
- Efter at alle rørene kombineres, centrifugeres VSMC-rige suspension ved 89 x g i 10 min.
- Aspirér så meget supernatant fra indsamling rør som muligt. Resuspender den resterende pellet i 2 ml plating medier og plade på en 35 mm dyrkningsskål. Placer kultur skål jegn 37 ° C inkubator i 24 timer.
4. Cellekultur
Bemærk: Gennemfør de resterende trin i biosikkerhed kabinet.
- Efter 24 timer, forsigtigt aspireres klædningen medier. Kulturen vil normalt have en stor mængde affald. At vaske cellerne, tilsættes 2 ml varmt, sterilt PBS og forsigtigt trykke fadet mod to fingre, mens roterer med uret.
- Efter rotation 360 °, aspireres PBS og gentage en anden gang. Aspirer PBS, og der tilsættes yderligere 2 ml sterilt, varm PBS. Kontroller kultur fad under mikroskop for at sikre, at der er lidt at ingen snavs på pladen. Cellekonfluens kan også bestemmes på dette tidspunkt.
- Hvis snavs forbliver i kulturen fad Gentag trin 4.2. Hvis kulturen parabol er fri for snavs, suge PBS, og der tilsættes 2 ml varmt plating medier.
- Efter 24 timer vaskes cellerne igen med varm, steril PBS for at fjerne enhver endelig rester eller døde celler fra kulturen. Aspirer PBS og pblonde yderligere 2 ml varmt plating medier på cellerne.
- Tjek på cellerne hver dag og fodre hver 48 timer med frisk opvarmet plating medier. På dette punkt kan celler anvendes til standard celledyrkningsassays. VSMC bør være ca. 80% konfluente 4-5 dage efter udpladning, selv kan tage op til 7 dage før proceduren er perfektioneret. Hvis opsplitning til efterfølgende passager, anvende højst 1: 4 35 mm skåle (eller til en sammenlignelig område kultur retter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grund af den hidtil ukendte aspekt af vores koronar VSMC isolation teknik, vi har forsøgt at bestemme renheden af celleisolering. Mus koronare VSMC blev identificeret baseret på deres morfologi og immunfluorescensfarvning op til passage 2. På grundlag af morfologi af cellerne i kultur efter den første vask, isoleringsproceduren fjerner effektivt hjertemyocytter og endotelceller. De VSMC bevarer deres morfologi op til passage 2 (figur 1). Men der er mulighed for kontaminering med adventitiaceller og interstitielle fibroblaster. For at udelukke dette potentielle forvirre farvede vi isolerede celler for SM22α, α-glatmuskelactin (α-SMA), både VSMC markørerne 7,8, og vimentin, en fibroblast markør 9, ved passager 1-2 (figur 2). Vi observerede ingen ændring af disse markører gennem passagen 2. Vi viser også, at vores celle isolation er blottet for CD31 / PECAM farvning (human CoronAry mikrovaskulære endotelceller, der anvendes som en positiv kontrol), hvilket indikerer den manglende endothelial kontaminering celle ved hjælp af denne isolation protokol. Kollektivt vores celle isolation fremgangsmåde giver en næsten ren population af VSMC fra koronar cirkulation og kan nu anvendes til yderligere forsøg.
Figur 1:. Repræsentative dyrkede koronar VSMC'er Dyrkede koronar VSMC (passage 2) isoleret fra heterozygote Db / db mus afbildet på 10X forstørrelse under lyse felt fase kontrast forhold. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Immunofluorescence farvning af dyrkede koronare VSMC. Belagt koronare VSMC fra heterozygote (db / db) mus ved passagerne 1-2 mærket med antistoffer for SM22α, α-SMA, vimentin, og CD31 / PECAM. Billeder taget ved 10X forstørrelse. Ingen signifikant ændring blev observeret med passage. Scale barer = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne undersøgelse var at tilpasse eksisterende celleisolering protokoller til at forøge udbyttet af koronar vaskulær glat fra murine hjerter. Det meste af pionerarbejde i vaskulær glat muskulatur biologi blev udført med dyrket rotte aorta glatte muskelceller. Disse studier forudsat grundlæggende viden om molekylære mekanismer, der styrer VSMC vækst, migration og hypertrofi 7. Men som feltet skred frem, blev det klart, at VSMC fænotype og funktion blev kontrolleret af en række vaskulære leje specifikke faktorer. For eksempel i forhold til perifere kar, kranspulsårerne vise forskellige funktionelle reaktioner, udviser tydelige mønstre af væksten i svarene til skade og vise en unik vifte af kanaler, receptorer og signalmolekyler 10,11. Den koronar seng er også udsat for unikke hæmodynamiske kræfter, da skibene komprimeres under systole den ordregivende myokardiet. Vores seneste arbejde tyder på, at coronAry mikrovaskulære remodeling i type 2 diabetes db / db mus adskilte sig fra aorta og mesenteriallymfeknuderne modstand fartøjer 1,12. For at forstå molekylære mekanismer, der tegner sig for disse forskelle, in vitro-undersøgelser ved hjælp af lave passage VSMC er nødvendige. Selv om der er en række forskellige og veletablerede fremgangsmåder til isolering og dyrkning murine aorta eller mesenteriske arterie VSMC, i øjeblikket, er der kun én undersøgelse, som er offentliggjort på isolering af VSMC fra musen koronar cirkulation 3.
I denne protokol, demonstrerer vi en forbedret metode til isolering af primære murine VSMC fra koronar cirkulation. Vores protokol er løst baseret på en publiceret af Teng et al. Tre. Ændringerne vi har anvendt på den oprindelige teknik giver en beriget population og højere udbytte af VSMC'er. De kritiske trin er nødvendige for at opnå disse resultater omfatter korrekte placering af kanylen, blide flushing af hjertet for at fjerne overskydende blod, og skære spidsen af hjertet ved afslutningen af fordøjelsen. Af de tre, placering af kanylen er af allerstørste betydning. Den koronare cirkulation perfunderes fra koronar ostier lige distalt for aortaklappen. Derfor afbrydelse af ventil integritet via kanyle indsættelse i venstre ventrikel kammeret vil føre til dårlig koronar perfusion og en dramatisk reduktion i antallet af levedygtige VSMC. Blid skylning af koronar cirkulation vil ikke kun fjerne overskydende blod fra endelige pellet, der anvendes til dyrkning, men vil også bestemme, om korrekt placering af kanylen er opnået. Endelig under fordøjelsen, nogle VSMC kan blive fanget inde i hjertekamrene, således at skære spidsen ved afslutningen af fordøjelsen vil frigive cellerne og give en større sammenløb ved plettering.
En vigtig modifikation, der kan anvendes, er anvendelsen af en 25 G gavagenål eller en Harvard Apparatus mus aorta cannulet i stedet for nålekanylen. Men når du bruger sonde nål, skal man passe ekstra godt på ikke at blokere for koronar ostier med bolden i slutningen af nålen. Den blide rødmen skridt vil afsløre, om det er nødvendigt justering af nålen før perfusion. Desuden typen af collagenase, der anvendes i fordøjelsen opløsningen er vigtig for optimal VSMC isolation. Type II collagenase er ikke ren - det indeholder andre enzymer, såsom trypsin, clostripain, og caseinase. Derfor er mængden af sojabønnetrypsininhibitor tilsættes til fordøjelse opløsning kan være nødvendigt at justere baseret på den specifikke masse collagenase anvendes i fordøjelsen.
En begrænsning ved teknikken er, at VSMC fra hele koronar cirkulation isoleres. Vores tidligere undersøgelser fokuserede på koronar mikrokar (80-120 um i diameter) 1,2, men de vigtigste koronararterier i mus er større (> 160 um) 13. Derudover denne technique isolerer også celler fra den koronare venøse cirkulation, ikke bare den arterielle cirkulation.
Mens Langendorff teknik har været anvendt i over 100 år, de nyere fremskridt i musegenomet manipulation (f.eks knock-in, knock-out, mutationer) giver en unik mulighed for at udnytte vores opdaterede teknik til en lang række anvendelser. Efter isolering og dyrkning kan cellerne anvendes til yderligere forsøg, herunder viral infektion og behandling med farmakologiske midler. Den fælles brug af genetisk modificerede mus og standard cellekultur vil give mulighed for dybere undersøgelse af VSMC'er fra murine koronar cirkulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01HL056046 til PAL og K99HL116769 til AJT), og The Research Institute ved Landsdækkende Børnehospital (til PAL og AJT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
