Summary
Syftet med detta protokoll är att demonstrera isolerings- och odlingstekniker i murina primära vaskulära glatta muskelceller (VSMC) från kranskärlscirkulation. När VSMC har isolerats, kan de användas för många vanliga odlingstekniker.
Abstract
Medan isolering och odling av vaskulära glatta muskelceller (VSMC) från stora fartyg är väl etablerad, försökte vi isolera och kultur VSMC från kranskärlscirkulation. Hjärtan med intakta aorta valv avlägsnades och perfunderades via retrograd Langendorff med matsmältningen lösning innehållande 300 enheter / ml kollagenas typ II, 0,1 mg / ml sojaböntrypsininhibitor och 1 M CaCl2. De perfusat uppsamlades vid 15 minuters intervall under 90 min, pelleterades genom centrifugering, återsuspenderades i plating media, och ströks ut på vävnadsodlingsskålar. VSMC kännetecknades av närvaron av SM22α, α-SMA, och vimentin. En av de viktigaste fördelarna med att använda denna teknik är möjligheten att isolera VSMC från krans cirkulationen hos möss. Även ett litet antal celler erhållna kan begränsa några av de tillämpningar för vilka cellerna kan utnyttjas, kan isolerade koronar VSMC användas i en mängd olika väletablerade cellodlingstekniker och assays. Studier som undersöker VSMC från genetiskt modifierade möss kan ge ytterligare information om struktur och funktion och signal processer i samband med vaskulära patologier.
Introduction
Målet med denna metod är att isolera vaskulära glatta muskelceller (VSMC) från den murina kranskärlscirkulation för användning i cellkultur och standardcellodlingsanalyser. Vi utvecklat denna teknik för att bedöma de molekylära mekanismer för vaskulär remodellering vid diabetes. Vi har tidigare rapporterat inåt hypertrofisk remodellering i septala arteriolerna i db / db-musmodellen av diabetes 1. På grund av den begränsade mängden vävnad som finns i de murina septala kranskärlen, standard experimentella tekniker undersöker proteinförändringar (t.ex. western blot) i db / db och kontrollmöss är svårt i bästa fall. Dessutom har vi tidigare visat att angiotensin-receptorblockerare (ARB) losartan minskar remodeling observeras i db / db-möss 2. Därför isolering av primära VSMC från krans cirkulationen ger oss möjlighet att ytterligare undersöka förändringar i VSMC fenotyp eller aktiverade signalvägar i diabetiska möss, som kan vara contributing till negativa hjärt arteriole ombyggnad.
Ett flertal studier har klar kanoniska signalvägar med användning av VSMC isolerade från gnagare aorta, snarare än i varje specifik kärlbädd. Emellertid har vi visat vaskulär bädd specifik remodellering i krans, aorta, och mesenteriska cirkulationerna db / db-möss 1, vilket tyder de VSMC i varje kärlbädd kan vara olika. Därför är det nödvändigt att isolera VSMC från varje kärlbädden för att bättre förstå de patologiska förändringar som sker i varje uppsättning av VSMC. Det finns en uppsjö av olika metoder för att isolera och odla aorta VSMC. Men för närvarande finns det bara en studie som har publicerats på isoleringen av VSMC från mus kranskärlscirkulation 3. Teng et al. var först med att rapportera en metod för att isolera VSMC från mus kranskärlscirkulation; Men, har vi ändrat protokoll avsevärt eftersom de isolerade också endothelial cells. Andra laboratorier har också använt protokoll från Teng et al. Att isolera kransartärmuskelceller och luftvägarnas glatta muskelceller 4,5. Förändringarna vi har införlivat kommer att ge en population av celler höganrikat för VSMC från kranskärlscirkulation.
Den retrograd perfusion av den isolerade däggdjurs hjärta, eller Langendorff teknik, grundades 1897 6 av Oscar Langendorff och fortfarande används i stor utsträckning idag för isolering av hjärt-celler. Tekniken som presenteras här, tillsammans med utvecklingen av moderna murina genetiska modifieringar, ger ett värdefullt verktyg för närmare undersökning av den molekylära beteende VSMC från kranskärlscirkulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Studien genomfördes i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer, och det godkändes av institutionen Animal Care och användning kommittén vid Nationwide Barnsjukhus.
1. Förberedelse / Konfigurera
Notera: Denna isoleringsteknik kräver två Langendorff värmeslingor placerade sida vid sida på en ringstativ, och parallellkopplad med ett cirkulerande vattenbad.
- Slå på cirkulerande vattenbad och justera temperaturen för att uppnå en sluttemperatur av 33-34 ° C vid spetsen av Langendorff kanyl (vattenbadet som användes i detta inrättat är inställd på 40 ° C på grund av en 6-7 ° C förlust i temperatur över slangar). Slå på perfusion pumparna och ställa perfusionshastighet till 0,5 ml / min.
- Rengöra båda av värmeslingor vattenmantlade, fäst slang och 25 gauge kanyl genom att spola var och en med 50 ml 70% etanol, följt av 100 ml autoklaverat ultrarent vatten.
- Rensa värmeslingorgenom att trycka luft med en spruta och tvätta med 10 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) utan fenolrött. Låt HBSS i värmeslingor och slangar.
- Bifoga en steril 10 ml luer-lock spruta fylld med rumstemperatur HBSS utan fenolrött till slangen. Se till att inga luftbubblor fångas inuti slangen och värmeslingor när fästa HBSS-förfylld spruta eftersom det kan orsaka luftemboli under uppslutning negativt påverka VSMC isolering.
- Ta bort 25 gauge kanyl från värmeslingor och plats på en annan steril 10 ml spruta fylld med iskallt HBSS utan fenolrött. Hålla detta på is tills det ska användas. Upprepa för den andra kanylen.
- Förbered Enzymdigestion Solution.
- Väg kollagenas typ 2 enligt produktionsparti för 75 ml av matsmältningen lösning för att uppnå en slutlig koncentration av 300 enheter / ml.
- Lös kollagenas i 75 ml HBSS med fenolrött. Därefter till 1,5 ml 00,1 mg / ml sojaböntrypsininhibitor och 75 | il av 1 M CaCl2 till blandningen.
- Om du använder matsmältningen lösning omedelbart, värm till 37 ° C. Om inte, placera den vid 4 ° C i upp till sex timmar. Denna lösning måste göras färskt dagligen.
- Förbered samlad lösning / beläggning media.
- Tillsätt 100 ml värmeinaktiverat FBS, 5 ml L-glutamin, 5 ml av icke-essentiella aminosyror, 5 ml HEPES och 1 ml primocin till 500 ml hög glukos (4,5 g / L) DMEM. Filtersterilisering rekommenderas.
- Alikvotera 6 ml stopplösning i var och en av tolv 15 ml koniska rör, numrerade A1-A6 och B1-B6 och plats vid 4 ° C. Alikvotera 50 ml stopplösning till en 50 ml konisk och plats i 37 ° C inkubator.
Notera: Detta steg kan även framställas dagen före isolering om det behövs. Detta stopp lösning kommer att användas som plätering media efter cellisolering.
- Bered två 1 ml sprutor utrustade med en 30 G-nålmed 100 pl av heparin (1000 enheter / ml).
- Skär en 5 cm bit av 5-0 kirurgisk siden. Knyt en lös överhandsknop i den kirurgiska siden med en ände är dubbelt så lång som den andra. Placera på 25-gauge kanyl, men dra inte åt. Upprepa för den andra 25 G kanyl.
- Fyll fyra 35 mm sterila petriskålar (# 1-4) med 2 ml steril, iskall, HBSS utan fenolrött. Håll på is.
2. Eutanasi, hjärta Isolering och Kanyle
- Innan hjärta isolering, se till att matsmältningen lösning och 50 ml koniska stopplösning är varma. Ta bort HBSS-förfylld spruta med fastsatt 25 G kanyl från isen och lägg i en byrett klämma (eller ring stativ klämma) på en ring stativ.
- Söva möss med 3% isofluoran. Kontrollera musen bedövas av en tå touch på varje bakben. Om benet ryckningar, är musen inte ännu sövda så vänta en minut och upprepa toe touch.
- Exponera halsvenen genom att ta bort päls ennd huden på den främre av halsen med en sax. Sedan använder pincett för att försiktigt ta bort något fett som omger halsvenen. Efter att ta bort fett, och injicera långsamt 100 | il av heparin (1000 enheter / ml). Placera en kirurgisk svamp över venen för att undvika alltför stora blödningar.
- Efter en minut, för att öppna bröstet exponera hjärta, hiss hjärta med böjda pincett och skära den med en sax, och se till att hålla stigande aorta intakt genom den första brachiocephalic grenen. Placera omedelbart hjärta i en 35 mm skål (# 1) med iskall HBSS utan fenolrött och skölj.
Obs: Utför följande 4 steg med hjälp av en dissekera omfattning. - Placera 25 G kanyl som är monterad på ringen står i 45 ° vinkel så att spetsen ligger strax under ytan av iskall HBSS i skålen # 2 och syns tydligt genom dissektionsmikroskop. Överför hjärtat att skålen # 2.
- Använda Dumont pincett, exponera aorta genom att försiktigt avlägsna överskotts adipose via trubbig dissektion till pRevent punktering eller sönderslitning av aorta. Sedan använder pincett att glida aorta över 25 G kanyl.
- Guide kanylen nedåt genom aorta, nära, men inte längre än aortaklaffen, vilket kommer att äventyra integriteten i ventilen och därför retrograd perfusion. När kanylen är på plats, skjut pre-bundna siden över aorta, och dra åt. Knyt en andra knut för att bilda en råbandsknop runt aortan för att säkra hjärtat.
- När aorta är ordentligt bunden, spola försiktigt återstående blod från krans cirkulationen med iskall HBSS i sprutan fäst vid 25 G kanyl. Var noga med att inte trycka för mycket för att undvika överdriven krans tryck. Endast en mycket långsam och varsam spolning krävs för att slutföra den flush. kan också observeras läckagefritt aortakanyle under denna milda flush.
- Slå på perfusionen pumpen för att påbörja flödet av HBSS. Ta bort 25 G kanyl (med hjärtat bifogas) från HBSS-förfylld spruta, var noga med atthålla kanylen navet fylld med HBSS, och anslut den till den varma HBSS fyllda värmeslingor. Börja perfusion av hjärtat med perfusionen pumpen med en hastighet av 0,5 ml / min under 8 min.
- Efter den första hjärtkanyl och håller på att perfuseras på systemet, upprepa steg från 2,1 till 2,8 för det andra hjärtat. Dessa isoleringar ska fördelas för varje hjärta därför noggrann planering och timing krävs.
3. Digerering
- Efter spolning med HBSS, ändra 10 ml HBSS spruta för närvarande på pumpen till en fylld med 10 ml förvärmda matsmältningen lösning. BEGJUTA varje hjärta med matsmältningen lösning under 12 min vid en hastighet av 0,5 ml / min. Inte samla fraktioner som härrör från denna första uppslutning eftersom det kommer att innehålla någon kvarleva blod och endotelceller.
- Efter 12 minuter, ändra perfusion hastigheten till 0,4 ml / min, placera en 15 ml koniskt (rör A1 eller B1, som motsvarar den första eller andra hjärta för varje matsmältningen) fylld med kallt stopp solutjon i en ishink under hjärtat för att påbörja VSMC berikad perfusat samling.
- Efter 15 minuter, ändra uppsamlings koniska till röret A2 eller B2 och snurra koniska rör A1 och B1 vid 89 xg under 10 minuter omedelbart efter insamling av båda fraktioner. När sprutan fylld med matsmältningen lösningen på pumpen har mindre än 1 ml lösning, ersätta med en nyligen fylld 10 ml spruta för matsmältningen lösning.
- Efter centrifugering, aspirera supernatanten från varje provrör, med ungefär 0,5 ml. Återsuspendera pelleten från A1 med 2 ml varm stopplösning (eller plätering media). Lägg resuspension från A1 rör till B1 rör och plats röret i 37 ° C inkubator med locket löst.
- Upprepa steg 3,3 och 3,4 tills alla rören (genom A6 och B6) används för en total uppsamlingstiden för 90 min. Vid 80 min av matsmältningen, skära upp hjärtat spetsen för att spola ut alla celler som kan fångas in i kammaren och samla dessa celler i röret A6 och B6, respectively.
Obs: Ibland hjärtat kommer att falla av kanylen före det 90 min tidpunkt. Om detta inträffar, hämta hjärtat och plats i en steril 35 mm petriskål fylld med 2 ml uppslutningslösningen. Skär spetsen av hjärtat och försiktigt skölja hjärtat med matsmältningen lösning. Därefter filtrera 2 ml matsmältningen lösning genom ett sterilt 100 ìm cell sil i en 50 ml konisk och lägg till röret A6 eller B6. - Efter varje dragning av efterföljande rör (A2 och B2), tillsätt återsuspenderade VSMC till föregående provröret (kombinerad A1 och B1). Också se till att inte låta matsmältningen lösning i pumpen rinna ut och byta 10 ml sprutor som är nödvändiga för hela matsmältningen.
- När alla rören är kombinerade, centrifugera VSMC rika suspensionen vid 89 xg under 10 min.
- Aspirera så mycket supernatant från uppsamlingsrör som möjligt. Suspendera återstående pelleten i 2 ml plätering media och plattan på en 35 mm odlingsskål. Placera odlingsskål in 37 ° C inkubator i 24 timmar.
4. Cell Culture
Obs: Utför återstående stegen i biosäkerhet skåpet.
- Efter 24 timmar, försiktigt aspirera plätering media. Kulturen kommer normalt att ha en stor mängd skräp. Att tvätta cellerna, tillsätt 2 ml varm, steril PBS och knacka försiktigt skålen mot två fingrar samtidigt roterar medurs rörelse.
- Efter roterande 360 °, aspirera PBS och upprepa en andra gång. Aspirera PBS och lägga till ytterligare 2 ml steril, varm PBS. Kontrollera kulturen skålen under mikroskop för att se till att det finns liten eller ingen skräp på plattan. Cell sammanflödet kan också bestämmas vid denna tidpunkt.
- Om skräp kvar i kulturen skålen, upprepa steg 4,2. Om odlingsskålen är fritt från skräp, aspirera PBS och tillsätt 2 ml varmt plätering media.
- Efter 24 timmar, tvätta cellerna igen med varm, steril PBS för att avlägsna eventuella slutliga skräp eller döda celler från kulturen. Aspirera PBS och pspets ytterligare 2 ml varm plätering media på cellerna.
- Kontrollera på cellerna varje dag och foder var 48 timmar med färska värmt plätering media. Vid denna punkt, kan celler användas för standardcellodlingsanalyser. VSMC bör vara ca 80% sammanflytande 4-5 dagar efter plätering, men kan ta upp till 7 dagar tills förfarandet är fulländad. Om delning till efterföljande passager, använda högst 1: 4 35 mm skålar (eller ett jämförbart område i odlingsskålar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grund av den ny aspekt av vår koronar VSMC isoleringsteknik, sökte vi att bestämma renheten hos den cellisolering. Mus koronar VSMC identifierades baserat på deras morfologi och immunofluorescensfärgning upp till passagen 2. Baserat på morfologin för cellerna i odling efter den första tvätten, isoleringsförfarandet avlägsnar effektivt hjärtmyocyter och endotelceller. De VSMC behålla sin morfologi upp till passage 2 (Figur 1). Men det finns en risk för kontaminering av adventitiala och mellanrums fibroblaster. För att utesluta denna potentiella FÖRBRYLLA, färgade vi isolerade celler för SM22α, α-glattmuskelaktin (α-SMA), markörer både VSMC 7,8, och vimentin, en fibroblast markör 9, vid passager 1-2 (Figur 2). Vi observerade ingen förändring av dessa markörer genom passagen 2. Vi visar också att vår cellisolering saknar CD31 / PECAM-färgning (humant coronAry mikrovaskulära endotelceller som används som en positiv kontroll), vilket tyder på bristande endotel förorening cellen med hjälp av denna isolering protokoll. Sammantaget ger vår cell isoleringsförfarandet en nästan ren population av VSMC från kranskärlscirkulation och kan nu användas för ytterligare experiment.
Figur 1:. Representativa odlade hjärt VSMC Odlade krans VSMC (passage 2) isolerats från heterozygota Db / db-möss avbildas vid 10X förstoring under ljusa fält fas kontrastförhållanden. Skalstrecken = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Immunofluorescence färgning av odlade hjärt VSMC. Plated krans VSMC från heterozygot (Db / db) möss vid passager 1-2 märkta med antikroppar för SM22α, α-SMA, vimentin, och CD31 / PECAM. Bilder tagna vid 10X förstoring. Ingen signifikant förändring observerades med passagen. Skalstrecken = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med denna studie var att anpassa befintliga cellisoleringsprotokoll för att öka utbytet av koronar vaskulär glatt från murina hjärtan. Mest av pionjärarbete i vaskulär glatt muskulatur biologi utfördes med odlade råttaortaglattmuskelceller. Dessa studier förutsatt grundläggande kunskap om molekylära mekanismer som styr VSMC tillväxt, migration och hypertrofi 7. Eftersom området fortskred, blev det uppenbart att VSMC fenotyp och funktion kontrollerades av ett antal kärlbädd specifika faktorer. Till exempel, jämfört med perifera kärl, kransartärer visa olika funktionella svar, uppvisar distinkta mönster av tillväxt i svar på skada och visa en unik samling av kanaler, receptorer och signalmolekyler 10,11. Krans säng är också utsatt för unika hemodynamiska krafter, eftersom fartygen är komprimerade under systole den upphandlande hjärtmuskeln. Vårt senaste arbete tyder på att coronAry mikrovaskulära ombyggnad i typ 2 diabetes db / db möss skilde sig från aorta och mesenteriala motstånd fartyg 1,12. För att förstå molekylära mekanismer som står för dessa skillnader, in vitro-studier med hjälp av låga passage VSMC är nödvändiga. Även om det finns en mängd olika och väletablerade metoder för att isolera och odla murina aorta eller mesenterica VSMC närvarande finns det bara en studie som har publicerats på isoleringen av VSMC från mus kranskärlscirkulation 3.
I detta protokoll visar vi en förbättrad metod för isolering av primära murina VSMC från kranskärlscirkulation. Vår protokoll är löst baserad på en publicerad av Teng et al. 3. Modifieringarna vi har ansökt om att den ursprungliga tekniken ger en berikad befolkning och högre utbyte av VSMC. De kritiska åtgärder som krävs för att uppnå dessa resultat inkluderar korrekt placering av kanylen, mild flushning av hjärtat för att avlägsna överskott av blod, och skärning av spetsen av hjärtat vid slutet av matsmältningen. Av de tre, är placeringen av kanylen av yttersta vikt. Koronarcirkulationen perfunderas från krans ostia precis distalt aortaklaffen. Därför störning av ventil integritet via kanyl insättning i den vänstra ventrikulära kammaren kommer att leda till dålig koronar perfusion och en dramatisk minskning av antalet livsdugliga VSMC. Gentle spolning av kranskärlscirkulation kommer inte bara att avlägsna överskott av blod från den slutliga pelleten användes för odling, men kommer också att bestämma om korrekt placering av kanylen uppnås. Slutligen, under matsmältningen, vissa VSMC kan bli instängd av kamrarna, vilket sänker toppen i slutet av matsmältningen kommer att släppa cellerna och ger en större sammanflödet vid plätering.
En viktig förändring som kan användas är användningen av en 25 G sondmatning nål eller en Harvard Apparatus mus aorta cannulen på plats av nålkanylen. Men när du använder sondmatning nål, måste man ta extra noga med att inte blockera krans ostia med bollen i slutet av nålen. Den milda spolningssteget kommer att avslöja om justering av nålen är nödvändig före perfusion. Dessutom är det viktigt för optimal VSMC isolering typ av kollagenas som används i uppslutningslösningen. Typ II kollagenas är inte ren - det innehåller andra enzymer såsom trypsin, klostripain och caseinase. Därför är mängden av sojaböntrypsininhibitor sattes till uppslutningslösningen kan behöva justeras baserat på den specifika massa kollagenas utnyttjas i matsmältningen.
En begränsning av tekniken är att VSMC från hela den kranskärlscirkulation isoleras. Våra tidigare studier fokuserade på kransmikrokärl (80-120 mikrometer i diameter) 1,2, men de viktigaste kransartärer hos möss är större (> 160 nm) 13. Dessutom har denna technique isolerar också celler från krans venösa cirkulationen, inte bara den arteriella cirkulationen.
Medan Langendorff-tekniken har använts i över 100 år, de nyare framsteg i musgenomet manipulation (t.ex. knock-in, knock-out, mutationer) ger en unik möjlighet att utnyttja vår uppdaterade teknik för en mängd olika tillämpningar. Efter isolering och odling kan cellerna användas för ytterligare experiment inklusive viral infektion och behandling med farmakologiska medel. Den gemensamma användningen av genetiskt modifierade möss och standard cellodling kommer att möjliggöra djupare undersökning av VSMC från mus kranskärlscirkulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01HL056046 till PAL och K99HL116769 till AJT), och The Research Institute vid Nationwide barnsjukhus (PAL och AJT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
