Summary
Hensikten med denne protokollen er å demonstrere de isolerings- og kulturteknikker av murine primære vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) fra den koronare sirkulasjon. Når VSMCs har vært isolert, kan de brukes til mange vanlige kulturteknikker.
Abstract
Mens isolasjon og kultur av vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) fra store fartøy er godt etablert, forsøkte vi å isolere og kultur VSMCs fra koronar sirkulasjon. Hjerter med intakte aorta buer ble fjernet og perfusert via retrograd Langendorff med fordøyelse løsning inneholdende 300 enheter / ml kollagenase type II, 0,1 mg / ml soyabønne-trypsininhibitor og 1 M CaCl2. De perfusates ble samlet opp ved 15 minutters intervaller i 90 minutter, pelletisert ved sentrifugering, resuspendert i pletteringsmateriale, og sådd ut på vevskulturskåler. VSMCs ble preget av tilstedeværelsen av SM22α, α-SMA, og vimentin. En av de viktigste fordelene ved å bruke denne teknikken er evnen til å isolere VSMCs fra den koronare sirkulasjon av mus. Selv om lite antall celler oppnådd kan begrense noen av de anvendelser for hvilke cellene kan anvendes, kan isolerte koronar VSMCs bli brukt i en rekke vel etablerte cellekulturteknikker og assays. Studier som undersøker VSMCs fra genmodifiserte mus kan gi nærmere opplysninger om struktur-funksjon og signalprosesser i forbindelse med vaskulære sykdommer.
Introduction
Målet med denne fremgangsmåte er å isolere vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) fra den murine koronarsirkulasjonen for bruk i cellekultur og standard cellekulturanalyser. Vi har utviklet denne teknikk for å vurdere de molekylære mekanismer for vaskulær remodellering i diabetes. Vi har tidligere rapportert innover hypertrofisk ombygging i septal koronare arterioler i db / db mus modell av diabetes 1. På grunn av den begrensede mengden vev funnet i murine septal coronaries, standard eksperimentelle teknikker undersøke proteinforandringer (f.eks western blot) i db / db og kontroll mus er vanskelig i beste fall. I tillegg har vi tidligere har vist at den angiotensin reseptorblokker (ARB) losartan reduserer ombygging observert hos db / db-mus 2. Derfor isolering av primære VSMCs fra koronarsirkulasjonen tillater oss å undersøke ytterligere endringer i VSMC fenotype eller aktiverte signalveier i diabetiske mus, som kan være bidragetting for uheldige koronar arteriole ombygging.
Tallrike studier har belyst kanoniske signalveier ved hjelp av VSMCs isolert fra gnager aorta, istedet for i hver enkelt karseng. Vi har imidlertid vist vaskulær-seng spesifikk ombygging i koronar, aorta, og mesenteriets opplag av db / db mus 1, noe som tyder på VSMCs i hvert vaskulær seng kan være forskjellig. Derfor er det nødvendig å isolere VSMCs fra hver karseng for bedre å forstå de patologiske forandringer som forekommer i hvert sett av VSMCs. Det finnes en mengde ulike metoder for isolering og dyrking av aorta VSMCs. Men for tiden er det bare en studie som har blitt publisert på isolering av VSMCs fra mus koronar sirkulasjon tre. Teng et al. var den første til å rapportere en metode for å isolere VSMCs fra mus koronar sirkulasjon; Vi har imidlertid endret protokoll vesentlig som de også isolert endothelial cells. Andre laboratorier har også brukt protokollen fra Teng et al. Å isolere koronare arterielle muskelceller og luftveis glatte muskelceller 4,5. De endringer vi har innarbeidet vil gi en populasjon av celler som hadde høy konsentrasjon for VSMCs fra den koronare sirkulasjon.
Den retrograd perfusjon av isolerte pattedyr hjertet, eller Langendorff teknikk, ble etablert i 1897 seks av Oscar Langendorff og er fortsatt mye brukt i dag for isolering av hjerte-celler. Teknikken som presenteres her, kombinert med fremme av moderne murine genetiske modifikasjoner, gir et verdifullt verktøy for nærmere undersøkelse av den molekylære oppførselen VSMCs fra koronar sirkulasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse: Denne studien ble utført i henhold til National Institutes of Health retningslinjer, og den ble godkjent av Institution Animal Care og bruk komité på Nationwide Children Hospital.
1. Forberedelse / Set opp
Merk: Denne isolasjon teknikk krever to Langendorff varmebatterier er plassert side-ved-side på en ring stativ, og forbundet i parallell med et sirkulerende vannbad.
- Slå på sirkulerende vannbad og justere temperaturen for å oppnå en slutt-temperatur på 33-34 ° C ved spissen av Langendorff kanylen (vannbadet anvendes i denne konfigurasjonen er satt til 40 ° C på grunn av en 6-7 ° C tap i temperatur over tubing). Slå på perfusjon pumper og sette perfusjon rente til 0,5 ml / min.
- Rens begge av de vannkappe, varmespoler, festet produksjonsrør og 25 gauge kanyle ved å spyle hver med 50 ml 70% etanol, etterfulgt av 100 ml ultrarent vann autoklaveres.
- Tømme varmeslyngerved å skyve luft med en sprøyte og vask med 10 ml Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) uten fenolrødt. La HBSS i varmebatteri og rør.
- Fest en steril 10 ml luer-lock sprøyte fylt med romtemperatur HBSS uten fenol rødt til slangen. Pass på at ingen luftbobler er fanget inne i slangen og varmebatterier når du fester HBSS fylte sprøyten da dette kan føre til luft emboli under fordøyelsen å negativt påvirke VSMC isolasjon.
- Fjern det 25 gauge kanyle fra varmespolene og stedet på et annet sterilt 10 ml sprøyte fylles med iskald HBSS uten fenolrødt. Ha dette på is inntil den er klar til bruk. Gjenta for den andre kanylen.
- Forbered Enzyme Fordøyelse Solution.
- Veie kollagenase type 2 i henhold til spesifikk partinummeret for 75 ml fordøyelse oppløsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 300 enheter / ml.
- Løs opp kollagenase i 75 ml HBSS med fenol rødt. Deretter legger 1,5 ml 00,1 mg / ml soyabønne-trypsininhibitor og 75 ul av 1 M CaCl 2 til blandingen.
- Ved hjelp av fordøyelse løsningen umiddelbart, kan den varmes til 37 ° C. Hvis ikke, plasserer det ved 4 ° C i opptil 6 timer. Denne løsningen må gjøres fersk daglig.
- Forbered stopp løsning / plating media.
- Legg 100 ml varme-inaktivert FBS, 5 ml L-glutamin, 5 ml, ikke-essensielle aminosyrer, 5 ml HEPES, og 1 ml av primocin til 500 ml med høy glukose (4,5 g / l) DMEM. Filter sterilisering anbefales.
- Alikvoter 6 ml stoppløsning til hver av tolv 15 ml koniske rør, nummerert A1-A6 og B1-B6, og sted ved 4 ° C. Delmengde 50 ml stopp løsning i en 50 ml konisk og plass i 37 ° C inkubator.
Merk: Dette trinnet kan også bli fremstilt dagen før isolering ved behov. Denne stop løsningen skal brukes som plating media følgende celle isolasjon.
- Forbered to 1 ml sprøyter er utstyrt med en 30 G nålmed 100 ul av heparin (1000 enheter / ml).
- Klipp et 5 cm stykke 5-0 kirurgisk silke. Binde en løs halvstikk-knute i den kirurgiske silke med en ende dobbelt så lang som den andre. Sett på 25-gauge kanyle, men ikke stram. Gjenta for den andre 25 G kanyle.
- Fyll fire 35 mm sterile petriskåler (# 1-4) med 2 ml sterilt, iskald, HBSS uten fenol rødt. Hold på is.
2. Eutanasi, Hjerte Isolasjon og Kanylering
- Før hjerte isolasjon, sørge for at fordøyelsen løsning og 50 ml konisk av stopp løsning er varme. Fjern HBSS fylt sprøyte med vedlagt 25 G kanyle fra isen og legg i en byrette klemme (eller ring stativ klemme) på en ring stand.
- Anesthetize mus bruker 3% isofluorane. Bekreft musen er bedøvet av en tå touch på hver bakfot. Dersom legg rykninger, er musen ikke ennå bedøvet så vent 1 min og gjenta tå touch.
- Expose vena jugularis ved å fjerne pelsen ennd hud på den fremre av halsen med en saks. Deretter bruker pinsett til å fjerne fett rundt halsvene nøye. Etter fjerning av fett, langsomt injisere 100 ul av heparin (1000 enheter / ml). Plasser en kirurgisk svamp over venen for å unngå overdreven blødning.
- Etter 1 min, å åpne brystet eksponere hjerte, heis hjerte med buede tang og skjære den med saks, og pass på å holde stigende aorta intakt gjennom den første brachiocephalic grenen. Umiddelbart hjerte i en 35 mm tallerken (# 1) med iskald HBSS uten fenol rødt og skyll.
Merk: Utfør følgende 4 trinn ved hjelp av en dissekere omfang. - Plasser 25 G kanyle som er montert på ringen stå i 45 ° vinkel slik at spissen er plassert like under overflaten av iskald HBSS i fatet # 2 og er klart synlig gjennom disseksjonsmikroskop. Overfør hjertet til fatet # 2.
- Ved hjelp Dumont tang, utsett aorta ved å forsiktig fjerne overflødig fettvev via stump disseksjon til pRevent punktering eller rive av aorta. Deretter bruker pinsett til å skyve aorta over 25 G kanyle.
- Guide kanylen nedover gjennom aorta, nær til, men ikke forbi aorta-ventilen, som vil kompromittere integriteten av ventilen og dermed den retrograd perfusjon. Når kanylen er på plass, skyv pre-bundet silke over aorta, og stram. Knytte en knute andre for å danne et kvadrat knute rundt aorta for å sikre hjertet.
- Når aorta er godt bundet, forsiktig skylle det resterende blod fra den koronare sirkulasjon med iskald HBSS i sprøyten er festet til 25 G kanyle. Pass på å ikke presse for mye for å unngå overdreven koronar press. Bare en svært langsom og skånsom flush er nødvendig for å fullføre flush. Lekkasjefri aorta kanylering kan også observeres i løpet av denne milde flush.
- Slå på perfusjon pumpen for å starte strømmen av HBSS. Fjern 25 G kanyle (med hjertet vedlagt) fra HBSS fylte sprøyten, ta vare åholde kanylen hub fylt med HBSS, og koble den til den varme HBSS fylte varmeslynger. Begynn perfusjon av hjertet med perfusjon pumpe ved en hastighet på 0,5 ml / min i 8 min.
- Etter den første hjerte med kanyle og blir dynket på systemet, gjenta trinn 2,1-2,8 for andre hjerte. Disse isoleringer vil bli forskjøvet for hvert hjerte derfor nøye planlegging og timing er påkrevd.
3. Fordøyelse
- Etter spyling med HBSS, endrer 10 ml HBSS sprøyte for tiden på pumpen til en fylt med 10 ml forvarmet fordøyelse løsning. Perfuse hvert hjerte med fordøyelse løsning i 12 min ved en hastighet på 0,5 ml / min. Ikke samle fraksjoner som stammer fra denne første fordøyelsen da dette vil inneholde rester av blod og endotelceller.
- Etter 12 min, endre perfusjonshastighet til 0,4 ml / min, plassere en 15 ml konisk (tube A1 eller B1, som tilsvarer den første eller andre hjerte for hver fordøyelse) fylt med kaldt stopp solution i en is bøtte under hjertet for å begynne VSMC-beriket perfusate samling.
- Etter 15 min, endrer samlingen koniske rør til A2 eller B2 og sentrifuge konisk rør A1 og B1 ved 89 xg i 10 minutter umiddelbart etter innsamling av begge fraksjoner. Når sprøyten er fylt med fordøyelsen løsning på pumpen har mindre enn 1 ml oppløsning, erstatte med en fersk fylt 10 ml sprøyte med fordøyelse oppløsning.
- Etter sentrifugering, supernatanten aspireres fra hver samling rør, slik at ca. 0,5 ml. Resuspender pellet fra A1 med 2 ml varm stopp løsning (eller plating media). Legg resuspensjon fra A1 rør til B1 rør og plasser røret i 37 ° C inkubator med hetten løs.
- Gjenta trinn 3,3 og 3,4 til alle rørene (gjennom A6 og B6) brukes for en total samling tid på 90 min. På 80 min med fordøyelsen, kutte åpne hjertet apex å skylle ut eventuelle celler som kan være fanget inne i ventrikkel og samle disse cellene i rør A6 og B6, respectively.
Merk: Av og til hjertet vil falle av kanylen før 90 min tidspunkt. Hvis dette skjer, hente hjerte og sted i en steril 35 mm petriskål fylt med 2 ml av fordøyelse oppløsning. Skjær toppen av hjertet og forsiktig skylle hjertet med fordøyelsen løsning. Deretter filtrerer 2 ml fordøyelse oppløsning gjennom en steril 100 mikrometer celle sil inn i en 50 ml konisk og tilsett til rør A6 og B6. - Etter hvert spinn av etterfølgende rør (A2 og B2), legge den resuspenderte VSMCs til forrige samling rør (kombinert A1 og B1). Også ta vare ikke å la fordøyelsen løsning i pumpen gå ut og bytte ut 10 ml sprøyter som nødvendig gjennom hele fordøyelsen.
- Etter at alle rørene er kombinert, sentrifuger VSMC rike suspensjon ved 89 xg i 10 min.
- Aspirer så mye supernatant fra innsamlingsrørene som mulig. Resuspender værende pellet i 2 ml plating media og plate på en 35 mm kultur parabolen. Place kultur fatet jegn 37 ° C inkubator i 24 timer.
4. Cell Culture
Merk: Fullfør de gjenværende trinnene i biosikkerhet kabinettet.
- Etter 24 timer, forsiktig aspirer plating media. Kulturen vil normalt ha en stor mengde avfall. Å vaske cellene, tilsett 2 ml varm, steril PBS og banke forsiktig på parabolen mot to fingre mens du roterer med urviseren.
- Etter å rotere 360 °, aspirer PBS og gjenta en gang til. Aspirer PBS og legge til en annen 2 ml sterilt, varm PBS. Sjekk kulturen fatet under mikroskop for å sørge for at det er liten eller ingen rusk på plate. Cell samløpet kan også bestemmes på dette tidspunktet.
- Hvis rusk igjen i kulturen fatet, gjenta trinn 4.2. Hvis kulturen fatet er fri for rusk, aspirer PBS og tilsett 2 ml varm plating media.
- Etter 24 timer vaskes cellene igjen med varm, steril PBS for å fjerne eventuelt endelig rusk eller døde celler fra kulturen. Aspirer PBS og psnøre ytterligere 2 ml varm plating media på cellene.
- Sjekk på cellene hver dag og mate hver 48 time med friske varmet plating media. På dette punktet, kan celler anvendes for standard cellekulturanalyser. VSMCs bør være ca 80% sammenflytende 4-5 dager etter plating, selv om det kan ta opp til 7 dager før prosedyren er fullkommen. Hvis splitting til påfølgende passasjer, bruke maksimalt 1: 4 35 mm skåler (eller en tilsvarende område av kultur retter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grunn av den nye aspekter av koronar VSMC isolasjon teknikk, søkte vi å bestemme renheten av det celleisolasjon. Muse koronare VSMCs ble identifisert på grunnlag av deres morfologi og immunfluorescens farging opp til passasje 2. Basert på morfologien av cellene i kulturen etter den første vask, fjerner isoleringsprosedyren effektivt i hjertemuskelceller og endotelceller. De VSMCs beholde sin morfologi opp til passering 2 (figur 1). Det er imidlertid en mulighet for forurensning av adventitia og mellomliggende fibroblaster. For å utelukke dette potensialet forvirre, vi farget isolerte celler for SM22α, α-glatt muskel aktin (α-SMA), markører både VSMC 7,8, og vimentin, en fibroblast markør 9, på passasjer 1-2 (figur 2). Vi observerte ingen endring av disse markørene gjennom passasjen 2. Vi viser også at vår celle isolasjon er blottet for CD31 / PECAM farging (human coronAry mikrovaskulære endotelceller anvendt som en positiv kontroll), noe som indikerer mangel på endotelcelle forurensning ved hjelp av denne isolasjonsprotokoll. Samlet gir vår celle isolasjon prosedyren en nesten ren befolkning på VSMCs fra koronar sirkulasjon og kan nå brukes for videre eksperimentering.
Figur 1:. Representative dyrkede koronar VSMCs Kulturkoronar VSMCs (passasje 2) isolert fra heterozygote db / db mus fotografert på 10X forstørrelse i sterkt felt fasekontrastforhold. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Immunofluorescence farging av dyrkede koronar VSMCs. Belagt koronar VSMCs fra heterozygot (Db / db) mus ved passasjer 1-2 merket med antistoffer for SM22α, α-SMA, vimentin, og CD31 / PECAM. Bilder tatt på 10X forstørrelse. Ingen vesentlig endring ble observert med passering. Skala barer = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hensikten med denne studien var å tilpasse eksisterende celleisolasjons protokoller for å øke utbyttet av koronar vaskulær glatt fra murine hjerter. Mesteparten av pionerarbeidet i vaskulær glatt muskulatur biologi ble utført med dyrkede rotte-aorta glatte muskelceller. Disse studiene gitt grunnleggende kunnskap om molekylære mekanismer som styrer VSMC vekst, migrasjon og hypertrofi 7. Imidlertid, ettersom feltet skred frem, ble det klart at VSMC fenotype og funksjon ble kontrollert av en rekke vaskulære bed spesifikke faktorer. For eksempel i forhold til perifere kar, koronararteriene vise ulike funksjonelle responser, utviser tydelige mønstre av vekst i respons til skade og vise et unikt utvalg av kanaler, reseptorer og signalmolekyler 10,11. Koronar Sengen er også utsatt for unike hemodynamiske krefter, ettersom skipene er komprimert under systolen av avtalen hjertemuskelen. Våre siste arbeid antyder at coronær microvascular ombygging i type 2 diabetes db / db mus skilte seg fra aorta og mesenteriets motstand fartøy 1,12. For å forstå molekylære mekanismer som står for disse forskjellene, in vitro studier med lave passage VSMCs er nødvendig. Selv om det er en rekke forskjellige og godt etablerte metoder for isolering og dyrking murine aorta eller mesenteriets blod VSMCs, for tiden, det er bare en studie som har blitt publisert på isolering av VSMCs fra musen koronar sirkulasjon tre.
I denne protokollen, viser vi en forbedret fremgangsmåte for isolering av primære murine VSMCs fra den koronare sirkulasjon. Vår protokoll er løst basert på en utgitt av Teng et al. 3. Endringene vi har søkt til den opprinnelige teknikken gi en beriket befolkning og høyere utbytte av VSMCs. De kritiske trinnene nødvendig for å oppnå disse resultatene har riktig plassering av kanylen, mild flushing av hjertet for å fjerne overskudd av blod, og kutte toppen av hjertet ved slutten av fordøyelsen. Av de tre, plassering av kanylen er av største betydning. Den koronare sirkulasjon blir perfusert fra kron ostia like distalt for aortaventilen. Derfor avbrudd av ventil integritet via kanyle settes inn i venstre ventrikkel kammeret vil føre til dårlig koronar perfusjon og en dramatisk reduksjon i antallet levedyktige VSMCs. Lett spyling av den koronare sirkulasjon vil ikke bare fjerne overskytende blod fra den endelige pellet anvendt for dyrking, men vil også bestemme om riktig plassering av kanylen er oppnådd. Til slutt, i løpet av fordøyelsen, enkelte VSMCs kan bli fanget inne i ventriklene, og dermed kutte toppunktet ved avslutningen av fordøyelse vil frigjøre celler og gir en større sammenfletting ved plettering.
En viktig modifikasjon som kan anvendes er å bruke en 25 G nål sonde eller en Harvard Apparatus mus aorta en kanyleen i stedet for nålen kanyle. Men når du bruker sonde nål, må man ta ekstra forsiktighet for ikke å blokkere koronar Ostia med ballen i enden av nålen. Den milde flushing trinnet vil avdekke om justering av nålen er nødvendig før perfusjon. I tillegg er den type kollagenase som brukes i opp-slutningsoppløsningen viktig for optimal VSMC isolasjon. Type II kollagenase er ikke ren - det inneholder andre enzymer så som trypsin, clostripain, og caseinase. Derfor er mengden av soyabønnetrypsininhibitor tilsatt til fordøyelse løsning kan trenge å bli justert på grunnlag av den spesifikke masse kollagenase benyttet i fordøyelsen.
En begrensning av teknikken er at VSMCs fra hele koronarsirkulasjonen er isolert. Våre tidligere studier fokusert på koronar microvessels (80-120 mikrometer i diameter) 1,2, men de viktigste koronararteriene hos mus er større (> 160 mikrometer) 13. I tillegg har denne technique isolerer også celler fra koronar venøs sirkulasjon, ikke bare den arterielle sirkulasjonen.
Mens Langendorff teknikken har blitt brukt i over 100 år, de nyere fremskritt av musegenomet manipulasjon (f.eks knock-in, knock-out, mutasjoner) gir en unik mulighet til å utnytte vår oppdaterte teknikk for en rekke bruksområder. Etter isolering og kultur, kan cellene bli anvendt for ytterligere forsøk inkludert viral infeksjon og behandling med farmakologiske midler. Den felles bruk av genmodifiserte mus og standard cellekultur vil gi rom for dypere undersøkelse av VSMCs fra murine koronar sirkulasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01HL056046 til PAL og K99HL116769 til AJT) og The Research Institute på Nationwide Children Hospital (til PAL og AJT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
