Summary
O objectivo deste protocolo é demonstrar as técnicas de isolamento e cultivo de células musculares murino primários liso vascular (VSMC) da circulação coronária. Uma vez que as VSMCs foram isolados, eles podem ser usados para várias técnicas de cultura convencionais.
Abstract
Embora o isolamento e cultura de células de músculo liso vascular (VSMCs) a partir dos navios de grande porte está bem estabelecida, procurou-se isolar e cultivar as VSMCs da circulação coronária. Corações com arcos aórticos intactos foram removidos e perfundidos através de Langendorff com solução de digestão retrógrada contendo 300 unidades / mL de colagenase tipo II, 0,1 mg / mL de inibidor de tripsina de soja e 1 M de CaCl2. Os perfusatos foram recolhidas a intervalos de 15 minutos durante 90 minutos, sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em meio de plaqueamento, plaqueadas e em placas de cultura de tecidos. As VSMC foram caracterizados pela presença de SM22α, α-SMA, e vimentina. Uma das principais vantagens da utilização desta técnica é a capacidade de isolar VSMCs da circulação coronária de ratos. Embora o pequeno número de células obtidas podem limitar algumas das aplicações para as quais as células podem ser utilizados, VSMCs coronárias isoladas podem ser utilizadas em uma variedade de técnicas de cultura de células bem estabelecidos e assays. Estudos investigando VSMC de camundongos geneticamente modificados pode fornecer mais informações sobre a estrutura-função e os processos de sinalização associados com patologias vasculares.
Introduction
O objectivo deste método é isolar as células musculares lisas vasculares (VSMCs) a partir da circulação coronária murino para uso em cultura de células e ensaios de cultura de células padrão. Nós desenvolvemos esta técnica para avaliar os mecanismos moleculares da remodelação vascular na diabetes. Temos relatado anteriormente para dentro remodelação hipertrófica nas arteríolas coronárias septais no modelo de camundongo db / db de diabetes 1. Devido à quantidade limitada de tecido encontrado nas coronárias septais de murino, as técnicas experimentais padrão investigaram as alterações da proteína (por exemplo, transferência de Western) em ratinhos db / db e de controlo são difíceis na melhor das hipóteses. Além disso, temos mostrado previamente que o bloqueador do receptor de angiotensina (BRA) losartan reduz a remodelação observada em ratinhos db / db 2. Por conseguinte, o isolamento de VSMCs de primários a partir da circulação coronária nos permite investigar mudanças em CMLV fenótipo ou vias de sinalização activadas em ratos diabéticos, que podem ser contriting para adversa remodelação das arteríolas coronárias.
Numerosos estudos têm elucidado vias de sinalização que utilizam canónicos VSMCs isoladas a partir da aorta de roedores, em vez de em cada leito vascular específico. No entanto, nós demonstramos vascular-cama remodelação específica em coronárias, aorta, e circulações mesentéricas de ratinhos db / db 1, sugerindo que os VSMCs em cada leito vascular pode ser diferente. Por conseguinte, é necessário isolar a partir de VSMCs de cada leito vascular, a fim de melhor compreender as alterações patológicas que ocorrem em cada conjunto de VSMC. Há uma infinidade de diferentes métodos para o isolamento e cultura de VSMCs de aorta. No entanto, actualmente, há apenas um estudo que foi publicada no isolamento de VSMCs de rato a circulação coronária 3. Teng et ai. foi o primeiro a relatar um método para o isolamento de VSMCs de rato a circulação coronária; no entanto, temos alterado o protocolo significativamente como eles também isolado cel endotelialls. Outros laboratórios também têm utilizado o protocolo de Teng et al. Isolar miócitos arteriais coronárias e das vias aéreas células musculares lisas 4,5. As alterações que tenham incorporado irá produzir uma população de células altamente enriquecidas em VSMC da circulação coronária.
A perfusão retrógrada do coração dos mamíferos isolado, ou técnica de Langendorff, foi criada em 1897, 6 por Oscar Langendorff e ainda hoje é amplamente utilizado para o isolamento de células cardiovasculares. A técnica aqui apresentada, juntamente com o avanço das modificações genéticas modernas de murino, proporciona uma valiosa ferramenta para investigação mais detalhada do comportamento molecular de VSMC da circulação coronária.
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Protocol
Declaração de Ética: Este estudo foi realizado de acordo com os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde, e foi aprovada pelo Animal Care Instituição e do Comitê Use no Hospital Infantil Nationwide.
1. Preparação / Configuração
Nota: Esta técnica de isolamento requer duas bobinas de aquecimento de Langendorff posicionados lado-a-lado sobre um suporte anelar, e ligado em paralelo a um banho de água circulante.
- Ligue banho de água circulante e ajustar a temperatura para alcançar uma temperatura final de 33-34 ° C na ponta da cânula de Langendorff (o banho de água utilizado nesta configuração é definido como 40 ° C devido a uma perda de 6-7 ° C em temperatura entre os tubos). Ligar as bombas de perfusão e definir a taxa de perfusão a 0,5 ml / min.
- Limpar ambas as bobinas de aquecimento com camisa de água, ligado tubagem 25 e de uma cânula de calibre, através de lavagem, cada um com 50 ml de etanol a 70%, seguido de 100 ml de água ultrapura esterilizada.
- Limpar as bobinas de aquecimentoempurrando o ar com uma seringa e lava-se com 10 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) sem vermelho de fenol. Deixar HBSS nas serpentinas de aquecimento e os tubos.
- Anexar uma seringa de 10 ml estéril luer preenchido com temperatura ambiente de HBSS sem vermelho de fenol para o tubo. Certifique-se que não há bolhas de ar presas no interior dos tubos e aquecimento bobinas ao anexar a seringa HBSS-cheia, pois pode provocar embolias de ar durante a digestão para impactar negativamente o isolamento VSMC.
- Remover a cânula de calibre 25 a partir das bobinas de aquecimento e em outro lugar estéril seringa de 10 ml cheia com HBSS arrefecido em gelo, sem vermelho de fenol. Tenha isso em gelo até estar pronto para usar. Repita para o outro cânula.
- Preparar solução de digestão enzimática.
- Pesar colagenase tipo 2 de acordo com o número do lote específico de 75 ml de solução de digestão para atingir uma concentração final de 300 Unidades / ml.
- Dissolve-se a colagenase em 75 ml de HBSS com vermelho de fenol. Em seguida, adicione 1,5 ml de 00,1 mg / mL de inibidor de tripsina de soja e 75 ul de 1 M de CaCl2 para a mistura.
- Se utilizar a solução de digestão imediatamente, aquecê-la a 37 ° C. Se não, coloque-o a 4 ° C durante até 6 h. Esta solução deve ser feita diariamente.
- Prepare a mídia de solução de paragem / chapeamento.
- Adicionam-se 100 ml de FBS inactivado pelo calor, 5 mL de L-glutamina, 5 ml de aminoácidos não essenciais, 5 ml de tampão HEPES, e 1 ml de primocin a 500 ml de alto teor de glucose (4,5 g / L) de DMEM. esterilização por filtração é recomendada.
- Aliquota 6 ml da solução de paragem em cada um de doze tubos de 15 mL cónico, numerados de A1-A6, B1-B6 e, e colocar a 4 ° C. Alíquota de 50 ml de solução de paragem em uma cónico de 50 ml e em lugar 37 ° C incubadora.
Nota: Este passo também pode ser preparado no dia antes do isolamento, se necessário. Esta solução de paragem irão ser utilizados como os meios de revestimento seguintes isolamento de células.
- Prepare duas seringas de 1 ml equipada com uma agulha de 30 Gcom 100 ul de heparina (1000 unidades / ml).
- Corte um pedaço de 5 cm de 5-0 seda cirúrgico. Dê um nó overhand solto na seda cirúrgico com uma extremidade duas vezes, enquanto a outra. Coloque sobre a cânula de calibre 25, mas não aperte. Repita para o outro 25 G cânula.
- Encher 35 mm quatro placas de Petri estéreis (# 1-4) com 2 ml de solução estéril, arrefecida com gelo, de HBSS sem vermelho de fenol. Manter em gelo.
2. A eutanásia, Isolamento Coração e Canulação
- Antes de isolamento coração, garantir que a solução de digestão e 50 ml cónico de solução de paragem são quentes. Retire a seringa HBSS-preenchido com anexado 25 G cânula do gelo e coloque em uma bureta grampo (ou braçadeira de suporte de anel) em um suporte de anel.
- Anestesiar ratos usando 3% isoflurano. Confirmar o mouse é anestesiado por um toque do dedo do pé em cada pata traseira. Se as contrações musculares das pernas, o mouse ainda não está anestesiado então espere 1 minuto e repita o toque do dedo do pé.
- Expor a veia jugular através da remoção do pêlo de umND pele na face anterior do pescoço com uma tesoura. Em seguida, utilize uma pinça para remover cuidadosamente qualquer gordura ao redor da veia jugular. Após a remoção de gordura, injectar-se lentamente 100 ul de heparina (1000 unidades / ml). Coloque uma esponja cirúrgica sobre a veia para evitar sangramento excessivo.
- Após 1 min, de peito aberto para expor coração, coração elevador com uma pinça curva e extirpar-lo com uma tesoura, certificando-se de manter a aorta ascendente intacta através do primeiro tronco braquiocefálico. Colocar imediatamente o coração em um prato de 35 mm (# 1) com HBSS arrefecido em gelo, sem vermelho de fenol e enxaguar.
Nota: Execute as seguintes 4 etapas usando um escopo de dissecação. - Posicionar a 25 L de uma cânula que é montado sobre o anel de suporte num ângulo de 45 °, de modo que a ponta está situada logo abaixo da superfície de HBSS arrefecido com gelo no prato # 2 e é claramente visível através do microscópio de dissecção. Transfira o coração para prato # 2.
- Utilizando uma pinça Dumont, expor a aorta, removendo suavemente o excesso de tecido adiposo através de dissecção romba para prevent de perfuração ou ruptura da aorta. Em seguida, utilize uma pinça para deslizar a aorta sobre o G cânula 25.
- Orientar a cânula para baixo através da aorta, perto, mas não além da válvula aórtica, o que irá comprometer a integridade da válvula e, portanto, a perfusão retrógrada. Uma vez que a cânula está no lugar, deslize a seda pré-amarrado sobre a aorta, e aperte. Amarrar um segundo nó para formar um nó quadrado em torno da aorta para proteger o coração.
- Uma vez que a aorta está firmemente amarrado, delicadamente lavar o sangue restante da circulação coronária com o HBSS gelada na seringa anexado ao G cânula 25. Tome cuidado para não apertar demais para evitar a pressão excessiva coronária. Apenas um flush muito lento e suave é necessária para completar o flush. o uso da aorta livre de vazamentos também pode ser observada durante este rubor suave.
- Ligar a bomba de perfusão para iniciar o fluxo de HBSS. Remover a 25 L de uma cânula (com o coração em anexo) a partir da seringa HBSS-cheia, tendo o cuidado demanter o hub cânula preenchido com HBSS, e conecte-o a quente bobinas de aquecimento HBSS-cheia. Comece a perfusão do coração com a bomba de perfusão com um caudal de 0,5 mL / min durante 8 minutos.
- Após o primeiro coração é canulada e está a ser perfundido no sistema, repita os passos de 2,1-2,8 para o segundo coração. Estes isolamentos serão escalonadas, para cada coração, portanto, planejamento e cronograma cuidadoso são necessários.
3. Digestão
- Após a lavagem com HBSS, alterar a seringa de 10 ml de HBSS actualmente na bomba para uma cheia com 10 ml de solução de digestão de pré-aquecido. Perfundir cada coração com solução de digestão durante 12 min a um caudal de 0,5 mL / min. Não coletar frações decorrentes dessa primeira digestão, pois isso irá conter todo o sangue remanescente e células endoteliais.
- Após 12 min, alterar a taxa de perfusão a 0,4 ml / min, colocar uma cónico de 15 ml (tubo de A1 ou B1, correspondente ao primeiro ou segundo coração para cada digestão) preenchido com solut paragem frioion em um balde de gelo sob o coração, a fim de iniciar a recolha de perfusato enriquecido em VSMC.
- Após 15 min, alterar a recolha cónica para A2 ou B2 e tubo de centrifugação cónico tubo A1 e B1 a 89 xg durante 10 min imediatamente após a recolha de ambas as fracções. Quando a seringa cheia com a solução de digestão na bomba tem menos do que 1 ml de solução, substitua com um recém-cheia seringa de 10 ml da solução de digestão.
- Após centrifugação, Aspirar o sobrenadante de cada tubo de recolha, deixando cerca de 0,5 ml. Ressuspender o sedimento de A1 com 2 mL de solução de paragem quente (ou meios plating). Adicionar a ressuspensão de tubo de A1 para o tubo B1 e tubo lugar no 37 ° C incubadora com a tampa solta.
- Repita os passos 3.3 e 3.4 até que todos os tubos (por meio de A6 e B6) são utilizadas para um tempo total de recolha de 90 min. A 80 min de digestão, cortar abrir o ápice coração para expulsar as células que possam estar presas dentro do ventrículo e recolher essas células em A6 tubo e B6, respectively.
Nota: Ocasionalmente, o coração irão cair da cânula antes do ponto de tempo de 90 min. Se isto ocorrer, recuperar o coração e o local em uma estéril 35 milímetros prato de Petri cheio com 2 ml de solução de digestão. Cortar o vértice do coração e lave o coração com solução de digestão. Em seguida, filtra-se os 2 ml de solução de digestão através de um filtro de 100 uM de células estéril para um cónico de 50 ml e adicionar ao tubo A6 ou B6. - Após cada rodada de tubos subsequentes (A2 e B2), adicione as VSMC ressuspensos às tubo de coleta anterior (combinado A1 e B1). Além disso, tome cuidado para não deixar a solução de digestão na bomba de correr para fora e mudar os 10 ml seringas conforme necessário durante toda a digestão.
- Depois de todos os tubos são combinados, centrifugar a suspensão rica em CMLV a 89 xg durante 10 min.
- Aspirar tanto sobrenadante dos tubos de colheita quanto possível. Ressuspender o sedimento remanescente em 2 ml de meios de comunicação e plaqueamento na placa por um prato de cultura de 35 mm. Lugar cultura prato iN incubadora C 37 ° durante 24 h.
Cultura 4. celular
Nota: Conclua as etapas restantes no gabinete de biossegurança.
- Após 24 horas, aspirar cuidadosamente a mídia chapeamento. A cultura terá normalmente uma grande quantidade de detritos. Para lavar as células, adicionar 2 ml de quente, PBS estéril e bata suavemente o prato contra dois dedos durante a rotação no sentido horário.
- Depois de rodar 360 °, aspirar o PBS e repetir uma segunda vez. Aspirar o PBS e adicionar outro 2 ml de estéril, PBS quente. Verifique a placa de cultura sob o microscópio para se certificar de que há pouca ou nenhuma restos no prato. confluência celular também pode ser determinada neste momento.
- Se os restos permanece na placa de cultura, repita o passo 4.2. Se a placa de cultura é livre de detritos, aspirar o PBS e adicionar 2 ml de mídia chapeamento quente.
- Após 24 h, lavar as células novamente com quente, PBS estéril para remover quaisquer detritos final ou células mortas da cultura. Aspirar o PBS e pate mais 2 ml de meio de plaqueamento quente sobre as células.
- Verifique sobre as células a cada dia e alimentar a cada 48 horas com a mídia chapeamento aquecido frescos. Neste ponto, as células podem ser utilizadas para ensaios de cultura de células padrão. As VSMC deve ser de aproximadamente 80% confluentes 4-5 dias após o plaqueamento, embora possa levar até 7 dias, até que o processo é aperfeiçoado. Se a divisão de passagens subsequentes, utilizar uma quantidade máxima de 1: 4 35 mm pratos (ou a uma área comparável de placas de cultura).
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Representative Results
Devido ao aspecto inovador da nossa técnica de isolamento de VSMC coronária, procurou-se determinar a pureza do isolamento de células. As VSMC coronárias de rato foram identificados com base na sua morfologia e coloração de imunofluorescência até passagem 2. Com base na morfologia das células em cultura após a primeira lavagem, o procedimento de isolamento remove eficazmente os miócitos cardíacos e células endoteliais. As VSMCs de reter a sua morfologia até passagem 2 (Figura 1). No entanto, existe a possibilidade de contaminação por fibroblastos da adventícia e intersticiais. Para descartar essa confundem potencial, manchado células isoladas para SM22α, α-actina de músculo liso (α-SMA), ambos VSMC marcadores de 7,8, e vimentina, um marcador de fibroblastos 9, em passagens 1-2 (Figura 2). Observamos nenhuma mudança desses marcadores através da passagem 2. Também mostramos que o nosso isolamento de células é desprovido de CD31 / PECAM coloração (coron humanaary células endoteliais microvasculares utilizadas como um controlo positivo), indicando a ausência de contaminação de células endoteliais utilizando este protocolo de isolamento. Colectivamente, o nosso procedimento de isolamento de células produz uma população praticamente puro de VSMC da circulação coronária e agora pode ser utilizada para posterior experimentação.
Figura 1:. VSMC coronárias cultivadas representativos VSMC cultivadas coronárias (passagem 2) isoladas de camundongos heterozigotos db / db fotografada na ampliação 10X em condições brilhantes de contraste de fase de campo. Barras de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Immunoflcoloração uorescência de VSMC coronárias cultivadas. Banhado VSMC coronárias de heterozigotos (db / db) ratinhos com passagens 1-2 marcadas com anticorpos para SM22α, α-SMA, vimentina e CD31 / PECAM. As imagens tomadas pelo aumento de 10x. Nenhuma mudança significativa foi observada com a passagem. Barras de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O objetivo deste estudo foi adaptar protocolos de isolamento de células existentes para aumentar o rendimento de vascular coronariana suave de corações de ratinho. A maior parte do trabalho pioneiro na biologia do músculo liso vascular foi realizada com células de músculo liso de aorta de rato cultivadas. Estes estudos deram conhecimento fundamental dos mecanismos moleculares que controlam o crescimento VSMC, migração e hipertrofia 7. No entanto, como o campo progrediu, tornou-se evidente que VSMC fenótipo e função foi controlado por um número de factores específicos leito vascular. Por exemplo, em comparação com vasos periféricos, artérias coronárias exibir diferentes respostas funcionais, exibem padrões distintos de crescimento em resposta à lesão e exibir um único conjunto de canais, receptores e moléculas de sinalização 10,11. A cama coronária também está exposta a forças hemodinâmicas únicos, uma vez que os navios são comprimidos durante a sístole pelo miocárdio contratação. Nosso trabalho recente sugere que coronary remodelação microvascular no tipo 2 ratos db / db diabéticos diferiam dos vasos de resistência aórtica e mesentérica 1,12. Para entender os mecanismos moleculares que são responsáveis por essas diferenças, estudos in vitro utilizando VSMC baixa passagem são necessárias. Embora haja uma variedade de diferentes e bem estabelecidos métodos para o isolamento e cultura de VSMCs aórtica ou mesentéricos de murino, actualmente, não existe apenas um estudo que foi publicada no isolamento de VSMCs de rato a partir da circulação coronária 3.
Neste protocolo, demonstramos um método aperfeiçoado para o isolamento de VSMCs de murino primários da circulação coronária. Nosso protocolo é vagamente baseado em um publicado pela Teng et al. 3. As modificações que se candidataram à técnica original proporcionar uma população enriquecida e maior rendimento de VSMC. As etapas críticas necessárias para alcançar esses resultados incluem posicionamento correto da cânula, lave suaveção do coração para remover o excesso de sangue, e o corte da ponta do coração no final da digestão. Dos três, a colocação da cânula é de extrema importância. A circulação coronária é perfundido do óstios coronários apenas distal à válvula aórtica. Portanto ruptura da integridade da válvula por meio de inserção de uma cânula para a câmara do ventrículo esquerdo irá conduzir a perfusão coronária pobre e uma redução dramática no número de VSMC viáveis. lavagem suave da circulação coronária não só irá remover o excesso de sangue a partir da pelete final utilizado para a cultura, mas também irá determinar se a colocação correcta da cânula é alcançado. Finalmente, durante a digestão, alguns VSMCs poderão ser apanhadas dentro dos ventrículos, cortando assim o vértice na conclusão da digestão irá libertar as células e produzir uma maior confluência em placas.
Uma modificação importante que pode ser utilizada é a utilização de uma agulha G 25, ou gavagem uma Harvard Apparatus aorta do rato cannuluma em lugar da cânula de agulha. No entanto, quando utilizando a agulha gavage, deve-se tomar cuidado extra para não bloquear os óstios coronários com a bola no final da agulha. A etapa de lavagem suave irá revelar se é necessário o ajuste da agulha antes da perfusão. Além disso, o tipo de colagenase usada na solução de digestão é importante para o isolamento de VSMC óptima. Colagenase de tipo II não é puro - contiver outros enzimas, tais como tripsina, clostripaína, e caseinase. Portanto, a quantidade de inibidor de tripsina de soja adicionado à solução de digestão pode precisar de ser ajustada com base no lote específico de colagenase utilizada na digestão.
Uma limitação da técnica é que VSMC de toda a circulação coronária são isoladas. Nossos estudos anteriores voltados para os microvasos coronárias (80-120 m de diâmetro) 1,2, no entanto, as principais artérias coronárias em ratos são maiores (> 160 mm) 13. Além disso, esta tecnologianique também isolados a partir de células da circulação venosa coronária, não apenas a circulação arterial.
Embora a técnica de Langendorff foi usado para mais de 100 anos, os avanços mais recentes de manipulação do mouse genoma (por exemplo knock-in, knock-out, mutações) oferecem uma oportunidade única para utilizar nossa técnica atualizada para uma ampla variedade de aplicações. Após o isolamento e a cultura, as células podem ser utilizadas para as experiências adicionais, incluindo infecção viral e tratamento com agentes farmacológicos. A utilização conjunta de camundongos geneticamente modificados e de cultura de células padrão irá permitir uma investigação mais profunda de VSMC da circulação coronária murino.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01HL056046 para PAL e K99HL116769 para AJT) e do Instituto de Pesquisa do Hospital Infantil Nationwide (para PAL e AJT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
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