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Biology

Murine कोरोनरी संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का अलगाव

Published: May 30, 2016 doi: 10.3791/53983
Automatic Translation
1,2, 2, 2, 2,3, 2,3
1School of Biomedical Science, The Ohio State University College of Medicine, 2Center for Cardiovascular and Pulmonary Research, The Research Institute at Nationwide Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के अलगाव और संस्कृति कोरोनरी परिसंचरण से murine प्राथमिक संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की तकनीक (VSMCs) का प्रदर्शन है। एक बार जब VSMCs पृथक किया गया है, वे कई मानक संस्कृति तकनीक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

जबकि अलगाव और बड़े जहाजों से संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) की संस्कृति में अच्छी तरह से स्थापित है, हम कोरोनरी परिसंचरण से अलग और संस्कृति VSMCs करने की मांग की। बरकरार महाधमनी मेहराब के साथ दिल हटा दिया है और पाचन समाधान collagenase प्रकार द्वितीय, 0.1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन trypsin अवरोध और 1 एम 2 CaCl की 300 इकाइयों / एमएल युक्त के साथ प्रतिगामी Langendorff के माध्यम से भरकर रखा गया था। perfusates 90 मिनट के लिए 15 मिनट के अंतराल, centrifugation द्वारा pelleted पर एकत्र किए गए थे, चढ़ाना मीडिया में resuspended, और टिशू कल्चर व्यंजन पर चढ़ाया। VSMCs SM22α की उपस्थिति, α-SMA, और vimentin की विशेषता थे। इस तकनीक का उपयोग करने का मुख्य लाभ में से एक चूहों के कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs को अलग-थलग करने की क्षमता है। जो आवेदन के लिए कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है कुछ सीमित कर सकते हैं प्राप्त कोशिकाओं की संख्या में छोटे, पृथक कोरोनरी VSMCs अच्छी तरह से स्थापित सेल संस्कृति तकनीक और Assa की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता हैवाई एस। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों से VSMCs की जांच के अध्ययन संरचना समारोह और संकेत संवहनी विकृतियों के साथ जुड़े प्रक्रियाओं के बारे में और अधिक जानकारी प्रदान कर सकते हैं।

Introduction

इस पद्धति का लक्ष्य सेल संस्कृति और मानक सेल संस्कृति assays में उपयोग के लिए murine कोरोनरी परिसंचरण से संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) को अलग-थलग करने के लिए है। हम मधुमेह में संवहनी remodeling के आणविक तंत्र का आकलन करने के लिए इस तकनीक को विकसित किया है। हम पहले से मधुमेह 1 की डीबी / DB माउस मॉडल में सेप्टल कोरोनरी धमनियों में hypertrophic remodeling आवक की सूचना है। Murine सेप्टल coronaries में पाया ऊतक की सीमित मात्रा के कारण, मानक प्रयोगात्मक डीबी / DB और नियंत्रण चूहों में प्रोटीन परिवर्तन (जैसे पश्चिमी धब्बा) की जांच की तकनीक पर सबसे अच्छा मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, हम पहले से पता चला है कि एंजियोटेनसिन रिसेप्टर अवरोधक (एआरबी) losartan remodeling डीबी / DB चूहों 2 में मनाया को कम कर देता है। इसलिए, कोरोनरी परिसंचरण से प्राथमिक VSMCs के अलगाव हमें आगे मधुमेह चूहों में VSMC phenotype में परिवर्तन या संकेत सक्रिय रास्ते, योगदान हो सकता है जो जांच करने के लिए अनुमति देता हैटिंग प्रतिकूल कोरोनरी धमनियों जैसे remodeling के लिए।

कई अध्ययनों से नहीं बल्कि प्रत्येक विशिष्ट संवहनी बिस्तर में से कृंतक महाधमनी, से अलग VSMCs का उपयोग कर विहित संकेत दे रास्ते elucidated है। हालांकि, हम नाड़ी-बिस्तर कोरोनरी, महाधमनी में विशिष्ट remodeling, और डीबी / DB चूहों 1 की mesenteric परिसंचरण का प्रदर्शन किया है, प्रत्येक नाड़ी बिस्तर में VSMCs सुझाव अलग हो सकता है। इसलिए, यह क्रम में बेहतर VSMCs के प्रत्येक सेट में होने वाली रोग परिवर्तन को समझने के लिए प्रत्येक नाड़ी बिस्तर से VSMCs को अलग करने के लिए आवश्यक है। अलग-थलग करने और महाधमनी VSMCs संवर्धन के लिए विभिन्न तरीकों के ढेर सारे हैं। हालांकि, वर्तमान में, वहाँ केवल एक अध्ययन है कि माउस कोरोनरी परिसंचरण 3 से VSMCs के अलगाव पर प्रकाशित किया गया है। टेंग एट अल। पहले माउस कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs अलग-थलग करने के लिए एक विधि रिपोर्ट करने के लिए किया गया था; हालांकि, हम काफी प्रोटोकॉल में संशोधन किया है वे भी endothelial सेल पृथक रूपरास। अन्य प्रयोगशालाओं भी टेंग एट अल से प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है। कोरोनरी धमनी myocytes और airway चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं 4,5 अलग करने के लिए। परिवर्तन हम शामिल किया है कोशिकाओं को अत्यधिक कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs के लिए समृद्ध की आबादी निकलेगा।

पृथक स्तनधारी दिल, या Langendorff तकनीक का प्रतिगामी छिड़काव, ऑस्कर Langendorff द्वारा 1897 6 में स्थापित किया गया था और अभी भी व्यापक रूप से हृदय की कोशिकाओं के अलगाव के लिए आज प्रयोग किया जाता है। यहाँ प्रस्तुत तकनीक, आधुनिक murine आनुवंशिक संशोधन की उन्नति के साथ मिलकर, कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs की आणविक व्यवहार के करीब जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है।

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Protocol

आचार कथन: इस अध्ययन के स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया था, और यह संस्था पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में मंजूरी दी थी।

1. तैयारी / सेट अप

नोट: यह अलगाव तकनीक दो Langendorff हीटिंग एक अंगूठी स्टैंड पर तैनात पक्ष द्वारा साइड कॉयल की आवश्यकता है, और एक परिसंचारी पानी से स्नान करने के लिए समानांतर में जुड़े।

  1. नहाने के पानी घूम चालू करें और Langendorff प्रवेशनी की नोक पर 33-34 डिग्री सेल्सियस के एक अंतिम तापमान प्राप्त करने के लिए तापमान को समायोजित (पानी इस में इस्तेमाल किया स्नान के लिए सेट 6-7 डिग्री सेल्सियस कमी की वजह से 40 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट है ट्यूबिंग भर में तापमान में)। छिड़काव पंप को चालू करें और 0.5 मिलीग्राम / मिनट के लिए छिड़काव दर निर्धारित किया है।
    1. 70% इथेनॉल के 50 मिलीलीटर, autoclaved ultrapure पानी की 100 मिलीलीटर के द्वारा पीछा के साथ प्रत्येक निस्तब्धता द्वारा पानी तख्ताबंदीवाला हीटिंग कॉयल के दोनों संलग्न ट्यूबिंग और 25 गेज प्रवेशनी साफ करें।
    2. हीटिंग कॉयल साफ़एक सिरिंज के साथ हवा धक्का द्वारा और फिनोल लाल के बिना हांक बैलेंस्ड नमक समाधान (HbSS) के 10 मिलीलीटर से धो लें। हीटिंग कॉयल और ट्यूबिंग में HBSS छोड़ दें।
    3. एक बाँझ 10 मिलीलीटर luer ताला ट्यूबिंग के लिए लाल फिनोल के बिना साथ कमरे के तापमान HBSS भरा सिरिंज संलग्न। सुनिश्चित करें कि कोई हवाई बुलबुले ट्यूबिंग और हीटिंग कॉयल के अंदर फंस रहे हैं जब HBSS से भरे सिरिंज संलग्न के रूप में इस पाचन के दौरान हवा एम्बोली कारण नकारात्मक VSMC अलगाव को प्रभावित कर सकता है।
  2. एक और बाँझ 10 मिलीलीटर फिनोल लाल के बिना ठंडा HBSS के साथ भरा सिरिंज पर हीटिंग कॉयल और जगह से 25 गेज प्रवेशनी निकालें। का उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक बर्फ पर रखें। अन्य प्रवेशनी के लिए दोहराएँ।
  3. एंजाइम पाचन समाधान तैयार है।
    1. विशिष्ट बहुत संख्या के अनुसार कोलैजिनेज़ टाइप 2 वजन पाचन समाधान के 75 मिलीलीटर 300 इकाइयों / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए।
    2. फिनोल लाल के साथ HBSS के 75 एमएल में कोलैजिनेज़ भंग। अगले, 0 के 1.5 मिलीलीटर जोड़ने.1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन trypsin अवरोध और मिश्रण करने के लिए 1 एम 2 CaCl के 75 μl।
  4. पाचन समाधान तुरंत का उपयोग करते हैं, तो 37 डिग्री सेल्सियस तक यह गर्म है। यदि नहीं, ऊपर से 6 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर जगह है। यह समाधान ताजा दैनिक बनाया जाना चाहिए।
  5. स्थान पर समाधान / चढ़ाना मीडिया तैयार करें।
    1. जोड़ें 100 मिलीलीटर उच्च ग्लूकोज (4.5 छ / एल) DMEM के 500 मिलीलीटर के लिए गर्मी निष्क्रिय FBS, primocin के एल glutamine के 5 मिलीलीटर, गैर आवश्यक अमीनो एसिड के 5 मिलीलीटर, HEPES के 5 मिलीलीटर, और 1 मिलीलीटर। फिल्टर नसबंदी की सिफारिश की है।
    2. अशेष 4 डिग्री सेल्सियस पर बारह 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में से प्रत्येक में रोकने के समाधान, गिने A1-ए 6 और बी 1-बी -6, और जगह के 6 मिलीलीटर। विभाज्य एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह में रोकने के समाधान के 50 मिलीलीटर।
      नोट: यह कदम भी यदि आवश्यक हो तो अलगाव से पहले दिन के लिए तैयार किया जा सकता है। इस स्थान पर समाधान सेल अलगाव के बाद चढ़ाना मीडिया के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
  6. एक 30 जी सुई से लैस दो 1 मिलीलीटर सीरिंज तैयारहेपरिन के 100 μl के साथ (1,000 इकाइयों / एमएल)।
  7. 5-0 शल्य रेशम की एक 5 सेमी टुकड़ा काट। एक ढीला overhand गाँठ अन्य के रूप में दो बार के रूप में लंबे समय से एक अंत के साथ शल्य रेशम में बाँधो। 25 गेज प्रवेशनी पर जगह है, लेकिन कस नहीं है। अन्य 25 जी प्रवेशनी के लिए दोहराएँ।
  8. बाँझ, ठंडा, HBSS बिना फिनोल लाल के 2 मिलीलीटर के साथ चार 35 मिमी बाँझ पेट्री डिश (# 1-4) भरें। बर्फ पर रखें।

2. इच्छामृत्यु, हार्ट अलगाव और नलिका

  1. दिल अलगाव से पहले, यह सुनिश्चित करें कि पाचन समाधान और स्टॉप समाधान के 50 मिलीलीटर शंक्वाकार गर्म कर रहे हैं। एक अंगूठी स्टैंड पर बर्फ और एक burette दबाना (या अंगूठी स्टैंड दबाना) में जगह से जुड़ी 25 जी प्रवेशनी साथ HBSS से भरे सिरिंज निकालें।
  2. 3% isofluorane का प्रयोग चूहों anesthetize। पुष्टि माउस प्रत्येक हिंद अंग पर एक पैर की अंगुली स्पर्श से anesthetized है। अगर पैर twitches, माउस अभी तक तो 1 मिनट इंतज़ार करो और पैर की अंगुली स्पर्श दोहराने anesthetized नहीं है।
  3. फर एक को हटाने के द्वारा गले नस बेनकाबकैंची के साथ गर्दन के पूर्वकाल पर एन डी त्वचा। इसके बाद, संदंश का उपयोग सावधानी से गले नस आसपास के किसी भी वसा को हटाने के लिए। वसा को हटाने के बाद, धीरे धीरे हेपरिन के 100 μl (1,000 इकाइयों / एमएल) इंजेक्षन। नस में एक शल्य चिकित्सा स्पंज की जगह अत्यधिक रक्तस्राव से बचने के लिए।
  4. 1 मिनट के बाद, खुली छाती घुमावदार संदंश के साथ दिल, लिफ्ट दिल को बेनकाब और कैंची का उपयोग यह उत्पाद शुल्क के लिए, पहली प्रगंडशीर्षी शाखा के माध्यम से बरकरार आरोही महाधमनी रखने के लिए सुनिश्चित कर रही है। इसके तत्काल बाद फिनोल के बिना एक 35 मिमी डिश में दिल की जगह ठंडा HBSS के साथ (# 1) लाल और कुल्ला।
    नोट: एक विदारक गुंजाइश का उपयोग निम्नलिखित 4 चरणों का प्रदर्शन।
  5. 25 जी प्रवेशनी कि अंगूठी पर मुहिम शुरू की है एक 45 डिग्री के कोण पर खड़े इतना है कि टिप पकवान # 2 में सिर्फ ठंडा HBSS की सतह के नीचे स्थित है और स्पष्ट रूप से विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से दिखाई जा रही है स्थिति। डिश # 2 के लिए दिल स्थानांतरण।
  6. Dumont संदंश का प्रयोग, धीरे पी को कुंद विच्छेदन के माध्यम से अतिरिक्त वसा को हटाने के द्वारा महाधमनी का पर्दाफाशrevent puncturing या महाधमनी के फाड़। इसके बाद, 25 जी प्रवेशनी खत्म महाधमनी स्लाइड करने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  7. महाधमनी के करीब है, लेकिन नहीं महाधमनी वाल्व से परे है, जो वाल्व की अखंडता समझौता होगा और इसलिए, प्रतिगामी छिड़काव के माध्यम से नीचे प्रवेशनी गाइड। एक बार जब प्रवेशनी जगह में है, महाधमनी से अधिक पूर्व बंधे रेशम स्लाइड, और कस लें। एक दूसरे गाँठ बाँध हृदय को सुरक्षित करने के महाधमनी के चारों ओर एक वर्ग गाँठ के रूप में।
  8. एक बार महाधमनी सुरक्षित रूप से जुड़ा हुआ है, धीरे सिरिंज 25 जी प्रवेशनी से जुड़ी में ठंडा HBSS के साथ कोरोनरी परिसंचरण से शेष रक्त फ्लश। बहुत ज्यादा धक्का नहीं करने के लिए अत्यधिक कोरोनरी दबाव से बचने के लिए ध्यान रखना। केवल एक बहुत ही धीमी और कोमल फ्लश फ्लश पूरा करने के लिए आवश्यक है। रिसाव से मुक्त महाधमनी केन्युलेशन भी इस कोमल फ्लश के दौरान देखा जा सकता है।
  9. छिड़काव पंप पर बारी HBSS के प्रवाह शुरू करने के लिए। 25 जी प्रवेशनी हटाये HBSS से भरे सिरिंज से (दिल संलग्न के साथ), के लिए देखभाल कर रहीप्रवेशनी HBSS के साथ भरा हब रखने के लिए, और यह गर्म HBSS से भरे हीटिंग कॉयल से कनेक्ट। 8 मिनट के लिए 0.5 मिलीग्राम / मिनट की दर से छिड़काव पंप के साथ दिल का छिड़काव शुरू करते हैं।
  10. बाद पहली बार दिल cannulated जाता है और सिस्टम पर भरकर रखा जा रहा है, फिर से दूसरे दिल के लिए 2.1-2.8 कदम। ये isolations हर दिल इसलिए सावधान योजना और समय के लिए आवश्यक हैं के लिए कंपित कर दिया जाएगा।

3. पाचन

  1. HBSS के साथ निस्तब्धता के बाद, पूर्व गर्म पाचन समाधान के 10 मिलीलीटर से भरा एक करने के लिए पंप पर वर्तमान में 10 मिलीलीटर HBSS सिरिंज बदल जाते हैं। 0.5 मिलीग्राम / मिनट की दर से 12 मिनट के लिए पाचन समाधान के साथ हर दिल छिड़कना। यह पहली पाचन से उत्पन्न अंशों जमा के रूप में यह किसी भी बचे हुए खून और endothelial कोशिकाओं में शामिल होंगे मत करो।
  2. 12 मिनट के बाद, 0.4 मिलीग्राम / मिनट के लिए छिड़काव दर बदलने के लिए, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार (ट्यूब A1 या बी 1, प्रत्येक पाचन के लिए पहले या दूसरे दिल के लिए इसी) ठंड रोक solut के साथ भरा जगहआदेश VSMC समृद्ध perfusate संग्रह शुरू करने के लिए दिल के नीचे एक बर्फ बाल्टी में आयन।
  3. 15 मिनट के बाद, तुरंत दोनों भागों के संग्रह के बाद 10 मिनट के लिए 89 XG पर ट्यूब A2 या बी 2 और स्पिन शंक्वाकार ट्यूब A1 और बी 1 के लिए संग्रह शंक्वाकार बदल जाते हैं। पंप पर पाचन समाधान के साथ भरा सिरिंज समाधान के कम से कम 1 मिलीलीटर है, जब पाचन समाधान एक हौसले से भरी 10 मिलीलीटर सिरिंज के साथ बदलें।
  4. centrifugation के बाद, प्रत्येक संग्रह ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण, लगभग 0.5 मिलीलीटर छोड़ने। गर्म स्थान पर समाधान (या चढ़ाना मीडिया) के 2 एमएल के साथ A1 से resuspend गोली। 37 डिग्री टोपी ढीला साथ सेल्सियस इनक्यूबेटर में बी 1 ट्यूब और जगह ट्यूब को A1 ट्यूब से मेजबान जोड़ें।
  5. दोहराएँ 3.3 और 3.4 सभी ट्यूबों तक कदम 90 मिनट की कुल संग्रह समय के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं (ए 6 और बी -6 के माध्यम से)। पाचन की 80 मिनट पर, ट्यूब ए 6 और बी -6, respe में इन कोशिकाओं को किसी भी कोशिकाओं है कि वेंट्रिकल के अंदर फंस जा सकता है बाहर निकलवाने और इकट्ठा करने के लिए दिल खोल सर्वोच्च कटौतीctively।
    नोट: कभी कभी दिल प्रवेशनी 90 मिनट समय बिंदु से पहले गिर जाएगा। यदि ऐसा होता है, पाचन समाधान के 2 मिलीलीटर से भरा एक बाँझ 35 मिमी पेट्री डिश में दिल और जगह निकालते हैं। दिल के शीर्ष कट और धीरे पाचन समाधान के साथ दिल कुल्ला। इसके बाद, एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में एक बाँझ 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से पाचन समाधान के 2 मिलीलीटर फिल्टर और ट्यूब A6 या बी -6 में जोड़ें।
  6. बाद में ट्यूब (A2 और बी 2) में से प्रत्येक स्पिन के बाद, पिछले संग्रह ट्यूब (संयुक्त A1 और बी 1) के लिए resuspended VSMCs जोड़ें। इसके अलावा, देखभाल पंप में पाचन समाधान बाहर चलाने के लिए और पाचन के दौरान आवश्यक के रूप में 10 मिलीलीटर सीरिंज स्विच जाने के लिए नहीं ले रहा है।
  7. बाद सभी ट्यूबों संयुक्त रहे हैं, 10 मिनट के लिए 89 XG पर VSMC युक्त निलंबन अपकेंद्रित्र।
  8. महाप्राण संभव के रूप में संग्रह ट्यूब से ज्यादा के रूप में सतह पर तैरनेवाला। एक 35 मिमी संस्कृति डिश पर मीडिया और प्लेट चढ़ाना के 2 मिलीलीटर में शेष गोली Resuspend। जगह संस्कृति डिश मैं24 घंटे के लिए एन 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर।

4. सेल संस्कृति

नोट: जैव सुरक्षा कैबिनेट में बचे हुए चरणों को पूरा करें।

  1. 24 घंटे के बाद, धीरे चढ़ाना मीडिया aspirate। संस्कृति सामान्य रूप से मलबे की एक बड़ी राशि होगा। कोशिकाओं को धोने के लिए, गर्म, बाँझ पीबीएस के 2 मिलीलीटर जोड़ने और जब तक एक घड़ी की गति में घूर्णन धीरे दो उंगलियों के खिलाफ पकवान नल।
  2. 360 डिग्री घूर्णन करने के बाद, पीबीएस aspirate और एक दूसरी बार दोहराएँ। पीबीएस Aspirate और बाँझ, गर्म पीबीएस के एक और 2 मिलीलीटर जोड़ें। खुर्दबीन के नीचे संस्कृति पकवान की जाँच यकीन है कि वहाँ प्लेट पर कोई मलबे के लिए बहुत कम है बनाना। सेल संगम भी इस समय निर्धारित किया जा सकता है।
  3. मलबे संस्कृति डिश में रहता है, 4.2 कदम दोहराएँ। संस्कृति पकवान मलबे के स्पष्ट है, तो पीबीएस aspirate और गर्म चढ़ाना मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. 24 घंटे के बाद, किसी भी अंतिम मलबे या संस्कृति से मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए गर्म, बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को फिर से धो लें। पीबीएस और पी Aspirateकोशिकाओं पर गर्म चढ़ाना मीडिया का एक और 2 मिलीलीटर फीता।
  5. हर दिन कोशिकाओं पर चेक करें और ताजा गरम चढ़ाना मीडिया के साथ हर 48 घंटा खिलाओ। इस बिंदु पर, कोशिकाओं मानक सेल संस्कृति assays के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। VSMCs, चढ़ाना के बाद लगभग 80% मिला हुआ 4-5 दिनों के लिए किया जाना चाहिए जब तक प्रक्रिया सिद्ध होता है, हालांकि 7 दिन तक का समय लग सकता है। (या संस्कृति व्यंजन का एक तुलनीय क्षेत्र के लिए) 4 35 मिमी व्यंजन: बाद में मार्ग के बंटवारे, 1 की एक अधिकतम उपयोग करते हैं।

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Representative Results

हमारे कोरोनरी VSMC अलगाव तकनीक के उपन्यास पहलू के कारण, हम सेल अलगाव की शुद्धता निर्धारित करने की मांग की। माउस कोरोनरी VSMCs पारित होने 2. पहली बार धोने के बाद संस्कृति में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान के आधार पर उनकी आकृति विज्ञान और immunofluorescence धुंधला अप के आधार पर पहचान की गई है, अलगाव की प्रक्रिया को प्रभावी ढंग से हृदय myocytes और endothelial कोशिकाओं को हटा। VSMCs पारित होने के 2 (चित्रा 1) के लिए उनकी आकृति विज्ञान बरकरार रहती है। हालांकि, वहाँ adventitial और मध्य fibroblasts द्वारा संदूषण की संभावना है। इस संभावित उलझाना शासन से बाहर करने के लिए, हम SM22α के लिए अलग कक्षों दाग, α चिकनी पेशी actin (α-SMA), दोनों VSMC 7,8, और vimentin, एक fibroblast मार्कर 9 मार्कर, मार्ग 1-2 (चित्रा 2) पर। हम पारित होने के 2 के माध्यम से इन मार्करों हम यह भी दिखाने का कोई बदलाव नहीं आया है कि हमारे सेल अलगाव CD31 से रहित है मनाया / PECAM धुंधला (मानव Coronआरे microvascular endothelial एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया कोशिकाओं), इस अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग endothelial सेल संदूषण की कमी का संकेत है। सामूहिक रूप से, हमारे सेल अलगाव प्रक्रिया कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs की एक लगभग शुद्ध आबादी पैदावार और अब आगे प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। सुसंस्कृत प्रतिनिधि कोरोनरी VSMCs संवर्धित कोरोनरी VSMCs (बीतने के 2) विषमयुग्मजी डीबी / DB उज्ज्वल क्षेत्र चरण विपरीत परिस्थितियों के तहत 10X बढ़ाई imaged चूहों से अलग। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: Immunoflसुसंस्कृत कोरोनरी VSMCs की uorescence धुंधला हो जाना। विषमयुग्मजी से कोरोनरी VSMCs चढ़ाया (DB / DB) मार्ग 1-2 SM22α, α-SMA, vimentin के लिए एंटीबॉडी के साथ लेबल पर चूहों, और CD31 / PECAM। छवियाँ 10X बढ़ाई लिया। कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन बीतने के साथ मनाया गया। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन का उद्देश्य murine दिल से चिकनी कोरोनरी संवहनी की पैदावार बढ़ाने के लिए मौजूदा सेल अलगाव प्रोटोकॉल अनुकूल करने के लिए किया गया था। संवहनी चिकनी मांसपेशियों जीव विज्ञान में अग्रणी काम के अधिकांश सुसंस्कृत चूहे महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया गया था। इन अध्ययनों से आणविक तंत्र है कि VSMC विकास, प्रवास और अतिवृद्धि 7 नियंत्रण के बुनियादी ज्ञान प्रदान किया। हालांकि, के रूप में क्षेत्र में प्रगति की है, यह स्पष्ट हो गया है कि VSMC phenotype और समारोह संवहनी बिस्तर विशिष्ट कारकों में से एक नंबर के द्वारा नियंत्रित किया गया था। उदाहरण के लिए, परिधीय वाहिकाओं की तुलना में, कोरोनरी धमनियों विभिन्न कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित चोट करने के लिए प्रतिक्रियाओं में विकास की अलग पैटर्न दिखा रहे हैं और चैनल, रिसेप्टर्स और संकेतन अणुओं 10,11 का एक अनूठा सरणी प्रदर्शित करते हैं। कोरोनरी बिस्तर भी, अद्वितीय रक्तसंचारप्रकरण बलों को उजागर कर के बाद से जहाजों करार मायोकार्डियम द्वारा प्रकुंचन के दौरान संकुचित कर रहे है। हमारे हाल ही में काम कि Coron पता चलता हैटाइप 2 मधुमेह डीबी / DB चूहों में आरे microvascular remodeling महाधमनी और mesenteric प्रतिरोध वाहिकाओं 1,12 से मतभेद था। आणविक तंत्र है कि इन मतभेदों के लिए खाते का उपयोग कर कम बीतने VSMCs जरूरी हैं इन विट्रो अध्ययन में, समझने के लिए। हालांकि वहाँ अलग-थलग करने और murine महाधमनी या mesenteric धमनी VSMCs संवर्धन के लिए अलग और अच्छी तरह से स्थापित तरीकों की एक किस्म है, वर्तमान में, वहाँ केवल एक अध्ययन है कि माउस कोरोनरी परिसंचरण 3 से VSMCs के अलगाव पर प्रकाशित किया गया है।

इस प्रोटोकॉल में, हम कोरोनरी परिसंचरण से प्राथमिक murine VSMCs के अलगाव के लिए एक बेहतर विधि का प्रदर्शन। हमारी प्रोटोकॉल शिथिल एक टेंग एट अल द्वारा प्रकाशित पर आधारित है। 3। संशोधनों हम मूल तकनीक के लिए आवेदन किया है एक समृद्ध आबादी और VSMCs की अधिक उपज प्रदान करते हैं। इन परिणामों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण कदम प्रवेशनी का सही स्थान शामिल हैं, कोमल फ्लशदिल की आईएनजी अतिरिक्त रक्त को हटाने, और पाचन के अंत में दिल के शीर्ष काटने के लिए। तीन में से प्रवेशनी की नियुक्ति को अत्यंत महत्व का है। कोरोनरी परिसंचरण कोरोनरी Ostia सिर्फ महाधमनी वाल्व के लिए बाहर से भरकर रखा जाता है। इसलिए बाएं निलय कक्ष में प्रवेशनी प्रविष्टि के माध्यम से वाल्व अखंडता के विघटन गरीब कोरोनरी छिड़काव और व्यवहार्य VSMCs की संख्या में नाटकीय कमी को बढ़ावा मिलेगा। कोरोनरी परिसंचरण की कोमल निस्तब्धता न केवल अंतिम संस्कृति के लिए इस्तेमाल गोली से अतिरिक्त रक्त निकाल देंगे, लेकिन यह भी तय करेंगे प्रवेशनी का सही स्थान हासिल किया है या नहीं। अंत में, पाचन के दौरान, कुछ VSMCs निलय के अंदर फंस बन सकता है, इस प्रकार पाचन कोशिकाओं जारी है और चढ़ाना में एक बड़ा संगम निकलेगा के समापन पर सर्वोच्च काटने।

एक महत्वपूर्ण संशोधन है कि उपयोग किया जा सकता एक 25 जी gavage सुई या एक हार्वर्ड उपकरण माउस महाधमनी cannul का इस्तेमाल होता हैसुई प्रवेशनी के स्थान पर एक। हालांकि, जब gavage सुई का प्रयोग, एक अतिरिक्त ध्यान नहीं सुई के अंत में गेंद के साथ कोरोनरी Ostia ब्लॉक करने के लिए ले लेना चाहिए। कोमल निस्तब्धता कदम प्रकट होगा अगर सुई के समायोजन छिड़काव करने से पहले आवश्यक है। इसके अलावा, कोलैजिनेज़ के प्रकार के पाचन समाधान में इस्तेमाल किया इष्टतम VSMC अलगाव के लिए महत्वपूर्ण है। प्रकार द्वितीय कोलैजिनेज़ शुद्ध नहीं है - यह एक ऐसी trypsin, clostripain, और caseinase के रूप में अन्य एंजाइमों शामिल हैं। इसलिए, सोयाबीन trypsin की राशि पाचन समाधान के लिए जोड़ा अवरोध करनेवाला पाचन में उपयोग collagenase के विशिष्ट बहुत कुछ के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।

तकनीक की एक सीमा है कि पूरे कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs अलग कर रहे हैं। हमारे पिछले कोरोनरी microvessels पर ध्यान केंद्रित अध्ययन (व्यास में 80-120 माइक्रोन) 1,2, हालांकि चूहों में मुख्य कोरोनरी धमनियों बड़ा (> 160 माइक्रोन) 13 हैं। इसके अलावा, इस तकनीकnique भी कोरोनरी शिरापरक संचलन में ही नहीं, धमनी संचलन से कोशिकाओं को अलग कर।

Langendorff तकनीक 100 से अधिक वर्षों के लिए इस्तेमाल किया गया है, माउस जीनोम में गड़बड़ी की अधिक हाल ही में प्रगति (जैसे दस्तक, नाक आउट, म्यूटेशन) आवेदनों की एक विस्तृत विविधता के लिए हमारे अद्यतन तकनीक का उपयोग करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करते हैं। अलगाव और संस्कृति के बाद, कोशिकाओं औषधीय एजेंटों के साथ वायरल संक्रमण और उपचार सहित अतिरिक्त प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों और मानक सेल संस्कृति के संयुक्त उपयोग murine कोरोनरी परिसंचरण से VSMCs की गहरी जांच के लिए अनुमति देगा।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था (R01HL056046 पाल और K99HL116769 एजेटी), और (करने के लिए पाल और एजेटी) अनुसंधान संस्थान राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल में।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum Life Technologies 16140-071
HEPES 1 M solution Fisher MT-25-060
Primocin - 20 ml Invivogen ant-pm-2
DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)  Life Technologies 11995-065
MEM NEAA 10 mM 100x Life Technologies 11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco Life Technologies 25030-081
Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh Fisher 22363549
Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm Fisher 12-565-91
Harvard Apparatus black silk suture 5-0 Fisher 14-516-124
Collagenase Type-2  Worthington Biochemical LS004176
Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg Sigma T6522
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) Life Technologies 14175-103
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) Life Technologies 14170-161
5.0 ml heating coil with degassing bubble trap Radnoti 158830
11 plus pump Harvard Apparatus 70-2208
Circulating heated water pump any brand will work

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 111 कोरोनरी परिसंचरण नाड़ी चिकनी पेशी सेल अलगाव संस्कृति माउस
Murine कोरोनरी संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का अलगाव
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Husarek, K. E., Zhang, X.,… More

Husarek, K. E., Zhang, X., McCallinhart, P. E., Lucchesi, P. A., Trask, A. J. Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells. J. Vis. Exp. (111), e53983, doi:10.3791/53983 (2016).

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